Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Resumo

Os exossomos são estruturas microvesiculares encontradas em biofluidos que potencialmente carregam importantes biomarcadores discriminatórios de doenças. Aqui, um novo método é usado para extrair especificamente exossomos e testar rapidamente a carga exossômica para ambos os alvos de RNA / proteína após a interrupção de exossomos usando ondas quadradas cíclicas elétricas não uniformes.

Resumo

Exossomos são estruturas microvesicular que desempenham um papel de mediação na comunicação intercelular. É de interesse para o estudo da carga interna de exossomos para determinar se eles são portadores da doença biomarcadores discriminatórias. Para a realização de análise exosomal, é necessário desenvolver um método para a extracção e análise de exossomas a partir de fluidos biológicos alvo sem danificar o conteúdo interno.

Libertação eléctrica induzida por campo e medição (Efirm) é um método para a extracção especificamente exossomas a partir de fluidos biológicos, descarregar as suas cargas, e testando o seu conteúdo de ARN / proteína interna. O uso de um anticorpo CD63 específico de micropartículas magnética anti-humana, exossomos são primeiro precipitado a partir de fluidos biológicos. Após a extracção, de baixa tensão ondas quadradas eléctricas cíclicos (CSW) são aplicados para romper a membrana vesicular e causar o descarregamento da carga. O conteúdo do exossoma é hibridado com iniciadores de ADN ou de anticorpos imobilizados numa superfície de eléctrodo para quantification de teor molecular.

O método Efirm é vantajoso para a extracção de exossomas carga e descarga para análise sem tampão de lise. Este método é capaz de efectuar a detecção específica de ambos os alvos de ARN e proteína de biomarcadores na exossoma. Efirm extrai exossomas especificamente com base nos seus marcadores de superfície, em oposição a técnicas baseadas em tamanho.

A microscopia electrónica de transmissão (TEM) e ensaio de demonstrar a funcionalidade do método de captura e análise de exossoma. O método foi aplicado para Efirm exosomal análise de 9 ratinhos injectados com células de pulmão humano H640 do cancro (uma linha de células transfectadas para expressar o marcador CD63 humano exossoma-GFP), a fim de testar o seu perfil contra exossoma 11 ratinhos que receberam controlos de solução salina. Níveis elevados de biomarcadores exosomal (GAPDH gene de referência e proteína de superfície do marcador CD63 humano-GFP) foi encontrado com o H640 injetaram em ratos em ambas as amostras de soro e saliva. Além disso, saliva e amostras de soro foram demonstradas ter linearidade (R = 0,79). Estes resultados são sugestivos para a viabilidade de biomarcadores de exossoma salivares para a detecção de doenças distais.

Introdução

Pesquisa exosome é um campo emergente de investigação que examina microvesículas lipídicas que carregam ^um RNA, DNA ^{2, 3} e proteína de carga. Inquéritos anteriores da biologia exosome levaram a identificação de exossomos em fluidos biológicos como sangue ^{4, 5} urina, leite materno ^{6, 7} e saliva. Estudos têm demonstrado que os exossomas desempenhar um papel em diferentes vias celulares, meditar remotamente a comunicação entre diferentes sistemas do corpo ^8. Devido ao papel exossomas desempenhar na comunicação intercelular, é a hipótese de que eles podem empacotar alvos biomoleculares (proteína, RNA e DNA) correlacionados com estados de doença. ³ in vitro e animal modelo ⁹ estudos parecem confirmar esta hipótese. Ao investigar o conteúdo exosomal para descoberta de biomarcadores, é necessário o desenvolvimento de uma metodologia para o isolamento exosome seletiva de fluidos biológicos, expulsi induzidona carga a partir de exossomas, e quantificação de biomoléculas de exossoma. No âmbito do presente trabalho, os exossomas irá ser definido como uma estrutura com um diâmetro de cerca de 70-100 nm e que possui marcador de superfície CD63.

Os investigadores tipicamente primeiro purificar os exossomas por ultracentrifugação ^{a 10} e, em seguida, processar o conteúdo exosomal através do uso de kits de tampão de lise. O uso de métodos de tampão de lise requer tempos de incubação variam de minutos a horas. Este processo pode potencialmente prejudicar carga exosome e levar para provar degradação. Por exemplo, o ARN exossoma salivar libertado através de tampão de lise para o ambiente extracelular circundante possui uma semi-vida de menos de 1 min, tornando a medição de ARN exosomal pós-tampão de lise uma tarefa particularmente difícil sem a adição de reagentes de estabilização ^11. O efeito combinado da adição de vários reagentes para lise e estabilização podem introduzir agentes que complicam e interferir com a Analysis de conteúdo exosomal. Uma abordagem alternativa pode ser útil para uma rápida descarga conteúdo exosomal e preservar a segurança da carga para caracterização.

Neste trabalho, propomos o uso de um campo elétrico não uniforme para a liberação de conteúdo exosomal. Elétrico-campos foram conhecidos para levar a capacidade de polarizar e perturbar a bicamada lipídica que forma as membranas celulares. Nosso trabalho experimental explora o uso de não-uniformes cíclicos ondas quadradas (CSW) para interromper a estrutura microvesículas de exossomos e liberando a carga transportada. Este método utiliza tensões na faixa de várias centenas de milivolts, o que significa que a maioria das biomoléculas não será interrompido. Nós demonstramos que o uso de uma onda quadrada-cíclico é capaz de accionar o conteúdo lançamento de ARNm salivar exossoma no ambiente circundante fluídica. Esta versão do conteúdo exosomal está perfeitamente integrado com um sistema de eletrodos que podem ser usados ​​para quantificar os níveis de expressão de biomarcadores ^12,13. Este método proposto permite, e tampão de lise análise livre rápido, sensível do conteúdo exosome.

Figura 1. Visão Geral do Efirm ^Workflow.. O método Efirm é dividida em três fases principais que são necessários para a purificação e análise de exossomos.

Este método de libertação conteúdo exosomal e análise baseada CSW é usado em conjunto com microesferas magnéticas específicos de CD63 para isolamento exossoma. Estes grânulos de CD63 por afinidade para permitir o isolamento selectivo de exossomas a partir de amostras salivares (e outros fluidos biológicos). Após a incubação e extração de exossomos usando as esferas magnetizadas, as contas são migrados para o sistema de sensor eletroquímico para a CSW baseado liberação de conteúdo e análise de parte do experimento. A Figura 1 apresenta uma visão geral do trabalhofluir do método Efirm.

Protocolo

1. magnética baseado no grânulo exossomo Extracção

1. Pipetar uma solução bem agitada de 5 mL de micropartículas magnéticas revestidas de estreptavidina em 495 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampão num tubo de microcentrífuga para ressuspender as esferas. Lavar e ressuspender as esferas com 500 ul de PBS três vezes usando uma cremalheira magnética. A cremalheira é uma matriz de magnetos na parte lateral de uma unidade de alojamento, que pode prender os tubos de amostra de microcentrífuga.
   1. Para cada lavagem, primeiro deixe-os tubos de sentar-se no rack para 1 min, e em seguida, usar uma ponteira para remover cuidadosamente o buffer sobrenadante sem perturbar as contas.
   2. Colocar os tubos em uma cremalheira regular sem ímãs na parte lateral. Adicionar 500 ul de PBS nos tubos, e usar a pipeta para misturar a solução e grânulos juntos. Em seguida, coloque os tubos de volta na prateleira magnética para separar novamente as contas a partir da solução.
   3. Realize esta remoção de tampão via magnetização e ressuspensão em PBS umtotal de três vezes. Isso realiza uma lavagem inicial das partículas magnéticas.
2. Ressuspender as pérolas em 490 ul de tampão PBS, com o tubo colocado na porção não magnetizada da cremalheira magnética. Pipet 5 l de rato biotinilado anticorpo anti-CD63 humano a 1,0 mg / ml de concentração de ações para a mistura de grânulos. Utilizar a pipeta para misturar os grânulos e anticorpo em solução.
3. Inserir os tubos de microcentrífuga com rebordo e mistura de anticorpo biotinilado num rotor amostra. Defina os parâmetros rotador para o rotator amostra para rotação recíproca a 90 ° de inclinação por 5 segundos e vibrando em 5 ° por 1 segundo. Rodar os tubos de amostra da mistura de pérolas a-esses parâmetros para 30 min à temperatura ambiente.
4. Remover o anticorpo não ligado após conjugação.
   1. Após 30 minutos de rotação, à TA, coloque os tubos em volta da cremalheira magnético durante 5 min.
   2. Executar três lavagens de grânulos através da remoção da fase líquida utilizando uma micropipeta e lava-se com 500 μ; L de PBS. Após a lavagem triplo, ressuspender as contas em 490 mL de caseína-PBS e coloque sobre a porção desmagnetizado do rack.
5. Extracção exossoma utilizando esferas revestidas com anticorpo.
   1. Escreva em cada tubo com ID amostra alvejado. Pipetar uma amostra de 10 uL de soro ou saliva no tubo de microcentrífuga. Utilizar a pipeta para misturar a amostra e as esferas magnéticas, pipetando várias vezes.
   2. Colocar os tubos de amostra com e anti-humanos esferas de anticorpo CD63 no rotador e rodar durante 2 horas à temperatura ambiente. Usar os mesmos parâmetros rotador como descrito no passo 1.2.
   3. Após 2 h de amostragem rotativa, fazer uma lavagem tripla através da magnetização de grânulos separados a partir da solução, a remoção de fase líquida com micropipeta, e ressuspensão de grânulos em 500 ul de tampão Tris-HCl. Os grânulos resultantes são agora ligado aos exossomos e estão prontos para o lançamento de campo elétrico e de medição.

2. Elétrica campo induzido Lançado umnd Medição de conteúdo Exosomal

1. A pré-cobertura inicial de Eletrodo com GADPH Primer
   1. Aplicar um poço de plástico para um conjunto de eléctrodos para impedir a contaminação cruzada dos eléctrodos individuais. Para esta experiência, use um eletrodo de matriz de 16-sensor com cada eletrodo unidade na matriz constituída por um, contador, e eletrodo de referência de trabalho feito de ouro nua.
   2. Prepare uma mistura de ações de 100 sonda nM DNA, 0,3 M KCl, e pirrol 10 mM por pipetagem reagentes de ações em um tubo com puríssima água destilada. Misture bem em vórtice.
      NOTA: Para este estudo, a sonda de DNA seleccionada corresponde ao gene GAPDH de referência, que é conhecida por existir dentro de exossomas. A sequência da sonda utilizada é: 5'-biotina-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Use esta mistura em todos os eletrodos.
   3. Pipetar 60 ul da mistura de sondas de ADN-monómero sobre a superfície de cada eléctrodo de ouro. Examine os eletrodos para garantir que haja uma cobertura adequada do trabalho, counter, os eléctrodos de referência e por a mistura líquida.
   4. Electropolymerize mistura de monómero-sonda para criar uma camada de polímero condutor sobre a superfície do eléctrodo por aplicação de uma onda quadrada (CSW) cíclico perfil do campo eléctrico para a superfície do eléctrodo. Este campo elétrico consiste na aplicação de 350 mV para 9 seg e imediatamente mudar para 950 mV por 1 segundo. Aplicar este perfil cíclico onda quadrada ao eléctrodo durante 10 ciclos, para um total de 100 segundos de campo eléctrico aplicado.
   5. Lavar superfície do sensor 3 vezes com água destilada e seca com azoto gasoso para remover o líquido da superfície do eléctrodo. Certifique-se que o líquido é adequadamente removida do eletrodo.
2. Exosome Carga Descarga
   1. Carga 5 uL de 1 uM de uma sonda de detecção em 495 uL da mistura de complexo de talão-exossoma e usar uma pipeta para misturar.
      NOTA: A sonda de detecção é uma sequência de iniciador de ADN conjugado com uma molécula de fluoresceína na extremidade 3 '. A prov detectore sequência utilizada para este estudo corresponde ao ARNm de GAPDH encontrado dentro de exossomas. A sequência da sonda detectora conjugada com fluoresceína é: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluoresceína-3 '.
   2. Pipeta 60 ul da sonda e mistura complexa talão-exosome em uma superfície do eletrodo de ouro com uma matriz ímã embaixo. Esta matriz ímã é constituído por dezesseis 2,54 milímetros de diâmetro de neodímio ímãs alinhados para corresponder aos eletrodos de trabalho do sensor. Figura 2A ilustra a colocação dos ímãs e solução talão-exosome.
   3. Uma vez amostra é carregado na superfície do eletrodo, aplicar 20 ciclos de campo elétrico CSW com 9 segundos a -300 mV e 1 seg a 200 mV (200 sec total). A carga exosomal que é libertado irá hibridar com os iniciadores na superfície do eléctrodo. Se os marcadores de superfície do exosome são objeto de investigação, pule esta parte do experimento. Figura 2B ilustra esse processo.
   4. Wash-off os analitos não ligados na superfície do eletrodo por triplo enxaguar a superfície do eletrodo com água destilada. Seque o eletrodo com gás nitrogênio.
3. Anticorpo repórter e Leitura
   1. Adicionar 60 ul de 150 unidade / anticorpo anti-fluoresceína conjugado ml de peroxidase de rábano (HRP em 1: 1000 de diluição) diluídos em caseína / PBS.
   2. Use um campo elétrico dirigido conjugação a HRP anti-fluoresceína complexo para o sanduíche de sonda. Aplicar -200 mV durante 1 segundo e 500 mV durante 1 seg durante 5 ciclos até à superfície do eléctrodo. A Figura 2A mostra os detectores de captura e complexos de sonda, tanto para um sistema de ácido nucleico e proteína.
   3. Superfície do sensor tríplice lavagem com água destilada e seque com gás nitrogênio.
   4. Após a lavagem-off de desacoplado excesso de anticorpo anti-fluoresceína, adicionar 60 ul de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Coloque esta substrato sobre a superfície de cada sensor com uma pipeta multicanal.
   5. Realizar leitura amperométrica da corrente através da medição da corrente do eléctrodo em -200 mV durante 60 segundos usando um potenciostato electroquímico capaz de medição simultânea de 16 canais. A Figura 2C é um exemplo de perfil de corrente durante a leitura.

Figura 2. Componentes de Efirm. Método (A) Método de extracção de exossomas usando biofluid CD63 anti-humano de micropartículas revestidas magnéticos e, em seguida, a descarga de carga exossoma utilizando ondas quadradas cíclicos aplicados ao complexo partícula-exossoma. (B) Esquema de eletrodo biosensor utilizado para detecção de alvos de RNA / DNA / proteína do exosome liberado. (C) Exemplo representativo de leitura amperometric da metodologia Efirm, onde maior magnitude atual corresponde to níveis mais altos de uma biomolécula. Este valor é a partir de Wei et al. ¹⁴ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Validação de exossomo Captação de contas usando TEM

Isolamento de exossomos de saliva usando CD63 esferas magnéticas anti-humanos foi validado seguindo o protocolo de extração, utilizando imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET). TEM mostra esferas magnéticas com grânulos 70-100 nm imediatamente adjacentes (ver Figura 3A, 3B e), de acordo com o perfil conhecido de exossomos. Não foram observados grânulos de 70-100 nm para as esferas magnéticas ...

Discussão

Como os resultados indicam, CD63 anti-humano revestido nanopartículas magnéticas são capazes de capturar especificamente pequenas partículas que têm um tamanho que varia 70-100 nm. Esta partícula capturado é consistente com o perfil observado anteriormente de exossomas. Além disso, o uso da CSW baixa voltagem após a captura das partículas é mostrado para removê-los da superfície do grânulo e provocar perfis de degradação de ADN semelhante ao de um método tradicional de tampão de lise com base para a libertação da carga....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de Leitor de 16 Canais Helios com Interface de Chip	Genefluidics, EUA&	nbsp; RS-1000-16
16x Chip Sensor, Bare Gold, pacote de 5 chips	Genefluidics, EUA	SC1000-16X-B
Biotinilado anticorpo CD63 humano	Ancell, EUA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, EUA	65601
Neodímio Magnetics (1/10" de diâmetro x 1/32" de espessura)	K& J Magnetics, EUA	DH101
Água Destilada Ultrapura	Life Technologies, EUA	10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution	Fisher Scientific, EUA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, EUA	W338605-100g
Anti-Fluoresceína-POD, Fragmentos de Fab	Roche, Alemanha	11426346910
substrato de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB/H2O2, baixa atividade)	Neogen, EUA	330175
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies, EUA	10010023
Caseína/PBS	Fisher Scientific, EUA	37532