Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Resumo

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Resumo

A retina é a porta de entrada para o sistema visual. Para entender os mecanismos de processamento de sinais visuais, investigamos as funções de rede neurais da retina. Neurónios retinais na rede compreendem numerosos subtipos. Mais do que 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares e células amacrine foram identificadas por estudos morfológicos. Vários subtipos de neurônios da retina são pensados ​​para codificar características distintas de sinalização visual, tais como movimento e cor, e de múltiplas vias neurais. No entanto, os papéis funcionais de cada neurónio no processamento de sinais visuais não são completamente compreendidos. O método de fixação de membranas é útil para abordar esta questão fundamental. Aqui, um protocolo para registrar as respostas sinápticas luz evocados em rato neurônios da retina usando gravações patch clamp em condições de adaptação ao escuro é fornecido. Os olhos de ratinhos são de adaptação ao escuro O / N, e os preparativos fatia da retina são dissecados em um quarto escuro com uma iluminação e visores infravermelhos. A luz infravermelha nãoativar fotorreceptores do mouse e, assim, preserva a sua capacidade de resposta luz. Patch clamp é usada para registrar as respostas leves evocadas em neurônios da retina. Um corante fluorescente é injetado durante as gravações para caracterizar os subtipos morfológicos neuronais. Este procedimento permite determinar as funções fisiológicas de cada neurónio na retina do rato.

Introdução

A retina é uma das partes únicas do sistema nervoso. Como uma parte acessível do cérebro, sua arquitetura sináptica foi bem caracterizada. Além disso, as funções dessa rede neural podem ser examinadas com um estímulo fisiológico: a luz. Se o tecido da retina for isolado em uma sala escura com procedimentos apropriados, os neurônios do tecido responderão à luz. Esta preparação tem sido usada para estudar o processamento de sinais visuais e elucidar vários mecanismos sinápticos e funções de redes neurais, bem como mecanismos de doenças.

As respostas à luz nos neurônios da retina foram registradas por décadas. Os primeiros estudos usaram eletrodos afiados para fazer gravações intracelulares de^neurônios retinianos 1. Na década de 1980, a técnica de patch clamp foi inventada² e logo se tornou um método popular entre os pesquisadores da visão^3,4. Gravações de células únicas de vertebrados inferiores, incluindo neurônios retinianos de filhotes e peixes, foram métodos populares que contribuíram para a elucidação dos mecanismos de processamento de sinais visuais^5,6.

Depois que as técnicas de mutação genética foram desenvolvidas, a retina do camundongo tornou-se um modelo mais popular para pesquisadores^{da visão 7-9}. A retina dos mamíferos é mais atraente do que a dos vertebrados inferiores porque está evolutivamente mais próxima da retina humana e há uma oportunidade de usar modelos de doenças. No entanto, as células da retina de camundongos são pequenas e frágeis¹⁰, e fazer preparações retinianas e realizar gravações de patch clamp em uma sala escura é um desafio. À medida que a tecnologia melhorou, diversas abordagens tornaram-se disponíveis para estudar os mecanismos de sinalização visual, como estudos de imagem¹¹ e o eletrorretinograma (ERG) ¹². No entanto, o registro de célula única com o método patch clamp ainda é importante porque é altamente sensível temporal e espacialmente em comparação com outros métodos. Portanto, conduzimos continuamente registros de patch clamp e melhoramos nossos métodos para investigar o processamento de sinais visuais em preparações de fatias de retina de camundongos^13-15.

Neste tutorial em vídeo, os protocolos são apresentados com dicas importantes. Boas gravações só podem ser alcançadas com uma boa preparação. Praticar a dissecação de animais e construir um equipamento de grampo de remendo resistente permitirá que a maioria dos pesquisadores obtenha gravações bem-sucedidas.

Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Wayne.

1. Preparação de Solução Experimental

1. Preparar a solução de dissecção de 1 dia a 1 semana antes da experiência real. Use uma solução tampão HEPES para dissecção da retina devido à sua forte capacidade de tamponamento em temperaturas mais baixas ^16. Misturar todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 de _CaCl2, 1,0 de _MgCl2, 10 HEPES, 28 glucose. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Manter a solução no frigorífico até 1 semana.
2. A solução de gravação é o meio de Ames ", o qual é um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) concebido para preparações da retina ^17. No dia da experiência, pesam-se pó de Ames (4,4 g por 500 ml de solução) num tubo. Além disso, pesam-se _NaHCO3 (0,95 g por 500 ml de solução) e misturar com o Apó 'mes.
3. Preparar a solução pipeta intracelular para gravações de patch clamp pelo dia do experimento. Misturar todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 111 K-gluconato, 1.0 _CaCl2, 10 de HEPES, 1,1 de EGTA, 10 NaCl, 1,0 _MgCl2, 5 de ATP-Mg, 1,0 e GTP-Na. Ajustar o pH para 7,2 com KOH. Filtra-se a solução da pipeta com um filtro de seringa convencional. Faça ~ 500 mL alíquotas e armazená-los em um freezer ou congelador.

2. Preparação para o Dia da Experiência

1. A noite antes do experimento, coloque um rato em uma gaiola (C57BL / 6J ou fundo semelhante, 4-8 semanas de idade, do sexo masculino) em um espaço escuro para O / N adaptação ao escuro.
2. Preparação para dissecção:
   1. Encha solução de dissecação (100-200 ml) num copo de vidro, colocá-lo em gelo, e com bolha de oxigénio durante pelo menos 10 min.
   2. Comece a oxigenação da caixa escura para armazenamento de preparação da retina.
   3. Prepare lamelas de plástico com trilhos de graxa para repreparações fatia Tinal e coloque cada um deles em um 35 milímetros de plástico prato.
   4. Coloque uma nova lâmina de barbear para um helicóptero (fatiador de tecidos).
   5. Cortar uma membrana de filtro em duas metades. Isto é para o corte da retina.
   6. Alinhar as ferramentas de dissecação e pipetas de transferência de perto o microscópio de dissecação. A área de trabalho deve ser bem organizado para que cada ferramenta pode ser facilmente acessado no escuro.
3. Preparação para as gravações da braçadeira patch:
   1. Dissolve-se pó de Ames e _NaHCO3 em água destilada (Ames 4,4 g de NaHCO ₃ e 0,95 g / 500 ml _ddH2O). A forma da bolha de Ames misturado com oxigénio (95% _{de O2} e 5% de CO ₂₎ durante pelo menos 30 minutos enquanto se aquece para um nível de temperatura de gravação (~ 35 ° C). Ajustar o pH a 7,4 com _NaHCO3 enquanto ainda borbulhante.
   2. Descongele a solução pipeta interna durante a dissecção. Depois que ele for descongelado, adicione 0,01% sulforrodamina B para a coloração intracelular.

3. Retinal Dissection

1. Em um quarto escuro, eutanásia do mouse usando o dióxido de carbono e pneumotórax bilateral. Depois de 2-3 min de usar o dióxido de carbono, o mouse vai perder a consciência.
2. Quando o mouse não responde mais a uma pitada cauda, ​​enuclear rapidamente os olhos e colocá-los em uma solução de dissecação fria em um prato de plástico. Realize o pneumotórax bilateral para garantir a morte do animal. Rapidamente armazenar o olho no prato na caixa escura. Use um visualizador de infravermelho para realizar o procedimento no escuro.
   NOTA: Como alternativa, o isoflurano, decapitação, ou deslocamento cervical pode ser usado para eutanásia. O método de eutanásia deve seguir as orientações do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e / ou o Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional.
3. Em um quarto escuro, ajuste o microscópio de dissecação e iluminação infravermelha. Sob o microscópio, transferir um olho a partir do seu prato num prato plástico 10 centímetros wom a solução arrefecida dissecação. Continuamente bolha de oxigénio através de tubos colocados no fundo do recipiente de plástico. Ajustar o volume de fluxo de modo que não é demasiado baixa, mas assegurar que não é suficientemente elevada para perturbar a dissecção.
4. Córnea e do cristalino remoção:
   1. Realizar uma incisão na parte superior da córnea com uma faca de micro-cirúrgica. Segurando o nervo óptico no extremo oposto do globo ocular impede o olho de se mover. Estender o corte usando um par de tesouras cirúrgicas. Cortar a córnea com alguns esclera em torno dele.
   2. Agarre a lente com uma pinça fina e puxe lentamente a lente para fora. Se o vítreo é demasiado pegajoso para remover o cristalino, corpo vítreo cortado com uma tesoura.
   3. Uma vez que o olho-copo é feito, coloque delicadamente, solução de dissecação oxigenado frio para a ocular com uma pequena pipeta de transferência.
      NOTA: O globo ocular esvazia rapidamente depois é feita uma incisão na córnea. É importante manter a forma do olho como deformando o olho durante este proprocedimento pode danificar a retina e causar descolamento de retina.
5. Identificando os lados dorsal e ventral da retina:
   NOTA: Por causa da distribuição desigual do verde e do ultravioleta (UV) cones ^18, a identificação de uma área específica da retina é importante para as gravações de resposta à luz.
   1. Identificar a linha que vai do outro lado da taça dos olhos retinal passando perto da cabeça do nervo óptico. Esta linha passa principalmente através do lado ventral do nervo óptico; o lado incluindo o nervo óptico é o lado dorsal, enquanto o outro é ventral ^19. Veja este marco claramente sob telespectadores infravermelhos.
   2. Dependendo da finalidade da experiência, fazer um corte no lado desnecessária. Isto será útil após o isolamento da retina a partir da taça dos olhos.
6. Remoção Vítreo:
   1. Opcionalmente, incubar o olho de taça com hialuronidase (0,5 mg / ml) durante 15 min.
   2. Retire o vítreo com uma pinça extra-finos. O vítreo é principalmentecolocado no fundo e o bordo exterior do olho de taça. Delicadamente, removê-lo sem tocar ou picar a retina. Como o vítreo pode ser firmemente ligado à ocular, retire com cuidado para evitar o descolamento da retina do olho-cup. Continue a puxar até que nenhuma tensão é sentida.
      NOTA: Este passo é particularmente importante para dissecar as retina do rato; no entanto, não é um problema para as retinas de outras espécies, tais como o rato ou salamandra.
7. Isolar a retina do olho-cup. Agarre a esclera e retire com cuidado a retina usando a parte traseira de uma pinça.
   NOTA: Total de montagem preparações da retina pode ser feita a partir da retina isolada. Faça 3-4 cortes nas bordas e achatar a retina, ou cortar a retina em vários pedaços.
8. Apare a retina e descartar a metade desnecessária da retina (passo 3.5). No mesmo prato de plástico, cortado a retina restante em dois pedaços. Para cada pedaço da retina, cortar as bordas para fazer umalaje de retina, e aparar as arestas de dobragem.
9. Transferir uma laje da retina numa placa de vidro utilizando uma pipeta de transferência grande (~ 2 ml). Suga-se o excesso de solução com uma pequena pipeta, usar um pedaço de papel de filtro para achatar a placa e, em seguida, colocar rapidamente uma parte da membrana de filtro na parte superior do tecido.
   1. Utilizando uma pequena pipeta de transferência, colocar uma gota de solução sobre a membrana de filtro de dissecação. Espera ~ 15 seg, até a solução se espalha através da membrana. Durante este tempo, o tecido da retina vai ficar com a membrana de filtro.
   2. Despeje solução de dissecação mais frio sob e ao redor do filtro. O tecido da retina com a membrana de filtro irá flutuar. Agarrar a membrana de filtro com uma pinça e colocá-lo na câmara de corte. Despeje solução dissecar sobre o tecido, e armazenar a preparação na caixa escura.
      NOTA: O procedimento descrito aqui é crítica. É importante realizar estes passos rapidamente para assegurar que as varas de tecido da retina para os filtros de membrana e não seque.
10. Utilizando um cortador, cortar o tecido da retina em fatias. Cerca de 200 m de espessura é viável para estudos de fixação de membranas.
11. Coloque uma lamela de plástico com trilhos de graxa na câmara de corte. Transferir uma fatia da retina em cima dos trilhos de graxa em uma lamela de plástico. Girar a fatia 90 °, de modo que a secção transversal é visível. Pressionar a membrana do filtro para baixo sobre a lamela e, em seguida, cobrir os lados do papel de filtro com graxa.
    1. Após a fatia é imobilizada em uma lamela de plástico, pegue a lamela e transferi-lo para a 35 mm plástico prato. Despeje solução de dissecação fria sobre o preparo da retina e mergulhe a preparação. Armazenar cada prato na caixa escura, a qual deve ser continuamente oxigenado.
       NOTA: Todo o procedimento precisa ser feito com cuidado para que a membrana do filtro não está deformado. Caso contrário, a fatia da retina facilmente se separa da membrana de filtro.

4. Remendo Recordings Grampo de Retinal Slice Preparação

1. Gravação de preparação:
   1. Prime os tubos de perfusão com meio Ames '. Permitir que todas as bolhas para atravessar ao encher a tubulação.
   2. Faça pipetas de gravação patch clamp com um puxador. Para preencher uma pipeta com a solução de pipeta, mergulho na parte traseira de uma pipeta de 1 min até a ponta da pipeta é aterrado. Em seguida, encher ~ 1/3 da pipeta usando um material de enchimento de micro-pipeta. Guarde cada pipeta em uma caixa de pipeta úmido.
   3. Ligue o equipamento para gravações de patch clamp; incluindo o computador, amplificador, câmera CCD, e microscópio.
2. Desligue a luz da sala. Coloque uma preparação fatia da retina para a câmara de platina do microscópio usando um visualizador de infravermelho. Depois é imobilizado, começar a perfusão contínua. Regule a temperatura de perfusão em 33 a 37 ° C.
3. Ver a superfície da fatia com a câmera CCD. Concentre-se no local de destino onde o ce-alvotipos ll residem. Selecione uma célula de aparência saudável para correção de gravação grampo (ou seja, ele deve ter a superfície lisa para o futuro e uma forma da célula bom).
4. Coloque uma pipeta de gravação num suporte pipeta. Avança a pipeta para a preparação fatia. Quando se está perto da preparação fatia (~ 2 milímetros acima), encontrar a ponta da pipeta com o microscópio. Uma vez que a ponta da pipeta é visível ao microscópio, mover a ponta para baixo para a célula alvo.
5. Defina o amplificador. Ajustar a pipeta a 0 mV / 0 pA (zeroing) e iniciar um pulso elétrico contínuo de ~ 5 mV em ~ 10 Hz. Verificar a resistência pipeta; resistência ideal é entre 5 e 10 mohms para a maioria dos neurônios da retina.
6. Comece soprando para fora da ponta. Usar um bocal, ou utilizar uma seringa, para aplicar pressão positiva quando a pipeta mergulha na solução de banho. Continuamente soprar a solução interna até que a ponta está localizada na superfície da célula alvo.
   1. Quando a pressão positiva faz uma pequena covinha no thsuperfície celular e, avançar a ponta ligeiramente e parar de soprar. Verificar a resistência pipeta, que deve aumentar. Se ele está aumentando continuamente, deixá-lo e monitorar a resistência até que ele atinja> 1 GÊ (gigaseal). Se a resistência não aumenta de forma espontânea, aplique suavemente pressão negativa até que se torne um gigaseal.
7. Após a gigaseal é conseguido, mudar o potencial de manutenção de -70 mV. Em seguida, aplicam-se de forma intermitente de pressão negativa para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando a configuração de célula inteira é feita, a resistência pipeta pode estar entre 500 e 1 GÊ mohms, e a corrente capacitiva é visto. Às vezes, as correntes pós-sinápticos espontâneas podem ser observados.
8. Grave a relação IV de -80 a +40 mV. Diferentes tipos de canais dependentes da voltagem são activados dependendo do tipo de célula.
9. Grave luz evocou-correntes sinápticas ou tensões.

Resultados

Uma preparação fatia representativo é mostrado na Figura 1. A preparação fatia está numa posição direita, que mostra a fotorreceptores células ganglionares em uma superfície plana, sem descolamento do papel de filtro. Se uma fatia é inclinado, apenas uma parte da preparação está em foco, o que torna difícil identificar uma célula apropriado para correção de aperto. Para as gravações, é importante escolher um bom soma, que geralmente tem uma superfície brilhante, uma forma ainda rodada, e não há placas e...

Discussão

Boas gravações só podem ser alcançadas com boas preparações de retina e configurações de patch clamp bem projetadas. Embora todas as etapas descritas acima sejam importantes, a discussão destaca algumas etapas críticas tanto para a dissecação quanto para as gravações.

Para dissecação, duas coisas são especialmente importantes: resfriamento e oxigenação. Depois de enuclear o olho, remova rapidamente a parte frontal do olho em uma câmara de dissecação com solução de dissecação resfriada com bol...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos (28-60 dias de idade, macho)	Jackson laboratory	C57BL/6J cepa
Ames 'pó médio	Sigma	A1420	excelente
Microscópio estéreo	Nikon	SMZ745	excelente
Ferramenta de dissecação: fórceps	Dumont	#4, #5, #55	excelente
Ferramenta de dissecação: tesoura	Roboz	RS-5605	excelente
Ferramenta de dissecação: faca de cirurgia	Surgistar	7514	excelente
lâmina de barbear (para helicóptero)	EMS	71970	excelente
helicóptero	feito à mão
visualizador infravermelho	Night Owl Optics	NOBG1	Mostra uma visão brilhante. Focar objetos pequenos é um problema.
Extrator	Sutter	P-1000	excelente; faz pipetas de tamanho consistente.
Caixa escura	Pelicano	escura	excelente
sistema de grampo de remendo	Scientifica	slice scope 2000	Excelente configuração. A maioria dos componentes-chave está incluída em um pacote. Os micromanipuladores são excelentes.
Amplificador	Molecular Devices	multiclamp 700B	Excelente e fácil controle.
Software de aquisição	Software pClamp da Molecular Devices		Excelente e fácil controle.
Fonte de luz (LED)	Cool LED	pE-2 sistema de 4 canais	Excelente
câmera CCD	Q-imaging	Retiga 2000	Excelente
gaiola de Faraday	feita à