Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

Resumo

Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.

Resumo

O estudo da ação do hormônio no peito humano tem sido dificultada pela falta de sistemas de modelos adequados. Após a cultura in vitro, células epiteliais mamárias primários tendem a perder a expressão de receptores hormonais. Amplamente receptores hormonais linhas celulares de cancro da mama positivo utilizados são de limitada relevância para a situação in vivo. Aqui, descrevemos um modelo ex vivo para estudar a ação hormonal no peito humano. Amostras frescas de tecido da mama humano a partir de material de descarte cirúrgico, tais como mamoplastias de redução ou mammectomies são mecanicamente e enzimaticamente digerido para obter fragmentos de tecido contendo ductos e lóbulos e vários tipos de células do estroma. Estes micro-estruturas dos tecidos conservados em meio basal sem fatores de crescimento preservar seus contatos intercelulares, a arquitetura do tecido, e permanecem hormônio que responde por vários dias. Eles são processados ​​prontamente para RNA e extração de proteínas, análise histológica ou armazenados em meio de congelamento. Fluorescênciaseparação de células activadas (FACS) pode ser usado para o enriquecimento em populações de células específicas. Este protocolo fornece uma abordagem simples, padrão para estudos translacionais com alta complexidade, amostras humanas variadas.

Introdução

Informações sobre a paisagem mutacional no câncer de mama está aumentando em ritmo acelerado. Menos atenção tem sido dada a fatores sistêmicos que influenciam o desenvolvimento do câncer de mama. A exposição a hormônios reprodutivos tem um grande impacto na progressão da doença ^1-3. No entanto, os mecanismos pelos quais as hormonas reprodutivas embatem na mama humano são mal compreendidos. Trabalho com modelos de engenharia genética do rato revelou que envolvem células sinalização intrínseca e paracrine por vários efectores a jusante ^4.

O conhecimento limitado sobre ação do hormônio no peito humano é largamente atribuível à falta de modelos adequados. A maioria dos trabalhos sobre os mecanismos de receptor de estrogénio (ER) e o receptor de progesterona (PR), a sinalização tem sido realizada com linhas de células positivas do receptor de hormona, cancro da mama, tais como MCF-7 e T47D. Estes foram obtidos a partir de derrame pleural de pacientes com câncer de mama avançado que tinha already recebeu vários tratamentos ^5. A importância biológica dos resultados obtidos em tais modelos in vitro simples da mama humano é genes questionáveis ​​e alvo identificados nestes modelos in vitro são diferem dos genes-alvo que são identificados em modelos animais ^6. Quando as células epiteliais mamárias humanas primárias são cultivadas in vitro tendem a perder a expressão de receptores hormonais e, portanto, resposta hormonal ^7,8. Este problema pode ser circumventd por abordagens 3D sofisticados usando matrigel. Desta forma, C. Clarke e colegas conseguiram estabelecer as células epiteliais da mama que mantiveram a expressão do receptor da hormona e que demonstraram uma resposta proliferativa para a estimulação da progesterona ^9. No entanto, importante em dois genes alvo in vivo do receptor da progesterona, Wnt-4 e RANKL, não foram induzidas por estimulação da progesterona no presente sistema ^9. Esta abordagem foi tomada recentemente em mais longe com in vitro pré-tratamento hormonal e indução RANKL foi alcançado ^10. A ressalva é que matrigel tem atividades que são dependentes do lote, é caro, e exige um projeto experimental que está apto apenas para o número de células pequenas.

Com base na descoberta de que em ER vivo e sinalização PR são largamente mediada por interacções parácrinos ^11, que argumentaram que as interacções intercelulares precisam de ser mantidas. Outro factor importante que é perdida como tecidos estão dissociados para células únicas para a cultura in vitro são as interacções de células epiteliais com a matriz extracelular; No entanto, estes são fundamentais para diferenciação epitelial e sua perturbação é importante na tumorigênese ^12. Com isto em mente, nós estabelecemos um método para isolar microestruturas tecido mamário a partir de material de descarte cirúrgico fresco ^13. O parênquima da mama, que consiste de um epitélio de duas camadas com o interior do lúmen e exterior myoepithelicélulas al, é dissecado a partir de tecido adiposo e submetido a dissociação mecânica e enzimática. Após a lavagem e centrifugação, fragmentos de dutos de leite são obtidos que manter interações estreitas com muitas células estromais. Estes micro-estruturas dos tecidos permanecem hormônio responsivo. O modelo foi validado em amostras clínicas ^13. Como tal, o presente processo pode ajudar a estudar a acção de hormonas na mama num contexto biológico e clinicamente relevante.

Protocolo

Considerações gerais: antes do tempo, o estabelecimento de um protocolo de ética, preparar questionários para os pacientes, e ver a formação do pessoal clínico. Antes de usar o material de cirurgia mamoplastia de redução, obter autorizações, e assegurar o consentimento do paciente. Tecido podem ser infecciosos e precisa de ser tratadas em conformidade. Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do ISREC - Instituto Suíço de Experimental Cancer Research.

1. Tissue Recovery, Processamento e Bio-banking

Para garantir a qualidade da amostra ideal para o bio-banking, uma série de passos são realizados no hospital antes do transporte para o laboratório.

No hospital:

1. Obter tecidos da mama humanos sob condições estéreis a partir de amostras de cirurgia mamoplastia de redução e de sangue, se necessário. Tissue precisa ser examinado pelo patologista que vai provar para excluir a presença de lesões malignas.
2. Coloque o peito de temitir sob o capô em uma placa de estéril e preparar tesoura, bisturi cirúrgico e pinças que já estão esterilizados com esterilizador a vapor. Faça profundo corte em diferentes locais do tecido mamário utilizando um bisturi para abri-lo. Em tecido mamário humano olhar para fios brancos que consistem em dutos e lóbulos, que são incorporados no tecido adiposo amarelo.
   Observação: A razão entre o parênquima branco para o tecido adiposo amarelo difere entre as mulheres; Normalmente as mulheres mais jovens têm mais tecido epitelial.
3. Escolha pedaços de material branco e mantê-los com uma pinça, então separá-los suavemente do tecido adiposo com uma tesoura. Evite tomar vasos sanguíneos.
4. Lavar peças de tecido em solução salina fosfato tamponada (PBS) pH 7,2 para remover o sangue. Transferir o tecido para garrafas de plástico de 250 ml contendo meio F12 (F12 Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) sem vermelho de fenol com 2% de penicilina / estreptomicina (incluindo 5.000 unidades / ml de penicilina e 5000 g / ml de estreptomicina) e 1% de umtibiotic / anfotericina B (incluindo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina, e 25 ug / ml de anfotericina B). Armazenar tecidos no meio de transporte para o laboratório.
5. Prepare pedaços de 3-5 mm de diâmetro para extração de RNA e proteína e flash congelá-los em cryovials com frio (gelo seco) isopentano. Transferi-los para a caixa de gelo seco durante o transporte para o laboratório.
6. Coloque pedaços de 3-5 mm no molde e cobri-lo com uma camada de Optimal temperatura de corte (OCT) e, em seguida, coloque o molde sobre o fundo plano da caixa cheia de isopentano frio. Após congelamento total transferir o molde para a caixa de gelo seco.
7. Fix 5 pedaços de 3-5 mm de diâmetro em paraformaldeído (PFA) 4% e mais 5 peças em formaldeído (FA) de 4% em PBS a análise histológica RT mais tarde. Dois diferentes fixadores são recomendados como alguns anticorpos trabalham melhor com um ou o outro dos dois.

No laboratório:

8. Fazercument todas as informações sobre a mamoplastia de redução, data da cirurgia e se as amostras são derivados de esquerda versus mama direita.
9. Coloque as amostras congeladas a -80 ° C e transferir os tecidos fixados em cassetes de histologia após 2 horas de fixação. Em seguida, colocá-los tanto em PBS ou etanol a 70%, para O armazenamento / N a 4 ° C. No dia seguinte, transferir as cassetes de histologia para instalações de histologia para inclusão em parafina.

2. Tissue Digestão e Hormone Estimulação

1. Transferem-se as garrafas contendo as amostras de tecido para uma câmara de fluxo laminar numa sala de cultura de células P2. Coloque pedaços de tecido sobre a tábua de cortar estéril (29 x 19 cm). Segure o material com uma pinça e raspar o restante gordura e vasos de distância do parênquima mamário (parte branca) com bisturi. Colocar o material branco em PBS numa placa de cultura de 10 centímetros.
2. Depois de retirar o material gorduroso de todas as peças e descartá-los de acordo com a norma de seguranças do laboratório, coloque as partes brancas contendo os tecidos epiteliais de volta na tábua de cortar. Usando bisturis opostas cortar o tecido e corte-a em pedaços de até 2 mm de diâmetro.
3. Inserir o material triturado em tubos de tamanho adequado: até 1, 2,5 e 10 ml para um 5, 15 ou tubos de 50 ml, respectivamente. Normalmente de 5 ml rendimentos tubo material suficiente para incrustação de parafina e hormonais estímulos, e de 15 ml produz tubos de material suficiente para fluorescência celular ativado (FACS). Tubos maiores são usados ​​para congelar alíquotas.
4. Preparar a mistura mestre digestão consistindo em meio (DMEM / F12 sem vermelho de fenol) com 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B e colagenase A (Clostridiopeptidase A de Clostridium histolyticum). Dose de colagenase de acordo com tempos de digestão.
   1. Para 12, 24, e 36 h de incubação, usar concentração final de colagenase de 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml, respectivamente. Adicionar mix mestre digestão até 4 vezes davolume do material digerido para assegurar a agitação e o arejamento adequado.
      NOTA: Dependendo do desenho experimental e a duração da estimulação hormonal, adicionar hormônios durante ou após a etapa de digestão e microestrutura de recuperação enzimática.
5. Adicionar hormona (s) a uma concentração desejada para testar amostras e o veículo de controlo. Para a estimulação com 17-β-estradiol, e promegestona (R5020) utilizar uma concentração final de 20 nM.
   NOTA: R5020 é um agonista do receptor de progesterona sintética, que é mais estável do que a progesterona natural em meio.
   1. Colocar os tubos sobre o misturador de rolos dentro de uma incubadora a 37 ° C e 40 rpm O / N. Antes de colocar as amostras no misturador, ressuspender-los muito bem para garantir que todo o material distribui ao longo dos tubos de centrífuga.
6. Como a digestão demora pelo menos 12 horas (O / N), por vezes de estimulação da hormona de menos de 12 horas, adicione os hormônios após a recuperação das microestruturas (deatado na etapa 3). Adicione os hormônios como você voltar a suspender as microestruturas e coloque a suspensão em placas ultra-baixas de fixação. Microestruturas dos tecidos podem ser mantidos em ultra-baixas placas de fixação para até 7 dias em meio de cultura livre de fator de preservação de cerca de 70% de viabilidade.
7. Para ARN e análise de proteínas, recolher microestruturas dos tecidos por centrifugação a 400 xg durante 5 min e flash congelamento em tubos de centrífuga.

3. Recuperação de microestruturas de tecidos

1. Centrifuga-se o tubo (s) a 400 xg durante 5 min. Aspirar a gordura a partir do topo do tubo de centrifugação e transferir o sobrenadante do sobrenadante aquoso remanescente, que é enriquecido em fibroblastos, para um novo tubo de centrífuga e centrifuga-se a 1250 xg durante 5 min.
   NOTA: Como as microestruturas do tecido mamário são muito pegajoso, para todas as etapas subseqüentes colocar o agregado agitando suavemente o tubo. Pipetting não é recomendada devido ao risco de perder o material.
2. Ressuspender as pelotas enriquecidas em microestruturas e em fibroblastos derivados de sobrenadante aquoso em PBS, 2% de Soro Fetal de Vitela (FCS). Subsequentemente girar em ambos os tubos 1250 xg durante 5 min e, em seguida, descartar os sobrenadantes.
3. Ressuspender as pelotas em 3-5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e transferi-los para tubos limpos. Incubar-los durante 5 min à TA.
4. Adicionar o volume de 2x PBS, 2% de FCS e centrifugar para a 1.250 xg durante 5 min. Lavam-se as peletes com PBS, FCS a 2% e centrifugação a 1250 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes.

4. As amostras de Citometria de Fluxo

1. Adicionar 1-2 ml de tripsina a 0,25% ao sedimento e misture por pipetagem cima e para baixo com muito cuidado para 2 min com um Pipetman 1.000 ul dissociar células.
2. Inibir a actividade da tripsina por adição de 9 ml de PBS, 2% de FCS. Centrifuga-se a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS, 2% de FCS.
3. Transferir a suspensão de células para um filtro de células de 40 mm colocada sobre top de um tubo de centrífuga de 50 ml para preparar células individuais. Se alguns microlitros de suspensão de células permanecem na parte superior do filtro, ajudá-los a passar através do filtro por aspiração los a partir do outro lado do filtro com uma pipeta e adicioná-los para as microestruturas filtrados.
4. Anticorpos células imunitárias separadas, fibroblastos e células endoteliais a partir de microestruturas com um cocktail de anticorpos anti-CD45, anti-PAF e anti-CD31 e depois separá-los com FACS, com base em pan-epitelial EpCAM marcador CD10 e para separar as células luminais e basais, respectivamente, ¹⁰ .

5. As amostras para histologia

1. Depois de se lavar o material mecanicamente e enzimaticamente digerido como descrito acima, a partir de peletes de fixar o material inicial de 1,5 ml em 1 ml de 4% de PFA em PBS à temperatura ambiente durante 30 min.
2. Centrifugar a 1.250 xg durante 5 minutos e lava-se com 1 - 2 ml de PBS, duas vezes.
3. Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min. Durante este tempo, preparar 1% multiusos de agarose em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) de tampão e aquecer a solução no forno de microondas até a solução começar a ferver.
   1. Remover a solução do forno microondas e agite o frasco suavemente para misturar a solução e voltar a suspender qualquer restantes partículas de agarose. Arrefecer a solução de agarose a 50 ° C e deitar 1 ml num molde da base de parafina dimensionada 31 × 23 × 13,5 milímetros.
4. Descartar o sobrenadante e colocar os sedimentos em cima da camada solidificada (1-3 mm) de agarose utilizando uma espátula com uma extremidade plana. Cobrir todas elas com uma camada adicional de agarose (40 ° C).
5. Após os solidifica de agarose, geralmente dentro de 5 min, colocar os blocos de agarose para as cassetes de histologia para parafina embedment. Junto com as amostras de agarose colocar um papel branco de escritório na cassete com todas as informações sobre o número de mamoplastia redutora, a condição experimental, e data escrita em letras pequenas a lápis; este documento foi escrito resiste todas as etapas de tratamento subsequentes.
6. Coloque as cassetes emPBS S / N, ou em etanol a 70% para armazenamento no fim de semana, a 4 ° C. Nós não notei nenhuma diferença entre as duas soluções de armazenamento. Em seguida, transferir cassetes histologia às instalações de histologia para inclusão em parafina.

6. As microestruturas congelamento (Futuro) Cultivar

1. Ressuspender as microestruturas de tecidos em meio consistindo em FCS com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e congelar em alíquotas de 1 ml criotubos congelação. O número de criotubos obtidas depende da quantidade de matéria-prima obtida a partir de mamoplastia de redução.
2. Congelar as criotubos contendo microestruturas dos tecidos utilizando um congelador de taxa controlada com o seguinte programa: 5 minutos a 4 ° habitação C, diminuindo a temperatura de -7 ° C com uma taxa de 6 ° C / min, diminuindo a temperatura a -12 ° C com taxa de 6 ° C / min, 10 min habitação, diminuindo a temperatura a -40 ° C com uma taxa de 6 ° C / min, a diminuição na temperatura de -80 ° C comtaxa de 6 ° C / min. Em seguida, transfira os cryovials a -80 ° C congelador.
3. No dia seguinte, a transferência dos criotubos de -80 ° C para o tanque de azoto líquido durante muito tempo de armazenagem.

Resultados

Para estudar o papel dos estrogênios e progesterona e compreender melhor suas funções moleculares no peito humano, coletamos amostras de tecido fresco de mama humano de pacientes submetidos a mamoplastias de redução (Figura 1), após aprovação do consentimento informado. Nós também obter história médica e reprodutiva do paciente, bem como uma amostra de sangue para determinar os níveis de progesterona no soro no momento da cirurgia. Tecido de mamoplastias de redução frescos é mecanicamente e enzimaticame...

Discussão

A cultura ex vivo descrito aqui fornece microestruturas dos tecidos mamários contendo ductos e lóbulos intactos, juntamente com outros tipos de células encontradas normalmente no peito fêmea humana. No processamento do tecido da mama humana obtidos geralmente de mamoplastias de redução, a remoção de tecido adiposo, a digestão enzimática e mecânica da matriz estromal, e a lise de células vermelhas do sangue enriquece para fragmentos de condutas de leite e unidades lobulares ductais terminais. Digestão enzimática...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga de Microlitros	Heraeus Biofuge Fresco	75005521
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810 000.327
Cryobox	Nalgene	5100-0001
Congelador de Taxa Controlada EF600 Grant	Asymptote	EF600
Incubadora CO2	Hera Cell Heraeus	51022391
Misturador de Rolos SRT9D	Sturt	SRT9D
de Histologia	Medizintechnik	81-0021-00
Cell Strainer	Falcon	352340
Lâmina Cirúrgica Strile	Aesculap	BB536
Bisturi	Aesculap	BB084R
Fórceps	Aesculap	BD047R
Tesoura	Aesculap	BC374R
Base de parafina molde	SAKURA	4166
Temperatura Ótima de Corte (OCT) Cryomatrix	Thermoscientific	6769006
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies	15070-063
Antibiótico/Antimicótico	Life Technologies	15240-062
DMEM F/12	Life Technologies	11039-021	Pré-aquecimento (37 ° C)
Colagenase	Roche	11 088 793 001	Pré-aquecimento (37 ° C)
Soro bovino fetal	Life Technologies	10270	pode ser substituído por
tampão de lise de sangue de células	Sigma	R7757
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054
Agarose	Invitrogen	16500-500
Formaldeído	Sigma	F1635
Paraformaldeído	Roth	335
Isopentano	Sigma	M32631
Etanol	Merck	1009831000
Frascos criogênicos (5,0 ml)	VWR, International	479-0820
Placa de cultura de fixação ultrabaixa	Corning, NY 14831	3471

de soro fetal