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Artigo de método

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em

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DOI:

10.3791/52431

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5 de fevereiro de 2015

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1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

Neste artigo

Resumo

A co-expressão de proteínas é uma alternativa poderosa para a reconstituição in vitro de complexos proteicos e auxilia na realização de testes bioquímicos e genéticos in vivo. Aqui relatamos o uso da co-expressão de proteínas em Escherichia coli para obter complexos proteicos e ajustar a frequência de mutação das células.

Resumo

Relatamos aqui que a expressão de complexos proteicos in vivo em Escherichia coli pode ser mais conveniente do que experimentos tradicionais de reconstituição in vitro. Em particular, mostramos que a baixa solubilidade da subunidade ε da DNA polimerase III de Escherichia coli (com atividade de exonuclease 3'-5') é altamente melhorada quando a mesma proteína é co-expressa com as subunidades α e θ (com atividade de DNA polimerase e ε estabilizadora, respectivamente). Também mostramos que a co-expressão de proteínas em E. coli pode ser usada para testar eficientemente a competência de subunidades de diferentes espécies bacterianas para se associarem em um complexo proteico funcional. De fato, mostramos que a subunidade α da DNA polimerase III de Deinococcus radiodurans pode ser co-expressa in vivo com a subunidade ε de E. coli. Além disso, relatamos o uso da co-expressão de proteínas para modular a frequência de mutação em E. coli. Expressando a subunidade ε do tipo selvagem sob o controle do promotor araBAD (induzível por arabinose) e co-expressando a variante mutagênica D12A da mesma proteína, sob o controle do promotor lac (induzível por isopropil-tio-β-D-galactopiranosídeo, IPTG), fomos capazes de alterar a frequência da mutação de E. coli usando concentrações apropriadas dos indutores arabinose e IPTG. Finalmente, discutimos os avanços recentes e os desafios futuros da co-expressão de proteínas em E. coli.

Introdução

A introdução de tecnologias superexpressão potenciado quer os estudos bioquímicos de baixo número de cópias enzimas Número e a produção industrial de proteínas farmacologicamente activas (por exemplo, insulina). Desde o advento das tecnologias, avanços significativos foram conseguidos para aumentar o rendimento e a qualidade de proteínas recombinantes. Além disso, 1,2 procariotas e eucariotas 3 sistemas superexpressão foram desenvolvidos ao longo dos anos, oferecendo alternativas úteis para o "cavalo de trabalho" da biotecnologia proteína, ou seja, Escherichia coli. Em particular, a disponibilidade de plataformas alternativas para E. coli levou à produção de péptidos recombinantes ou proteínas de rolamento modificações pós-traducionais. No entanto, deve ser mencionado que a E. coli ainda representa o organismo de eleição para a produção de proteína recombinante. Isso se deve a vários fatores, entre os quais o mais relevante pode serconsiderado: i) a disponibilidade de um grande número de sistemas de sobre-expressão (vectores de expressão e estirpes) para E. coli 1,2; ii) vezes a curto geração e de alto rendimento de biomassa, de E. coli em uma variedade de mídia rica e sintética; iii) a manipulação fácil, quer a bioquímica e genética ao nível deste microrganismo; iv) o isolamento das estirpes capazes de produção de proteínas tóxicas 4; v) a construção de cepas que caracterizam indução homogênea a nível da população 5,6. Além disso, demonstrou-se recentemente que os sistemas de expressão adequados para a produção em E. coli de proteínas modificadas pós-tradução podem ser concebidos e construídos 2.

Actualmente, a sobre-expressão da proteína é utilizada, principalmente, para obter proteínas monoméricas ou homo-oligoméricas, cuja hypersynthesis pode ser realizado com um único gene clonado num plasmídeo adequado. No entanto, a atenção foi recentementepago para a construção de E. sistemas de proteína co-expressão de E. coli, desafiando a produção, in vivo, de complexos hetero-oligomérica 2. Curiosamente, os primeiros experimentos de proteína co-expressão se dirigiu à assembléia inter-espécies de grandes e pequenas subunidades de carboxylase cianobactérias ribulose-1,5-bisfosfato / oxigenase 7,8, ea associação de formas truncadas e de corpo inteiro de HIV-1 transcriptase reversa 9. Estes estudos pioneiros demonstrado que a co-expressão da proteína representa uma poderosa alternativa ao tradicional na reconstituição in vitro. Além disso, a proteína co-expressão em E. coli foi utilizado para produzir diferentes proteínas que ostentam modificações pós-traducionais 2, para se obter proteínas que contêm aminoácidos não naturais 2, e para aumentar o rendimento de proteínas de membrana overexpressed 2. Além disso, o potencial de co-expressão da proteína como uma ferramenta para conferir a E. coli competirnce na secreção de proteínas está sob investigação ativa 2.

Duas estratégias principais de co-expressão da proteína em E. coli pode ser prosseguido: i) o uso de um único plasmídeo para receber os diferentes genes a ser sobre-expresso; ii) a utilização de vários plasmídeos em células individuais para co-expressar as proteínas alvo. No primeiro caso, os critérios para a escolha do plasmídeo não diferem dos de experiências individuais tradicionais sobre-expressão da proteína, embora determinados plasmídeos contendo em tandem os elementos promotor / operador foram construídos para co-expressão de 10. Esta primeira abordagem é, portanto, bastante simples. No entanto, deve mencionar-se que o uso de um único plasmídeo de co-expressar proteínas diferentes enfrenta dois grandes problemas: i) a massa molecular do vector aumenta com o número de genes que alberguem, limitando o número de proteínas co-expressas; ii) quando vários genes foram clonados sob o controlo de um único promotor, de polaridade pode decreasum e a expressão dos genes distais do promotor. O uso de plasmídeos duplos ou múltiplos no único E. células de E. coli tem de realizar o grau de compatibilidade dos vectores de escolha, por conseguinte, a imposição de restrições para as combinações de plasmídeos elegíveis. No entanto, esta segunda estratégia de co-expressão apresenta a vantagem de conter a massa molecular de vectores, e limita polaridade. Construiu-se, recentemente, um sistema de co-expressão de proteínas concebido para facilitar o vaivém de genes entre os plasmídeos de co-expressão de 11. Em particular, nós construídos vectores da série pGOOD, as características relevantes dos quais são os seguintes: i) uma origem de replicação de p15A, para proporcionar a compatibilidade dos plasmídeos pGOOD com os vectores comerciais contendo a origem ColE1 (por exemplo, a série de pBAD 12); ii) uma cassete de resistência à tetraciclina; iii) a presença de lac -derived elementos reguladores, ou seja, o promotor-operador (O 1) casal eo lacI gene q. Usando um par pBAD-pGOOD disso, fomos capazes de overexpress o núcleo catalítico de E. coli ADN polimerase III, composto por três subunidades diferentes, ou seja, α (5'-3 'da polimerase), ε (3'-5' exonuclease) e θ (estabilizador ε) 13. Em particular, foi demonstrado que a co-expressão do complexo αεθ era estritamente dependente da adição à E. coli meio de cultura de ambos IPTG e arabinose, provocando a sobre-expressão de pBAD pGOOD e, respectivamente (Figura 1A).

No presente relatório, que ilustram como proteína co-expressão pode eficientemente resolver dificuldades relacionadas com a baixa solubilidade de uma proteína subunidade complexo. Além disso, mostramos como em testes de complementação de proteína vivo pode ser realizada, e, finalmente, um relatório sobre a utilização de proteínas co-expressão a frequência de mutação sintonizar E. coleu. Para tal, utilizou-se casais pGOOD-pBAD adequados para ilustrar exemplos relevantes de cada estudo de caso.

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Protocolo

1. Isolamento de E. coli co-transformantes

  1. Prepare células eletro-competente do E. apropriado coli estirpe a ser transformada. Transferência para 1 ml de meio LB (triptona, extracto de levedura, NaCl a 10, 5 e 10 g / L, respectivamente) de uma única colónia da estirpe de escolha, e incubar a 37 ° C sob condições de agitação de 180 rpm. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em 25 ml de meio LB fresco e incuba-se a cultura a 37 ° C.
  2. Na fase de log (0,6 OD) centrifugar a suspensão de células em 5000 xg durante 20 min), e ressuspender o sedimento em 10%, v / v arrefecido em gelo estéril de glicerol-água em metade do volume de cultura original. Repita este passo 4 vezes, reduzir para metade a cada vez que o volume de ressuspensão. Finalmente, ressuspender o sedimento em glicerol / água e dividir a suspensão de células em alíquotas de 50 ul. Armazenar as alíquotas a -80 ° C até 6 meses.
  3. Dissolve-se o plasmídeo pretendido em água estéril suplementado com 0,5 mM de EDTA. Thaw em ice uma alíquota de células eletro-competentes e misturar com uma quantidade apropriada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar a mistura em uma solução de 0,1 cm de percurso óptico adequado para a electroporação, e aplicam-se 1,8 kV.
  4. Transferir imediatamente as células electroporadas em 1 ml de meio SOC (meio LB suplementado com 0,2% w / v de glucose, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl), incubar durante 1 h sob agitação, e, finalmente, transferi-se alíquotas de 100 ul para placas de Petri contendo LB agar com o antibiótico apropriado. Incubar O / N a 37 ° C.
  5. Purifica-se os transformantes por estrias colónias únicas em placas de Petri.
  6. Prepare células eletro-competente dos transformantes primários e repita os passos 1.1 a 1.5 para transformar com outros plasmídeos.
  7. Prepare stocks de glicerol dos co-transformantes. Transferir uma única colónia em LB suplementado com os antibióticos apropriados, incubar a 37 ° C sob agitação, e a fase de log (0,6 OD) centrifugar a suspensão de células a 5000 x g durante 20 min. Resuspend o sedimento em meio LB-antibióticos contendo 15% v / v de glicerol. Dispensar em alíquotas e armazenar a - 80 ° C.

2. A co-expressão de α e ε Subunidades de E. coli ADN polimerase III

  1. Por meio de uma agulha esterilizada uma pequena quantidade do estoque de glicerol tensão adequada (por exemplo, TOP10 / pGOOD-ε243 e TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, veja a Figura 1) em uma placa de Petri contendo meio LB e antibióticos. Deixe secar células suspensão na placa de Petri, e raia as células gota. Incubar a 37 ° CO / N.
  2. Transferência, utilizando um palito estéril, uma única colónia para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar 8 horas a 37 ° C. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em meio fresco e incuba-se a 30 ° C durante 15 h.
  3. Adicionar IPTG, arabinose, ou arabinose e IPTG 1 mM cada. Incubar a 30 ° C durante 2,5 h. Recolher as células, e armazenar os peletes a -20 ° C.
  4. Descongelar as pelotas em gelo e ressuspender em tampão de lise (50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2,5 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), pH 8). Gentilmente homogeneizar a suspensão células com um oleiro vidro frio.
  5. Sonicar a 15 W durante 15 segundos, seguido por 15 segundos de intervalo de arrefecimento (4 ciclos).
  6. Centrifuga-se os extractos de proteína total a 10.000 xg durante 20 min, a 4 ° C para recuperar a fracção solúvel.
  7. Analisar por alíquotas de cada extracto de proteína solúvel em SDS-PAGE (12,5% de acrilamida). Para este objectivo, transferir 20 ul de cada extracto de proteína solúvel para tubos Eppendorf contendo 60 ul de H2O e 20 ul de tampão de carga (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) e ferver durante 5 min. Carga de 18 ul de cada amostra e realizar a electroforese a 140 V durante cerca de 1,5 h.

3. Co-expressão de α Subunidade de Deinococradiodurans cus ADN Polimerase III e ε Subunidade de E. coli ADN polimerase III

  1. Prepara-se uma pré-cultura de E. coli estirpe TOP10 / Dr pBAD-α / pGOOD-ε243 em 1 ml de meio LB-ampicilina-tetraciclina e incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir 1: 1000 em meio fresco e incubam O / N a 37 ° C.
  2. Dilui-se 1: 100 em 200 ml de meio fresco, incubar a 37 ° C durante 3 h, em seguida, induzir durante 3 horas com arabinose e IPTG, 1 mM de cada um. Colher as células, e armazenar o sedimento a -20 ° C.
  3. Ressuspender o pellet em 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogeneizar e perturbar as células conforme descrito em 2.4 e 2.5.
  4. Imediatamente centrifugar as células lisado a 10.000 xg durante 20 min. Desprezar o pelete. Filtra-se o sobrenadante com um funil de Buchner equipado com 3 camadas de papel de filtro. Aplicar vácuo suave. Para evitar a formação excessiva de espuma, manter o vácuo no frasco Erlenmeyer de gelo durante a filtração.
  5. Determinar a concentração de proteína de acordo com Bradford 14.

4. Cromatografia de Filtração em Gel

  1. Equilibrar um 16x70 encamisado-água (200) de coluna de filtração em gel com 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8. Carga na coluna o extracto de proteína solúvel. Para melhor resolução, use um loop de amostra de 1 ml. Realize a cromatografia em 0.6 ml / min. Manter a temperatura da coluna a 4 ° C durante toda.
  2. Recolha 0,9 ml frações e analisá-los por SDS-PAGE. Transferir 20 uL de cada fracção relevante para tubos Eppendorf contendo 60 ul de H2O e 20 ul de tampão de carga (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) de SDS, 50% ( v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) e fervura durante 5 min. Carga de 18 ul de cada amostra e realizar a electroforese a 140 V durante cerca de 1,5 h.
  3. Determinar a exonuclease 3'-5 e a actividade de polimerase de ADN de cada fracção em 96 nósll microplacas. Ensaiar a actividade de exonuclease 5'-timidina utilizando monofosfato de éster de p-nitrofenilo (p-NP PGT) como substrato 15. Estimar a actividade da polimerase de ADN, utilizando o PPX (pirofosfatase, purina nucleosídeo fosforilase, xantina oxidase) acoplado a enzima e ensaio de 16 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazólio (INT) como o aceitador de electrões 16.

5. Mutação análise de populações Co-expressam o Wild-tipo ε Subunidade de E. coli DNA polimerase III e mutagênicos εD12A Variant

  1. Transferir uma única colônia de E. coli TOP10 contendo o pBAD-ε e os pGOOD1-εD12A 11 vectores para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar O / N a 37 ° C.
  2. Dilui-se a pré-cultura de 1: 250 em três balões contendo meio fresco (10 ml), adicionar os indutores apropriados (arabinose, IPTG, ou arabinose e IPTG, 1 mM de cada um) e incubar a 37 ° Cdurante 8 h. Prepara-se culturas paralelas não induzidas.
  3. Recolhe alíquotas de 1 ml, depois dilui-se 1: 500 em novos frascos contendo meio fresco (10 ml) suplementado ou não com os indutores apropriados. Incubar O / N a 37 ° C.
  4. Repita os passos 5.2 e 5.3 e recolhem alíquotas de 1 ml.
  5. Determinar o número de gerações ocorreu em cada cultura. Transferir em placas de LB, 100 ul de diluições em série apropriadas de inoculo e cultura. Incubar O / N a 37 ° C. Contar as colónias nas placas de LB, e calcular o logaritmo do número de células presentes no inoculo (log I) e na cultura no final do crescimento (log C). Para determinar o número de gerações, usar a fórmula: (log C - log I) /0.301.
  6. Centrifugar a 5.000 xg durante 20 min e ressuspender as células em 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar as células, adicionar 2-3 gotas de clorofórmio e de vórtice durante 20 seg.
  7. Determinar a β-actividade de glicosidase cada aliquota numa microplaca de 96 poços, utilizando-se p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como substrato. Adicionar a cada poço 100 ul de células permeabilizadas e 100 ul de substrato (16 mg / ml em solução de H2O). Tome cuidado para evitar bolhas de ar nos poços. Ler a absorvância a 420 nm, utilizando um leitor de microplacas e o filtro apropriado.

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Resultados

A subunidade de E. ε coli DNA polimerase III é composto por 243 aminoácidos e possui baixa solubilidade em 17,18, a menos que os resíduos 187-243 são eliminados 17. Contudo, mostrámos previamente 11 que o co-expressão de α de comprimento completo, ε, e subunidades θ produz DNA polimerase III solúvel do núcleo catalítico (Figura 1). Em particular, usando o sistema de pBAD-pGOOD co-expressão, demonstramos que: i) a sobre-expressão de subunidades α e ε pod...

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Discussão

As proteínas podem ser intrinsecamente desordenados, caracteriza regiões cuja estrutura terciária não está restrita a um número limitado de conformações 25. Estas proteínas são geralmente desordenados propensos a agregação de 25, e o seu isolamento e caracterização pode representar uma tarefa difícil. A subunidade de E. ε DNA polimerase III coli apresenta dois domínios distintos 26,27, a saber: i) o domínio N-ter, tendo o 'exonuclease 3'-5, e competente na ligaç...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

A permissão da Springer e Elsevier para reimprimir figuras é muito reconhecido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ÁgarSigma-AldrichA1296
AmpicilinaSigma-AldrichA9518
ClorofórmioSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
GlicerolSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-ArabinoseSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
TetraciclinaSigma-Aldrich87128
Base Trizma Sigma-AldrichT1503
TriptonaSigma-Aldrich95039
Extrato de leveduraFluka70161
Solução de acrilamida 30%BioRad161-0158para eletroforese em gel
Persolfato de amônioBioRad161-0700Para eletroforese em gel
GlicinaBioRad161-0718para gel eletroforese
SDSBioRad161-0302Para eletroforese em gel
TEMEDBioRad161-0800Para eletroforese em gel
TrisBioRad161-0719Para eletroforese em gel
Cuvetes 0,1 cmBioRad1652089Para eletroporação
Centrífuga 5415REppendorf
Centrífuga Allegra 21RBeckman
Aparelho de cromatografia GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II eletroporaçãoBioRad
Microplate Reader 550Biorad
MiniProtean 3 célulasBioRad
Fonte de alimentaçãoBioRad
Sonicator 3000Misonix

Referências

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