Artigo de método

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 de fevereiro de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degradação de proteínas Regulado é crucial para praticamente todas as funções celulares. Muito do que se sabe sobre os mecanismos moleculares e requisitos genéticos para a degradação da proteína eucariótica foi inicialmente estabelecida em Saccharomyces cerevisiae. Análises clássicas de degradação de proteínas têm contado com metodologias de pulso-Chase e cycloheximide-perseguição bioquímicos. Embora essas técnicas de fornecer os meios sensíveis para a observação de degradação de proteínas, eles são trabalhoso, demorado, e de baixo rendimento. Estas abordagens não são passíveis de triagem rápida ou em larga escala de mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio baseado no crescimento das leveduras para a identificação fácil dos requisitos genéticos para a degradação da proteína é descrito. Neste ensaio, uma enzima repórter necessária para o crescimento sob condições selectivas específicas é fundida com uma proteína instável. As células a que falta a enzima repórter endógeno mas expressam a proteína de fusão pode crescer sob selecondições CTIVE apenas quando a proteína de fusão é estabilizado (ou seja, quando a degradação da proteína é comprometida). No ensaio de crescimento descrito aqui, diluições em série de tipo selvagem e mutantes de células de levedura contendo um plasmídeo que codifica uma proteína de fusão são manchados para o meio selectivo e não selectivo. O crescimento em condições selectivas é consistente com insuficiência degradação por uma dada mutação. O aumento da abundância de proteína deve ser confirmada bioquimicamente. Um método rápido para a extracção de proteínas de levedura numa forma adequada para a electroforese e Western blotting é também demonstrada. Uma leitura à base de crescimento para a estabilidade da proteína, combinado com um protocolo simples para a extracção de proteínas para análise bioquímica, facilita a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação da proteína. Estas técnicas podem ser adaptadas para controlar a degradação de uma variedade de proteínas de vida curta. No exemplo apresentado, a enzima His3, o qual é necessário para a biossíntese de histidina, foi fundidapara Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 é alvo de degradação após a aberrante engata a translocon retículo endoplasmático. As células que albergam Deg1 -Sec62-His3 foram capazes de crescer em condições selectivas quando a proteína foi estabilizado.

Introdução

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Degradação selectiva de proteínas é essencial para a vida eucariótica, e a degradação da proteína alterada contribui para um certo número de condições médicas, incluindo vários tipos de cancro, doença neurodegenerativa, doença cardiovascular, e fibrose cística 1-5. O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), que catalisa a degradação da proteína seletivo, é um alvo terapêutico emergente para estas condições 6-10. Ubiquitina ligases covalentemente anexar polímeros da ubiquitina ácido 76-amino de proteínas 11. Proteínas que foram marcados com correntes poliubiquitina são reconhecidos e proteolizada pelos 2,5 megadalton ~ proteassoma 26S 12. Estudos iniciados no organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) ter sido fundamental na elucidação dos mecanismos de degradação de proteínas em células eucarióticas. O primeiro substrato fisiológico demonstrou da UPS foi a levedura repressor da transcrição MATα2 13, 14, e muitos componentes altamente conservadas da UPS foram inicialmente identificados ou caracterizado por leveduras (por exemplo, 15-26). Descobertas feitas neste organismo modelo versátil e geneticamente tratável são susceptíveis de continuar a fornecer importantes insights sobre os mecanismos conservadas de degradação mediada por ubiquitina.

Reconhecimento e degradação da maioria dos substratos UPS exigem uma acção combinada de várias proteínas. Por conseguinte, um objectivo importante na caracterização da degradação regulada de uma dada proteína é instável a determinar os requisitos genéticos para a proteólise. As abordagens clássicas (por exemplo pulse-chase e experiências cicloheximida-chase 27) para monitorar a degradação de proteínas em células de mamífero ou de levedura são trabalhosos e demorados. Embora estes tipos de metodologia proporcionar meios muito sensíveis para a detecção da degradação de proteínas, eles não são adequados para a análise rápida de degradação da proteína ou screeni grande escalang para as mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio à base de levedura de crescimento para a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas instáveis ​​é apresentado.

No método baseado no crescimento da levedura para analisar a degradação de proteínas, uma proteína instável de interesse (ou sinal de degradação) é fundida, na estrutura, para uma proteína que é necessária para o crescimento de levedura em circunstâncias específicas. O resultado é um substrato artificial, que pode servir como uma ferramenta poderosa para determinar os requisitos genéticos de degradação de proteínas da proteína instável de interesse. Convenientemente, as estirpes de levedura laboratorial mais comummente utilizados abrigar um painel de mutações em genes que codificam enzimas metabólicas envolvidas na biossíntese de aminoácidos específicos ou bases azotadas (por exemplo, 20,28-30). Estes enzimas são essenciais para a proliferação celular na ausência de metabolitos fornecidos exogenamente em cuja síntese das enzimas participar. Talenzimas metabólicas podem assim funcionar como repórteres à base de crescimento para a degradação de proteínas instáveis ​​ao qual se encontram fundidos. Os requisitos genéticos para a degradação da proteína pode ser facilmente elucidadas, uma vez que as mutações que impedem a proteólise irá permitir que as células portadoras do repórter degradação de crescer em condições selectivas.

Uma vantagem de crescimento é uma indicação indirecta que uma mutação em particular aumenta a abundância da proteína de interesse. No entanto, a análise bioquímica direta é necessário para confirmar que uma mutação permite o crescimento através do aumento dos níveis de proteína e não através de causas indiretas ou artificial. O efeito de uma mutação na abundância da proteína pode ser confirmada por análise de mancha de Western dos níveis de proteína em estado estacionário em células que fazem e não abrigam a mutação em particular. Um método para a extracção rápida e eficiente de proteínas de levedura (incubação sequencial de células de levedura com hidróxido de sódio e tampão de amostra) numa forma adequadapara análise por transferência Western também é apresentada 31. Em conjunto, estas experiências facilitar a rápida identificação de candidatos reguladores de degradação da proteína.

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Protocolo

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1. Yeast Crescimento ensaio para identificar mutantes candidatos defeituosos na degradação de proteínas

  1. Transformação de tipo selvagem e mutantes de células de levedura com um plasmídeo que codifica uma proteína instável fundida, na estrutura, para um repórter enzima metabólica.
  2. Inocular os transformantes em 5 ml de sintético definido (SD) meio mínimo que é selectivo para células contendo moléculas de plasmídeo. Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
  3. Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) de cada cultura durante a noite.
    NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as células em cultura podem ser, em cada fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deverá ter atingido um mínimo OD 600 de 0,2. De crescimento lento muito estirpes de levedura pode exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente.
  4. Prepare seis diluições em série de células de levedura transformadas num estéril placa de 96 poços, começando com células diluídas para uman DO600 de 0,2. Colocar cada transformante de levedura a ser doseada numa linha diferente na placa de 96 poços.
    1. Para cada transformante, calcular o volume de cultura durante a noite necessária para diluir as células até uma OD 600 de 0,2 num volume final de 200 ul. Adicionar este volume de cultura de uma noite para o correspondente poço na coluna 1. Adicionar a quantidade apropriada de água estéril para levar o volume até 200 ul.
    2. Para cada linha de levedura, adicionar 125 uL de água estéril para os poços nas colunas 2, 3 e 4.
      NOTA: placas de 96 poços estéreis embalados individualmente podem ser embalados com tampas estéreis. As tampas podem ser utilizadas como reservatórios para a água estéril que é distribuído neste passo. Isto permite a transferência simultânea de água estéril para todos os poços de uma dada coluna com uma pipeta multicanal.
    3. Misturar os conteúdos da primeira coluna (levedura diluída até uma DO 600 de 0,2), pipetando para cima e para baixo com uma pipeta multicanal.
    4. Transfer 25 ul de levedura a partir da coluna 1 para a coluna 2, utilizando um pipetador multicanal. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Transferir 25 ul da coluna 2 para a coluna 3, e 25 ul da coluna 3 a Coluna 4 (misturando bem a cada passo).
  5. Misturar cada amostra com uma pipeta multicanal. Partindo mais diluído para menos diluir colunas de levedura, pipeta 4 ul de cada amostra em duas placas contendo o meio selectivo apropriado. Use uma placa com meio que mantém seleção plasmídeo (esta placa serve como uma mancha de levedura e controle do crescimento). Usar uma segunda placa com meio que selecciona para manutenção do plasmídeo e a expressão da proteína instável fundido com a enzima repórter. Porque levedura resolver rapidamente, misture células por pipetagem cima e para baixo em intervalos regulares.
    NOTA: Secador de placas será mais facilmente absorver o líquido que as placas preparadas na hora e são, portanto, recomendado para estas experiências. Placas húmidas podem ser secas por incubação a temperatura ambiente em low humidade para 1 - 2 dias ou mais curtos, em incubações uma câmara de fluxo laminar. As placas podem secar desigualmente se o fluxo de ar laminar é paralelo à mesa. A utilização de um molde torna mais fácil de detectar células de levedura, a distâncias regulares. Dois modelos de amostra são fornecidos na Figura 1. Estes podem ser impressa, cortada, e afixada no interior de uma tampa de placa de Petri.
  6. Permitir que as placas para secar em cima da bancada.
  7. Incubar as placas a 30 ° C durante 2 - 6 dias.
  8. Fotografar cada placa após a incubação.

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Figura 1. Modelos para detectar células em placas de agar de levedura de 100 mm. Estes modelos podem ser utilizados para facilitar a mancha de levedura a distâncias regulares com um pipetador multicanal. Modelos pode ser impressa, cortada, e afixada no interior de uma tampa de placa de Petri. Coloque placa de Petri com o crescimentotampa interna médio com template aposta. Os modelos são marcados com um entalhe para acompanhar a orientação. Recomenda-se que as placas utilizadas em ensaios de crescimento ser marcado de forma semelhante com um entalhe para controlar a orientação. Modelos para manchar quatro (A) ou cinco (B) diluições em série de células de levedura são fornecidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão para impressão desta figura com modelos de 100 mm.

2. A confirmação bioquímica do ensaio de crescimento do fermento

  1. O crescimento de células de levedura e Pós-Extração alcalina Protein (modificado a partir de 31)
    1. Transformação de tipo selvagem e mutantes de células de levedura com um plasmídeo que codifica a proteína instável.
    2. Inocular os transformantes em 5 ml de meio SD que é selectivo para células contendo moléculas de plasmídeo. Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
    3. Medir a OD 600 de cada dia para o outro cuLTURE.
      NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as células podem estar em qualquer fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deverá ter atingido uma densidade óptica 600 que vai permitir a diluição para uma OD600 de 0,2 em 10 ml de meio selectivo fresco (passo 2.1.4). De crescimento lento muito estirpes de levedura pode exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente.
    4. Dilui-se células de levedura para uma DO 600 de 0,2 em 10 ml de meio selectivo fresco.
    5. Continue-se a incubar as células a 30 ° C, rotação ou agitação, até que as culturas atingem uma DO 600 compreendida entre 0,8 e 1,2 (ou seja, são em meados de crescimento logarítmica).
      NOTA: Se a proteína de interesse é instável sob o controlo de um promotor regulável, o tempo óptimo de indução da expressão da proteína e a colheita de células pode variar de acordo com estudos anteriores ou observações empíricas.
    6. Recolha 2,5 OD 600 unidades de cultura em 15 ml cônicaai tubo por centrifugação a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
      NOTA: Uma unidade DO600 é definida como a quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a OD 600 de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita de 2,5 OD 600 unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = 2,5 unidades de OD 600 / OD 600 Medido
    7. Ressuspender as células em 1 ml de água destilada. Transferir as células em suspensão para um tubo de microcentrífuga.
    8. Peletizar as células por centrifugação a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
    9. Ressuspender as células em 100 ml de água destilada por pipetagem cima e para baixo ou vórtex, e adicionar 100 mL de NaOH 0,2 M. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Incubar as amostras durante 5 min à temperatura ambiente.
    10. Células de pellets (a maioria dos quais ainda não divulgados proteínas e ainda são viáveis) por centrifugação a 18.000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
    11. Pelete Ressuspender em 50 - 100 ul de tampão de amostra de Laemmli 1x, que irá lisar as células, pipetando para cima e para baixo ou vórtex.
      NOTA: A remoção do sobrenadante após a centrifugação alcalina e subsequente ressuspensão das células em tampão de amostra de Laemmli extrai proteínas a um pH compatível com dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina e western blotting.
    12. Para desnaturar proteínas totalmente, lisados ​​incubar a 95 ° C durante 5 min.
      NOTA: As proteínas de agregação propensas (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares) pode tornar-se insolúvel quando incubadas a 95 ° C. Portanto, os lisados ​​devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como determinado empiricamente, para a análise de tais proteínas.
    13. Super lisados, colocando em gelo por 5 min.
    14. Centrifugar os lisados ​​a 18000 xg durante 1 min à temperatura ambiente para precipitar o material insolúvel. Separa-se o sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes da subsequente análise de Western blot (secção 2.2). Alternativamente, armazenar lisados ​​a -20 ° C.
  2. Protocolo de Western Blotting representativas
    1. Carregar o volume determinado empiricamente de lisados ​​em um gel de SDS-PAGE.
    2. Executar gel a 200 V até a frente do corante atingir o fundo do gel.
    3. Transferir proteínas a partir de gel de fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C.
    4. Bloco de membrana por incubação em 5% de leite desnatado em Tris-salino tamponado (TBS), balanço, durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    5. Decantar solução de bloqueio.
    6. Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse (ou seu epitopo tag) em 1% de leite desnatado em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 hora a sala de temperatura, balançando.
    7. Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
    8. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço.
      Observação: Como fluorophores são sensíveis à luz, diluições de anticorpos fluoróforos deve ser preparado no escuro. Além disso, a incubação de membranas na presença de anticorpos fluoróforos, deve ocorrer em recipientes opacos. Isto pode ser realizado por envolvimento tabuleiros de incubação em folha de alumínio.
    9. Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
    10. Adquirir imagem da membrana usando Li-Cor Odyssey CLx e software Imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), de acordo com as recomendações do fabricante.
    11. Depois de imagiologia membrana, incubar a membrana com um anticorpo primário específico de uma cargação com proteína de controlo em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço.
    12. Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
    13. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço.
    14. Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
    15. Adquirir imagem da membrana usando Li-Cor Odyssey CLx e software Imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), de acordo com as recomendações do fabricante.

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Resultados

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Para ilustrar esta metodologia, a enzima His3 foi fundido com o terminal carboxilo do modelo de retículo endoplasmático (ER) -associated degradação (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para criar Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa um membro fundador de uma nova classe de substratos ERAD que são direcionados seguinte associação persistente, aberrante com a translocon, o canal principal responsável por proteínas em movimento através da mem...

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Discussão

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A metodologia aqui apresentada permite a determinação rápida e confirmação bioquímica dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas em células de levedura. Este estudo destacou a utilidade e poder de levedura como um organismo modelo eucariótica (vários excelentes comentários da biologia fermento e compilações de protocolos para manuseio, armazenamento e manipulação de células de levedura (por exemplo, 41-44) estão disponíveis para os investigadores novos para o organismo). As técnicas pode...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos membros atuais e antigos do laboratório Rubenstein para proporcionar um ambiente de apoio e entusiasmo pesquisa. Agradecemos Ryan T. Gibson de assistência em otimização de protocolo. Agradecemos Mark Hochstrasser (Universidade de Yale) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para cepas de leveduras e plasmídeos. Agradecemos aos nossos revisores anônimos por sua ajuda para melhorar a clareza ea utilidade deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prémio de investigação a partir do capítulo Ball State University de Sigma Xi para SGW, a National Institutes of Health subvenção (R15 GM111713) para EMR, um prémio de investigação Ball State University aspirar a EMR, e fundos da Ball State University Gabinete do Reitor e do Departamento de Biologia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cepas de levedura desejadas, plasmídeos, meio padrão e componentesCepas de levedura com mutações desejadas podem ser geradas no laboratório do investigador. Leveduras do tipo selvagem e uma variedade de mutantes também estão disponíveis comercialmente (por exemplo da GE Healthcare). Plasmídeos que codificam proteínas de fusão podem ser gerados no laboratório do investigador.
3-amino-1H-1,2,4-triazolFisher ScientificAC264571000inibidor competitivo da enzima His3. Pode ser incluído no meio para aumentar o rigor do ensaio de crescimento usando as construções do repórter His3.
Endoglicosidase H (forma recombinante de Streptomyces plicatus)Roche11088726001Pode ser usada para avaliar a N-glicosilação de proteínas; compatível com as concentrações de SDS e beta-mercaptoetanol encontradas no tampão de amostra 1x Laemmli.
Tubos descartáveis de vidro borossilicatoFisher Scientific14-961-32Disponível em uma variedade de fabricantes
Incubadora com temperatura regulada (por exemplo Incubadora Heratherm Modelo IMH180)Dot Scientific51028068Disponível em uma variedade de fabricantes
New Brunswick Tambor intercambiável para tubos de 18 mm (rolo de tubo)New BrunswickM1053-0450O rolo tubular é recomendado para manter culturas iniciais de levedura durante a noite de células de levedura em suspensão. Um agitador de plataforma ou rolo tubular pode ser usado para manter culturas maiores em suspensão.
Novo Tambor de Rolo Brunswick TC-7 120V 50/60 HNovo BrunswickM1053-4004Para uso com rolo de tubo
Espectrofotômetro SmartSpec PlusBio-Rad170-2525Disponível de uma variedade de fabricantes
Placas de microteste de fundo plano de 96 poços estéreis com tampa embaladas individualmenteSarstedt82.1581.001Disponível de uma variedade de fabricantes
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & Mu; lGilsonF14401Disponível em uma variedade de fabricantes
 
 
 

 
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Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403Pipetadores monocanal e multicanal são usados em vários estágios do protocolo. Enquanto os pipetadores multicanal reduzem a carga de pipetagem em várias etapas, os pipetadores de canal único podem ser usados em todo o protocolo. Disponível em uma variedade de fabricantes.
Centrífuga 5430Eppendorf5427 000.216O rotor que é vendido com unidade comporta tubos de microcentrífuga de 1,5 e 2,0 ml. O rotor pode ser trocado por um que contenha tubos cônicos de 15 ml e 50 ml.
Sistema de imagem de placas (por exemplo Sistema Gel Doc XR+)Bio-Rad170-8195Uma variedade de sistemas pode ser usada para imagens de placas, incluindo sistemas sofisticados de imagem, scanners de computador e telefones com câmera.
Rotor de ângulo fixo F-35-6-30 com tampa e adaptadores para centrífuga Modelo 5430/R, tubos cônicos de 15/50 ml, 6 lugaresEppendorfF-35-6-30
Tubo de tampa de rosca impresso em tela de 15 ml 17 x 20 mm cônico, polipropilenoSarstedt62.554.205Disponível em uma variedade de fabricantes
Tubo flexível de 1,5 ml, PCR clean, Tubos de microcentrífuga naturaisEppendorf22364120Disponível em uma variedade de fabricantes
Aquecedor Analógico Dri-BathFisher Scientific1172011AQBanho de água fervente com placa quente também pode ser usado para desnaturar proteínas
SDS-PAGE aparelhos de corrida e transferência, fontes de alimentação e equipamentos de imagem ou câmaras escuras para SDS-PAGE e transferência para membranaVariará de acordo com o laboratório e a aplicação
Sistema de imagem Western blot (por exemplo scanner Li-Cor Odyssey CLx e software Image Studio)Li-Cor9140-01Irá variar de acordo com o laboratório e a aplicação
EMD Millipore Immobilon Membranas de Transferência de PVDFFisher ScientificIPFL00010Irá variar de acordo com o laboratório e a aplicação
Anticorpos primários (por exemplo Fosfoglicerato Quinase (Pgk1) Anticorpo monoclonal, camundongo (clone 22C5D8)))Life Technologies459250Variará de acordo com o laboratório e a aplicação
Anticorpos secundários (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)))Life TechnologiesA-21065Variará de acordo com o laboratório e a aplicação
tampão

Referências

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