Rat heterotópico abdominal coração / pulmão Transplante Single-carregado em uma configuração-Volume

Resumo

Descrevemos uma nova técnica para transplante coração-pulmão abdominal heterotópico (HAHLT) em ratos. A configuração do transplante resulta em uma circulação do enxerto parcialmente carregada, permitindo avaliação funcional direta. Esse modelo pode ser empregado para estudos agudos ou crônicos de função e estado imunológico do enxerto transplantado.

Resumo

Aqui, descrevemos uma nova técnica para transplante coração-pulmão abdominal heterotópico (HAHLT) em ratos. A configuração do enxerto de transplante envolve anastomose da veia cava inferior (VCI) do doador à VCI do receptor e da aorta ascendente do doador (Ao) à Ao abdominal do receptor. Os lobos pulmonares superiores e médios direitos são preservados e funcionam como canais para o fluxo sanguíneo do coração direito para o coração esquerdo.

Existem várias vantagens em usar essa técnica e ela se presta a uma ampla gama de aplicações. Como o enxerto é transplantado em uma configuração que permite a carga de volume diâmico, a função cardíaca pode ser avaliada diretamente in vivo. O uso de cateteres de condutância pressão-volume permite a caracterização de parâmetros hemodinâmicos dependentes e independentes de carga. O enxerto pode ser convertido em uma configuração carregada aplicando uma pinça na VCI infra-hepática do receptor. Descrevemos técnicas cirúrgicas modificadas para operações de doador e receptor e uma estratégia ideal de proteção miocárdica. Dependendo do objetivo experimental, esse modelo pode ser adaptado para uso em estudos agudos e crônicos de função do enxerto, estado imunológico e condições variáveis de carga ventricular. As vias aéreas condutoras para o pulmão transplantado são preservadas e permitem a reventilação pulmonar aguda. Isso facilita a análise dos efeitos do sangue venoso e arterial misto que fornece perfusão coronariana ao enxerto.

Uma limitação deste modelo é sua complexidade técnica. Há uma curva de aprendizado significativa para novos operadores, que idealmente devem ser orientados na técnica. Um histórico de treinamento cirúrgico é vantajoso para aqueles que desejam aplicar este modelo. Apesar de sua complexidade, pretendemos apresentar o modelo em um formato claro e de fácil aplicação. Devido à semelhança fisiológica desse modelo com o transplante ortotópico e sua ampla gama de aplicações de estudo, o esforço investido no aprendizado da técnica provavelmente valerá a pena.

Introdução

O primeiro modelo de roedor de transplante cardíaco abdominal heterotópico (HAHT) foi descrito por Abbott e colegas em 1964¹. Essa técnica e as modificações subsequentes têm sido amplamente aplicadas para caracterizar a função e o estado imunológico do enxerto de transplante. A maioria das técnicas de HAHT descritas envolve um coração sem volume^2,3. Modelos de HAHT envolvendo ventrículos carregados por volume foram descritos, mas são frequentemente limitados em um ou mais aspectos.

O transplante coração-pulmão abdominal heterotópico (HAHLT) com ventrículo esquerdo (VE) carregado a volume foi descrito anteriormente. Chen e colegas⁴ e, posteriormente, Ibrahim e colegas⁵ descreveram HAHLT com uma única anastomose aorto-aórtica (doador ascendendo à aorta abdominal receptora). A única carga volumétrica apresentada ao ventrículo nessa circulação é o retorno venoso coronariano. Asfour e colaboradores descreveram uma técnica HAHT na qual o circuito pulmonar foi eliminado pela anastomosagem da artéria pulmonar (AP) do doador com o átrio esquerdo do doador (AE)⁶. Nessa circulação, o influxo venoso para o ventrículo direito (VD) ocorre por meio de uma VCS doadora para a anastomose da VCI receptora, e a carga subsequente do VE é ejetada para a anastomose aorto-aórtica. A função cardíaca foi parcialmente avaliada in vivo e também in vitro usando um equipamento de Langendorff. Figueiredo e colegas descreveram um modelo HAHLT semelhante ao nosso^{próprio 7}, mas em camundongos. O influxo venoso para o VD ocorre via VCS do doador para a anastomose da VCI do receptor. O sangue passa subsequentemente pela circulação pulmonar única e a carga do VE é ejetada para a anastomose aorto-aórtica. A função cardíaca em seu estudo foi avaliada por ressonância magnética (MRI). Wen e colegas descreveram uma técnica única de HAHT na qual o VE é carregado por meio de uma aorta receptora para a anastomose do AE^{doador 8}. O VE, portanto, se enche a pressões sistêmicas. A função cardíaca e se o volume sistólico do VE é ejetado anterógrada em seu modelo não foram avaliados.

Muitas das técnicas mencionadas acima envolvem condições de carga não fisiológicas do VE, incluindo as técnicas cuja carga parcial do VE é representada apenas pelo retorno venoso coronário. Por outro lado, muitas técnicas abordam a carga fisiológica do VE. A maioria dessas técnicas, como a técnica de Asfour e colegas, omite a circulação pulmonar e utiliza um PA doador para anastomose do AE^{doador 6,9}. A circulação descrita por Galinanes e^cols.10 emprega uma cava receptora direta para anastomose do AE doador, omitindo a circulação pulmonar e o coração direito. Yokoyama e colegas alcançam o mesmo efeito ligando o PA do doador e criando uma comunicação interatrial no coração do doador (omitindo as circulações pulmonar e cardíaca direita do doador)¹¹. A circulação de Maruyama e^cols.12 envolve uma anastomose entre o PA esquerdo do doador e o receptor Ao, que permite o enchimento do VE através da circulação pulmonar como um conduto, mas efetivamente exclui o coração direito.

Nos casos em que as condições de carga fisiológicas próximas foram atendidas, avançamos a técnica de HAHLT em 2 aspectos principais. Primeiro, até onde sabemos, a configuração exata que relatamos não foi descrita em ratos. É possivelmente a circulação mais versátil para investigadores que desejam estudar a fisiologia, estrutura e imunologia do enxerto coração-pulmão transplantado. Em segundo lugar, descrevemos como a função do enxerto de transplante pode ser caracterizada diretamente in vivo. Para essa aplicação, cateteres de condutância pressão-volume podem ser introduzidos diretamente no ápice do VE do enxerto de transplante, o que permite a caracterização funcional cardíaca completa.

A técnica descrita aqui pode ser aplicada a estudos agudos e crônicos da função do enxerto de transplante, enquanto a avaliação funcional pode ser realizada in vivo ou in vitro. Apresentamos um modelo em que as condições de carga podem ser quase fisiológicas, porém o grau de carga ventricular pode ser manipulado tanto aguda quanto cronicamente, desviando o retorno venoso para perto ou para longe do enxerto. As condições de pós-carga também podem ser manipuladas. Como o pulmão e suas vias aéreas são retidos nessa configuração de transplante, os investigadores podem reventilar o pulmão do doador de forma aguda. Excepcionalmente, a reventilação pulmonar altera a composição do sangue perfundindo as artérias coronárias transplantadas. Em condições não ventiladas, o sangue ejetado da aorta doadora é desoxigenado e se mistura com o sangue oxigenado na aorta receptora. Em condições agudamente ventiladas, o sangue ejetado torna-se oxigenado. Assim, a função do enxerto de transplante pode ser comparada em condições ventiladas e não ventiladas, e também em condições de carga variável.

O protocolo abaixo descreve modificações importantes nas operações de doadores e receptores HAHLT descritas anteriormente. Também descreve uma técnica ideal para proteger o enxerto de transplante durante todo o período de isquemia (tempo entre o explante do doador e o implante do receptor). As vantagens dessa técnica incluem condições fisiológicas potencialmente próximas às de um enxerto transplantado ortotopicamente e uma ampla gama de aplicações investigativas. Uma limitação importante é sua complexidade técnica. Com orientação e prática adequadas, as vantagens dessa técnica provavelmente superarão os desafios de adotá-la.

Protocolo

Todos os animais foram alojados e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e Nacional. Aprovação ética para este protocolo foi concedido pela Universidade do Comitê Animal Care da British Columbia. Macho, ratos Sprague-Dawley machos pesando entre 300-450 g foram usados ​​para este protocolo.

1. Doador de Operação

1. Possui cerca de 100 ml de solução cardioplégica (RT) em um balão cilíndrico ligado ao longo intravenosa (IV) por um tubo de cateter torneira de 3 vias. Use um suporte para elevar o balão a cerca de 80 centímetros acima da superfície de trabalho, permitindo a entrega cardioplegia por gravidade.
2. Para visualizar estruturas adequadamente, use um par de lupas cirúrgicas ou um microscópio de dissecação.
   NOTA: Atualmente usamos um microscópio cirúrgico binocular com 3.4 - ampliação 21.3X.
3. Coloque o doador em uma câmara de anestésico e induzir a anestesia com 4-5% de isoflurano.
4. Transferir o rato a uma plataforma de operação e manutenção da anestesia através do nariz-cone com 1-2% de isoflurano. Aplicar veterinário pomada para os olhos do animal para prevenir o ressecamento. Administrar o midazolam (2 mg / kg), intraperitonealmente com uma agulha G 25.
5. Usando cortadores cirúrgicos, raspar o doador do processo xifóide do esterno a mandíbula. Raspar uma pequena região da virilha esquerda (para acesso subsequente IV). Aplicar um agente para depilar as superfícies operativas, esperar cerca de 5 min, e remover o cabelo com um pedaço de gaze.
6. Prepare os locais cirúrgicos com uma solução baseada em clorexidina iodopovidona ou (nós usamos somente clorexidina). Infiltrar nos sites incisional com 0,1-0,5% de lidocaína por via subcutânea.
7. Obtenha os membros dianteiros e membro esquerdo para a plataforma operacional com fita adesiva, deixando o membro posterior direito livre para monitoramento de profundidade anestésica e os sinais vitais.
8. Depois de assegurar a profundidade da anestesia adequada por pedal pitada, fazer uma incisão no sulco virilha esquerda usandoum bisturi 22-lâmina. Por dissecção romba, expor a veia femoral comum esquerda e obter acesso IV como se segue:
   1. Suavemente retrair o tecido que cobre o veia femoral, e canular a veia com um 24 g IV. Conecte o IV para um curto período de IV tubulação cheio de solução salina, e fixar o tubo no lugar com fita adesiva.
      NOTA: O procedimento de punção venosa femoral em ratos é descrito em outros lugares por Jespersen e colegas ^14.
   2. Ligar uma seringa de 10 ml cheio de solução salina para a tubagem IV, e suavemente aspirar sangue para garantir o posicionamento correcto do IV.
   3. Injectar 300-500 UI de heparina não fraccionada através da tubagem IV, e, subsequentemente, lavar a tubagem com 3-5 ml de solução salina.
9. Em seguida, o doador tracheotomize como se segue:
   1. Adicione uma incisão na linha média em tecidos moles entre o entalhe jugular e da mandíbula, utilizando um bisturi 22-lâmina. Penetrar a cápsula da glândula tireóide na linha média usando Metzentesoura Baum, e separados seus lóbulos usando dissecção romba.
   2. Utilizando uma dissecção romba, separar os músculos do pescoço cinta na linha média para expor a superfície anterior da traqueia.
   3. Use uma pinça curva sem rodeios para dissecar um plano circunferencial em torno da traquéia. Cercar a traqueia com um laço de seda 4-0.
   4. Usando uma tesoura de íris, fazer uma incisão transversal na traquéia anterior, aproximadamente 5 mm inferior à cartilagem tireóide. Suavemente introduzir a cânula traqueal (a 14 G IV) e fixá-lo no lugar usando o laço de seda 4-0.
   5. Conecte a cânula traqueal a um ventilador mecânico. Redirecionar o fluxo de oxigênio e isoflurano através do circuito do ventilador, e ventilar o doador a um ritmo e volume corrente previsto pelo seu peso ^13.
10. Realizar uma incisão na linha média do tórax (usando um bisturi 22-lâmina), estendendo-se a incisão na incisura jugular para um valor inferior a xipisternum.
11. Mantendo-se na linha média, Executar uma esternotomia mediana usando um cortador de osso. Retrair as bordas do esterno com uma válvula de auto-retenção. Digite o pericárdio e cavidade pleural.
12. Executar uma thymectomy. É mais fácil de dividir primeiro sem rodeios o timo na linha mediana, e então separá-lo de estruturas adjacentes usando uma combinação de dissecção brusca e precisa.
    NOTA: A origem das artérias torácicas internas pode ser lesado quando dissecando o timo longe das bordas do esterno superiores. Para prevenir o sangramento, clipes hemostáticos pode ser aplicado antes de retirar o timo nesses pontos.
13. Com uma tesoura Metzenbaum e / ou um Lauer afiada, dissecar peri-cava gordura longe da veia cava inferior (VCI). Certifique-se de que a VCI é relativamente livre de gordura e tecido conjuntivo a partir da junção cavo-atrial superiormente, para o diafragma inferiormente.
14. Usando um Lauer afiada, livre circunferencial da veia cava superior (SVC) e cercar-lo com um laço de seda 4-0.
15. Em seguida, dissecar odeixou veia cava livre de estruturas adjacentes, e ligar-lo proximal e distal com 4-0 gravatas de seda. Ressecar a parte interveniente da cava para expor a artéria subclávia esquerda.
16. Circunferencial livre os vasos do arco aórtico usando um Lauer afiado. Aplicar clips cirúrgicos proximal e distal à artéria inominada, e dividi-lo entre os clipes. Deixe a artéria carótida comum esquerda e un-cortado artéria subclávia esquerda.
17. Em seguida, canular a SVC com um cateter 24 G IV. Fixe o cateter com o anteriormente colocado 4-0 gravata de seda.
18. Prepare-se para uma colheita do enxerto expediente, mas suave.
19. Usando uma tesoura afiada, dividir o IVC apenas superior à superfície diafragmática. Divida o SVC superior ao seu sítio de punção, assegurando que as estruturas das vias aéreas próximas não estão feridos.
20. Desligue o ventilador e retire a cânula traqueal. Transecto a traqueia proximal.
21. Segure a traquéia seccionado com uma pinça, e remover o coraçãoe pulmões em blocos. Isso vai exigir tração suave com dissecção afiada como o enxerto de coração-pulmão é removido. Separa-se a traqueia a partir do esófago subjacente. Evitar ferir a aorta descendente, de modo que uma grande parte dele permanece intacto após a colheita.

2. Preparação do Coração-pulmão Graft

NOTA: ao completar esta parte do procedimento, o assistente, deve ser anestesiar o roedor destinatário e se preparando para a implantação do enxerto.

1. Inserir o enxerto de coração-pulmão de gaze cirúrgica com a superfície anterior do coração voltado para baixo. Usando dissecção afiada, remover qualquer esôfago residual, evitando prejuízo para as vias respiratórias posteriores.
2. Localize a aorta torácica descendente e inserir um 16 G de ponta romba cânula. Segurar a cânula no lugar com uma gravata de seda 4-0.
3. Localize os vasos do arco aórtico, e aplicar um grampo cirúrgico da artéria subclávia esquerda. Deixe a artéria carótida esquerda un-cortado para a subsequent de-aeração.
4. Administrar a primeira dose de cardioplegia, ligando o tubo de cardioplegia à cânula aórtica 16 L. A artéria carótida deve ser temporariamente fechada com uma pinça para garantir a entrega adequada de cardioplegia.
   NOTA: Uma vantagem de ter a cânula aórtica ligada é que cardioplegia pode ser administrada de forma contínua e / ou intermitente, como desejado. Para dosagem intermitente, que normalmente entregar cardioplegia cada 10 - 15 minutos em 5 ml bolus sobre 30 - 45 seg.
5. Com uma tesoura Metzenbaum e / ou um Lauer afiada, dissecar a gordura peri-aórtico longe da aorta. Certifique-se de que a aorta é relativamente livre de gordura e tecido conjuntivo a partir da artéria subclávia esquerda (arco distal) ao seu sítio de punção.
6. Em seguida, expor o brônquio fonte esquerdo usando um Lauer afiada, e ligar-lo proximamente com um laço de seda 4-0. Transecto a distal brônquio esquerdo para a ligadura da íris usando uma tesoura. Executar uma pneumonectomia esquerda ligando o pulmonar esquerdaartéria e veia com 4-0 gravatas de seda. Transecto distal à ligadura e remover o pulmão esquerdo.
7. Como acima, remover todos os outros lobos pulmonares com exceção dos lobos superior e médio direito. Evitar ferir o IVC no processo de realização de lobectomia.
8. Ligue a tubagem de cardioplegia à cânula aórtica e administrar cardioplegia contínua, enquanto o destinatário está sendo preparado. Inserir o enxerto de coração-pulmão, num recipiente estéril (por exemplo, um copo).

3. Destinatário Operação

1. Anestesiar destinatário de acordo com a operação de dador, acima. Use veterinário pomada para proteger os olhos do animal de secura. Confirme anestesia com freqüência por pedal pitada.
2. Posicione o animal de acordo com a operação doador, desta vez deixando o membro anterior direito livre para monitorar os sinais vitais e profundidade anestésica.
3. Raspar o abdômen do processo xifóide do esterno ao pênis. Raspar uma pequena região da virilha esquerda (para acesso subsequente IV). Aplique umaagente para depilar as superfícies operativas, esperar cerca de 5 min, e remover o cabelo com um pedaço de gaze.
4. Prepare os locais cirúrgicos com um iodopovidona ou solução baseada clorexidina. Infiltrar nos sites incisional com 0,1-0,5% de lidocaína por via subcutânea.
5. Tracheotomize e ventilar o destinatário como indicado acima. Como alternativa, manter o destinatário sob anestesia nariz-cone.
6. Introduzir um cateter na veia femoral como descrito acima. Injectar 300-500 UI de heparina não fraccionada através da tubagem IV, e, subsequentemente, lavar a tubagem com 3-5 ml de solução salina.
7. Executar uma laparotomia fazendo uma incisão na linha média abdominal com um bisturi 22-blade de processo xifóide do esterno ao pênis. Retrair a parede abdominal utilizando um afastador auto-retenção. Em seguida, retirar as entranhas superiormente e para o lado esquerdo do rato. Envolvê-los em, gaze embebida com solução salina quente.
8. Expor a aorta abdominal IVC e por acentuadamente dissecando através da re sobrepostagordura tro-peritoneal.
9. Ter uma braçadeira navio curvo disponível e pronto.
10. Circunferencial libertar a VCI e aorta proximal e distal e cercar-los com laços de seda 4-0. Não deve ser de aproximadamente 2-3 cm de espaço entre estes sítios.
11. Cuidadosamente aplicar o grampo vaso curvo, assegurando que uma porção suficiente de ambos VCI e aorta são expostos por cima das maxilas da peça de aperto.
12. Realizar uma incisão na parede anterior da VCI com uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 ml cheio de solução salina. Estender a incisão com tesoura de Potts para corresponder ao comprimento do dador VCI orifício.
13. Remova o enxerto de coração-pulmão de seu recipiente e desconecte-o cardioplegia. Coloque o enxerto no abdômen do destinatário em uma posição ideal para realizar a anastomose venosa.
    NOTA: O enxerto de coração-pulmão acabará por ser orientada ligeiramente oblíqua, com o ápice apontando para as abdômen do quadrante inferior esquerdo.
14. Prenda o calcanhare dedo do pé termina da anastomose com 9-0 nylon de sutura. Dê um nó segura em cada extremidade, deixando a agulha ligada a um braço longo do fio de sutura e uma extremidade curta do fio de sutura para ser ligada a mais tarde. Administrar uma dose de cardioplegia.
15. Na gestão de moda, completa a metade da linha de sutura e gravata para o braço adversária sutura curto. Administrar uma dose de cardioplegia.
16. Complete a outra metade da linha de sutura e amarrá-lo para baixo. A anastomose venosa é completa. Administrar uma dose de cardioplegia
17. Orient o enxerto de coração-pulmão com apontando o ápice do coração em direção aos abdômen do quadrante inferior esquerdo. Certifique-se de que a anastomose venosa não está dobrada ou torcida.
18. Avaliar o comprimento da aorta do doador, que será necessária para alcançar a aorta do receptor, mantendo tanto IVC e anastomose da aorta em configurações livre de tensão e desdobrado.
19. Divida a aorta descendente (distal à artéria subclávia esquerda) com uma tesoura de íris.
20. Realizar uma incision na parede anterior da aorta do receptor com uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 ml cheio de solução salina. Estender a incisão com tesoura de Potts para corresponder ao comprimento do orifício aórtico dador.
21. Ancorar o dedo do pé (aspecto superior) da aorta dador até ao receptor aorta utilizando uma sutura 9-0 nylon. Em seguida, passe a agulha para a face medial da aorta e completar metade da anastomose na execução de moda.
22. No calcanhar da anastomose da aorta, inverter a orientação da linha de sutura (uma transição na direcção de costura), e concluir a metade lateral da anastomose no funcionamento da forma.
23. Lentamente remover o cateter IV na SVC, e ligar o SVC com um grampo cirúrgico.
24. De-ar da aorta, localizando a artéria carótida comum esquerda un-cortado. Segurar a artéria aberta, em posição vertical, que vai permitir que o ar a ser evacuado livremente.
25. Resumidamente abrir as maxilas do grampo vaso curvo e permitir que a artéria carótida para sangrar (de-air) para 2-3 sec. Reaplicar o grampo navio.
26. Aplique um grampo cirúrgico à artéria carótida. Remover o grampo vaso curvo.
27. Verifique se há sangramento nas linhas de sutura. Se estiver presente, aplicar compressão suave com gaze cirúrgica ou de reparação com um comprimento de 9-0 sutura de nylon (dependendo da gravidade do sangramento).
28. O coração do doador deve retomar batendo em poucos minutos.
29. Preste atenção aos sinais vitais do destinatário, profundidade da anestesia, reanimação e administrar o volume conforme necessário.
30. Dependendo dos endpoints experimentais, quer fechar abdômen do animal e deixá-lo recuperar da anestesia, ou preparar o animal para avaliação cardiovascular.
    NOTA: Exemplos de avaliação de enxerto incluem em medidas in vivo de hemodinâmica dependente da carga e independente de carga, in vitro medidas de função em Langendorff e modos coração de trabalho, e (em cirurgia sobrevivência) ecocardiográficos ou inquéritos de ressonância magnética.
31. Nofinal de experiências agudas de terminais, os animais são sacrificados por exsanguinação.

Resultados

A técnica HAHLT descrito acima é altamente técnica e requer muita atenção aos detalhes. Tabela 1 destaca alguns dos principais fatores associados ao sucesso contra procedimentos mal sucedidos, e pode ser usado como um guia para a resolução de problemas dificuldades técnicas.

Após a aorta do receptor está desapertada, as artérias coronárias de enxerto deve ser visto a encher com sangue oxigenado. Assim, o miocárdio deve tornar-se rosa e bem perfundido. Em experimentos tecnica...

Discussão

O sucesso com a técnica descrita aqui vai ser em função de diversos factores. O principal entre eles será assegurar a estabilidade de ambos os animais doadores e receptores, adotando a técnica operatória meticulosa que é seguro e associado com a perda de sangue mínima, garantindo parada cardioplégica completo com arrefecimento uniforme enxerto, minimizando o tempo de isquemia total, e de forma adequada de-arejar o enxerto. Como reconheceu acima, a complexidade técnica da técnica é a sua limitação chefe.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Celsior Cardioplégico Soution	Genzyme		A solução é mantida em gelo durante todo o procedimento. Preparamos nossa própria solução, com pequenas modificações.
Ventilador de Roedores	Harvard Apparatus	Modelo 683
Monitor de Sinais Vitais	Nonin	Modelo 9847V	Exibe SpO2 e frequência cardíaca.
Cânulas IV	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4".
Tubo IV	CareFusion	MP9259-C	Tubo conector de comprimento curto (18 cm).
Clipes cirúrgicos	Teleflex Medical	001204	Horizon clipes de ligação de titânio.
Suturas	Ethicon, Sharpoint	LA54G, carretel de seda AK-0107	3-0 e sutura de prolene 9-0 (braço único, agulha DR5).
Instrumentos cirúrgicos	Não aplicável	Não aplicável	Os instrumentos utilizados são genéricos e podem ser adquiridos de qualquer empresa de suprimentos cirúrgicos.