Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

Summary

Descrevemos um protocolo para monitorar a mobilidade radial de células imunes não aderentes in vitro usando um aparelho coletor/slide de sedimentação celular. A migração celular é rastreada em monocamadas de células tumorais ou em proteínas da matriz extracelular. O exame por microscopia de luz e fluorescência permite a observação da mobilidade celular e da funcionalidade citotóxica.

Abstract

Relatamos uma nova adaptação do ensaio de migração celular radial monocamada, relatada pela primeira vez para medir a migração radial das células tumorais aderentes em proteínas de matriz extracelular, para medir a motilidade das células imunitárias fluorescentemente marcado, humano ou não-aderente efectoras de murino. Esta técnica utiliza um colector de aço inoxidável e 10 bem corrediça de Teflon para focalmente depositar as células T não-aderentes preparadas em poços quer com monocamadas confluentes de células de tumor ou proteínas da matriz extracelular. Microscopia de fluorescência de luz e / ou multi-canal é usado para rastrear o movimento eo comportamento das células efetoras ao longo do tempo. Corantes fluorescentes e / ou vectores virais que codificam transgenes fluorescentes são usados ​​para marcar diferencialmente os tipos de células para a imagiologia. Este método é distinta da de tipo semelhante em ensaios in vitro que rastreiam migração horizontal ou vertical / invasão utilizando câmaras de slides, agar ou transwell placas. O ensaio permite que os dados detalhados de imagem para be coletados com diferentes tipos de células que se distinguem por marcadores fluorescentes específicos; mesmo subpopulações específicas de células (isto é, transduzidas / nontransduced) pode ser monitorizado. Superfície parcelas intensidade de fluorescência são gerados usando canais de fluorescência específicas que correspondem ao tipo de célula de migração. Isto permite uma melhor visualização da mobilidade celular imune não-aderente em momentos específicos. É possível a obtenção de provas de outras funções das células efectoras, tais como citotoxicidade ou a transferência de vectores virais a partir de células de efector para alvo, bem como. Assim, o método permite que os investigadores microscopicamente documentar célula-a-célula interacções de diferencialmente marcado, não-aderente com células aderentes de vários tipos. Tais informações podem ser especialmente relevante na avaliação dos tipos de células do sistema imunológico biologicamente manipulados ou ativados, onde a prova visual de funcionalidade é desejados com células-alvo tumor antes de sua utilização para a terapia do câncer.

Introduction

O ensaio de migração celular radial monocamada foi originalmente desenvolvido para medir as propriedades infiltrativas de células tumorais aderentes ^1-4 em lâminas revestidas com matriz extracelular (ECM) ^5-7 proteínas ou com componentes de ECM individuais, tais como fibronectina ou laminina ^1,2. A técnica de semeadura envolvida uma única suspensão celular de células de tumor no centro de poços, utilizando um colector de células de sedimentação aço inoxidável (CSM). Após a sedimentação, as células tumorais se aderir ao fundo do poço e a mudança no diâmetro da população inicial de células ao longo do tempo foi usada para estabelecer uma taxa de motilidade horizontal. O ensaio de migração celular Radial Monolayer proporcionaram uma vantagem visual sobre outros métodos existentes que empregavam transwell placas de ensaio in vitro os recursos migratórios de células; estes ensaios não são propícias à geração de imagens ^8. Como assim, ele também forneceu uma grande quantidade de liberdade na escolha do timepointé quando a migração é avaliada, sem limite do número de pontos no tempo um pesquisador pode optar por imagem após a sedimentação.

Porque a capacidade de migrar é uma funcionalidade importante para as células não aderentes, em especial na área da imunoterapia ou onde eles podem ser utilizados como veículos de administração para os vectores virais, nós adaptamos o uso do MCS para avaliar a migração de células não-aderentes tipos sobre monocamadas de células de tumor, além das proteínas de ECM. O benefício adicional de microscopicamente visualizando a migração de células não-aderentes em monocamadas de células tumorais viáveis, em ECM complexo isolado a partir do tumor, ou sobre os componentes da ECM individuais torna este ensaio versátil. Os ensaios que utilizam poços revestidos com uma única proteína extracelular não refletem exatamente o substrato tecido ECM ou tumor das células que migram através in vivo.

Aqui, usamos alorreativas linfócitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a major histocompcomplexo atibility (MHC) proteínas utilizando reacções unidireccional mista de linfócitos de células de tumor (MLTR) ou reacções de linfócitos mistos (MLR) ^9, como o nosso tipo de células não-aderentes representativo. Testamos células de origem humana e murina. Quando a migração foi medida em monocamadas de tumor, as células tumorais utilizadas foram alvos ou parcialmente relevantes, exibindo algumas das mesmas proteínas MHC encontrados na população de células usadas para sensibilizar as efetoras, ou alvos totalmente pertinentes, com um conjunto completo de moléculas MHC que o efetores foram sensibilizados no sentido. Em algumas experiências, foi utilizado CellTracker fluorescente vermelha CMPTX ou corante proliferação celular eFluor 670 para diferenciar entre células efectoras e alvo. Utilizou-se também a transdução com vectores virais para codificação de proteínas fluorescentes como uma forma adicional de visualizar as células. Para certos ensaios, nós transduced o alloCTL com vetores retrovirais replicantes (RRV) que codificam para o verde esmeralda (EMD) proteína fluorescente ^10,11; para others, as células tumorais foram transduzidas com vectores lentivirais que codificam para mStrawberry.

O alloCTL foram semeadas por meio de um canal do colector para o centro de qualquer monocamadas de células tumorais ou de ECM colhidas a partir de monocamadas de células de tumor. Interacções de células aderentes e não aderentes foram visualizadas por luz e / ou por microscopia de fluorescência ao longo do tempo. Perturbação na monocamada de células tumorais em baixa potência, ou tumorais células com núcleos fragmentados em alta potência foram indicadores de lesão celular por lise e apoptose, respectivamente. Nós digitalmente criados mapas de intensidade fluorescente superfície que mostram a migração de células fluorescentes T não aderentes sobre as culturas em monocamada. Observamos, também, a citotoxicidade engendrado para a monocamada de células de glioma aderente após a formação do cluster do alloCTL não aderente sobreposta. Assim, foi observada a transdução horizontal de RRV-EMD do alloCTL à monocamada de glioma.

Protocol

1. Deslize Preparação

1. Insira os slides Manifold sedimentação celular em bolsas de esterilização e selar com fita crepe. Vire o lado revestido de Teflon da corrediça do lado do papel a da bolsa para evitar depósitos de plástico nos poços.
2. Bolsas de autoclave durante 15 min a 121 ° C.
3. Remover slide da bolsa de esterilização dentro de uma cabine de segurança biológica e coloque em um estéril 150 x 15 mm estéril placa de Petri. Até quatro lâminas pode caber por prato. Coloque um 35 x 10 mm placa de Petri ao lado dos slides. Adicionar 2-3 ml de H ₂ O estéril para proporcionar humidificação.
4. Lâminas pré-revestimento com poli-D-lisina a 100 mg / ml usando um volume suficiente para cobrir a totalidade bem. Depois de uma hora, à temperatura ambiente, aspirar a solução e lavar a superfície do poço duas vezes por pipetagem de 1x PBS sobre a superfície dos poços.
5. Opcionalmente, adiciona fibronectina ou outros componentes da matriz extracelular para assegurar uma maior aderência das células do tumor. Adicionar fibronectina a 5 jig / ml em volumes suficientes that os poços não seca dentro de um curto período de tempo à temperatura ambiente.
   1. Após 1 hora, aspirar a solução de sobra e lavar duas vezes por pipetagem cima e para baixo com 1x PBS.
6. Manter PBS aos poços até tumor está pronto para a galvanização. Uso desliza no mesmo dia.
7. Colheita de um balão confluente do tipo de células de tumor aderentes desejado. Contagem de células viáveis ​​usando corante Trypan Blue exclusão por microscopia de luz e ressuspender em 5 x 10 ⁶ células / ml em meio de crescimento, por exemplo adequadamente tamponada, meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), L glutamina e piruvato de sódio.
8. Se imagiologia de fluorescência da população de células aderentes se desejado, rotular a população de células aderentes com um corante fluorescente ou um corante vital proliferação de células, seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante.
9. Suavemente pipeta 10 ul de meio completo em cada cavidade da lâmina, tendo o cuidado de evitar a criação de bolhas na microcavidadels, pois estes podem impedir a adesão de células tumorais uniforme.
10. Adicionar 2,5-5,0 x 10 ⁴ células (5-10 ul de suspensão de células) para o meio em cada poço (Figura 1A). Ajustar o número óptimo dependendo do tipo de célula de tumor e o número de dias de crescimento desejados. Células tumorais maiores ou com células em crescimento rápido pode exigir menor quantidade de células inicialmente. Traga bem volume de até 40 mL, adicionando médio e pipeta cima e para baixo para assegurar uma distribuição uniforme das células.
11. Depois de todas as cavidades são semeadas, permitir que as células tumorais a aderir à TA, em seguida, colocar a tampa na de 150 x 15 mm numa caixa de Petri e cuidadosamente mover o prato para uma incubadora humidificada a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante pelo menos 24 horas.
12. Alterar o meio de cultura diária. Pipetagem cuidadosa de uma porção do meio gasto a partir da monocamada e substitua com meio completo fresco.
    NOTA: Por causa da evaporação, mais volume terá de ser adicionado do que foi retirado. Wells estará pronto para o ensaio quando um mesmo, conflefluente camada de células está presente. Este é tipicamente de 1-3 dias após a sementeira inicial.
13. Lavar monocamada suavemente uma vez com PBS como descrito no passo 1.4 e prosseguir para a etapa 2, se monocamadas são desejados, ou para o passo 1.13 abaixo para extrair proteínas da MEC da monocamada.
14. Adicione uma solução de 0,5% de Triton-X (v / v) em meio completo e adicionar 30 ul a cada poço. Deixe monocamada digerir na capa durante 2 min, em seguida, lavar duas vezes com meio completo por pipetagem como descrito acima.
    NOTA: A camada de ECM podem ser visíveis por microscopia de luz (Figura 2). Use os slides imediatamente, ou manter-se em meio completo no umidificado incubadora de CO ₂ por 1-2 dias. Não permitir que os poços para secar.

2. A sedimentação de células T não aderentes Onto Deslize

1. Se imagiologia de fluorescência da população de células não aderentes for desejado, rotular as populações de células não aderentes com um corante fluorescente vitais, tais como CFSE, Cell Rastreio Vermelho CMPTX, ou eFluor670, seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante, pelo menos, 1 hora antes do ensaio. Alternativamente, manipular as células para expressar proteínas fluorescentes codificados por vectores virais.
2. Autoclave o colector de sedimentação de células numa bolsa de autoclave tal como descrito no ponto 1.2 acima.
3. Retire a câmara úmida contendo lâminas revestidas de Teflon da incubadora e lugar na cabine de segurança biológica.
4. Lave os poços com PBS 1x por pipetagem cima e para baixo, em seguida, adicione 45 mL de meio completo, contendo pelo menos 10% de soro.
5. Remover o colector do envelope de esterilização e cuidadosamente deslizar ao longo dos poços até o 'gancho' no final do colector toca o fundo da corrediça (Figura 1B).
6. Certifique-se de que o meio de cultura é visível em cada um dos canais. Se nenhum for visto, tirar o colector e adicionar mais meio para o correspondente bem, em seguida, substituir e verificar novamente.
7. Repita o passo 2,5 para cada channel do colector, ou para o maior número de poços, como desejado.
8. Contagem de células não-aderentes e ressuspender em não menos do que 1,0-2,0 x 10 ⁵ / ul. Desenha-se 1 ml de células e pipeta-los lentamente no interior do canal (Figura 1C). Faça isso para cada bem desejar.
9. Deixar todo o aparelho carregado de células, isto é, o colector e corrediça, no interior da bio-capuz durante 20-30 minutos para permitir que as células do canal para assentar.
10. Remover o colector tocando ambas as extremidades e suavemente levantando-o da lâmina de modo a não perturbar as células semeadas focal no centro das cavidades (Figura 1D).
11. Inspeccionar cada poço para assegurar que as células não aderentes foram semeados com sucesso no centro do poço ficar dentro da circunferência do canal colector. As células não aderentes irá aderir idealmente ligeiramente à monocamada ou ECM e uns com os outros, por conseguinte, se mover ligeiramente as lâminas em torno não fará com que a célula Pellet para dispersar. Não disputam o slide.

3. Microscopia de Fluorescência

1. Com um equipamento experimental adequado, realizar a imagem após a sedimentação é confirmado. Idealmente, usar um microscópio que está equipado com uma câmara de _CO2 e humidade. Imagem com baixa potência, ou seja, 4X ou 10X, para permitir imagens múltiplas para ser tomado de uma área maior, de modo que a totalidade do bem pode ser visto.
2. Aquisição de imagens digitais usando software de captura de imagem. Realizar campo claro e / ou multi-canal de imagens por fluorescência.
3. Se desejar, configure um lapso de tempo para gravar imagens em diferentes canais sobre uma determinada área, ou manter o slide umidificado e em uma temperatura de 37 ° C / 5% de _CO2 e manualmente tirar a imagem nos momentos desejados (Figura 1E & F, recomendado para pontos de tempo mais longos).

4. Análise e Visualização

1. Usando software de edição de imagem, luz e fl mesclaruorescent imagens em uma camada de modo a vários tipos de células e de marcadores pode ser visto na mesma imagem. Arraste e solte os arquivos de imagem para cada cor individual para o programa e, quando solicitado, selecione a opção "Add Layer" para criar um arquivo de imagem com várias camadas.
   1. Na maior ampliação, tome, alinhar e costurar as imagens de todo o bem digitalmente. Alinhar arquivos por olhando para regiões conservadas entre as duas imagens e sobrepondo uma imagem em cima da outra, até que um quadro completo é gerado.
2. Adicionar bares mícron de imagens durante a aquisição utilizando o software de captura para determinar a distância células individuais têm migrado.
3. Para determinar a migração de células em vários momentos, fazer mapas de intensidade de fluorescência superfície com software de imagem, ou seja, ImageJ, para quantificar a agregação de células T fluorescente ou espalhar ao longo do tempo.
   1. Para gerar terrenos de superfície, dê uma imagem em camadas gerado na etapa 4.1 e sob a janela Layers,desmarque todas as camadas, exceto aqueles correspondentes ao canal desejado. Por exemplo, se uma parcela de superfície é desejada para visualizar a expressão de EMD, apenas as camadas "verdes" correspondentes ao filtro usado para este marcador deve ser visível.
   2. Achatar a imagem e salvá-lo em um formato de arquivo reconhecido (por exemplo, .png) e carregar a imagem no programa. Para gerar a plotagem de superfície, altere o tipo de imagem para 8 bits, alterar o brilho / contraste conforme necessário para reduzir o fundo, e selecione a opção "Analisar / Surface Plot '. As imagens na Figura 5 foram geradas, verificando o "Sombra", "Desenhe Axis ',' One Polygon Per Line ', e caixas de seleção' Smooth '.
   3. Em alternativa, tomar medidas utilizando o raio ou o diâmetro do depósito celular focal no tempo zero e comparar com as células no ponto mais externo em momentos diferentes. O diâmetro do Teflon poços é de 6,0 mm.

Results

Os vectores virais que codificam para as proteínas fluorescentes pode ser utilizada em adição a, ou em vez de, corante fluorescente. Transdução virai deve ser executada antes do ensaio de motilidade. Ambos os tipos de células aderentes e não aderentes podem ser diferencialmente marcado. O protocolo para a transdução vai depender do tipo de vector utilizado. Aqui, nós transduced o alloCTL nas Figuras 3, 5 e 6 com RRV-EMD, pelo menos, dois dias antes do ensaio utilizando o protocolo descr...

Discussion

As células tumorais em uma única suspensão de células foram pipetadas para os poços de uma lâmina de Teflon-mascarado. As células foram deixadas aderir e, em seguida, formado monocamadas numa atmosfera humidificada com 5% de _CO2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocamadas estabelecidas ou proteínas da MEC derivados de monocamada podiam ser colhidas para estes ensaios (Figura 1B). Linfócitos T efectoras marcadas com corantes fluorescentes vitais ou transduzidas com vectores qu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lâminas de microscópio mascaradas de teflon	Creative Scientific Methods	CSM002
Coletor de sedimentação celular	Creative Scientific Methods	CSM001
de Petri 430597		Corning	de 150 mm
430588		Corning	35 mm
(PBS)	Mediatech	21-040
20 μ l Pipetman	Gilson	F123600
200 μ l Pipetman	Gilson	F123601
200 μ l ponteiras de pipeta	VWR	89003-060
Água destilada e desionizada (estéril)	Mediatech	25-055
Tripsina	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (opcional)	Gibco	12604
Meios de cultura de células tumorais (e.g. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V mídia sem soro	Invitrogen	12055-083
Soro Bovino Fetal	Omega Scientific	FB-02
Microscópio
SPOT Instrumentos			de Diagnóstico
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
Fibronectina	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience		65-0840-85
ImageJ	NIH