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Artigo de método

Síntese de Indoxil-glicosídeos para Detecção de Atividades de Glicosidase

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DOI:

10.3791/52442

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27 de maio de 2015

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

Neste artigo

Resumo

Os glicosídeos indoxílicos são ferramentas bem estabelecidas e amplamente utilizadas para triagem enzimática e monitoramento da atividade enzimática. Especialmente para estruturas do tipo glicose, as sínteses anteriores provaram ser desafiadoras e de baixo rendimento. Nossa nova abordagem emprega ésteres de ácido indoxílico como intermediários preciosos para produzir um número considerável de glicosídeos indoxílicos em bons rendimentos.

Resumo

Os glicosídeos indoxílicos provaram ser ferramentas valiosas e versáteis para monitorar as atividades da glicosidase. As indoxilas são liberadas por hidrólise enzimática e são rapidamente oxidadas, por exemplo, pelo oxigênio atmosférico, em corantes do tipo índigo. Esta reação permite uma triagem rápida e fácil in vivo sem isolamento ou purificação de enzimas, bem como testes rápidos em placas de ágar ou em solução (por exemplo, triagem azul-esbranquiçada, micropoços) e é usada em bioquímica, histoquímica, bacteriologia e biologia molecular. Infelizmente, a síntese de tais substratos mostrou-se difícil, devido a várias reações colaterais e à baixa reatividade da função indoxil hidroxila. Especialmente para estruturas do tipo glicose foram observados baixos rendimentos. Nossa nova abordagem emprega éster de ácido indoxílico como intermediários principais. Ésteres de ácido indoxílico com padrões de substituição variados foram preparados em vias escaláveis. As glicosilações de transferência de fase com esses aceptores e haletos de glicosil peracetilados podem ser realizadas em condições comuns em altos rendimentos. A clivagem do éster e a subsequente glicosilação mediada por prata suave produzem os glicosídeos indoxílicos peracetilados em altos rendimentos. Finalmente, a desproteção é realizada de acordo com Zemplén.

Introdução

Durante muito tempo, a produção de índigo foi um processo economicamente muito importante. Antes que sínteses químicas em larga escala permitissem acesso barato ao índigo, precursores eram obtidos de fontes naturais desde épocas pré-cristãs. O cultivo de plantas produtoras de índigo (índigo natural) na Europa tornou-se desvantajoso a partir do século XVIIth século, já que a quantidade de precursores de índigo da planta indiana de índigo (0,2-0,8%) é cerca de 30 vezes maior. No final do século XIX, a síntese química do índigo suprimiu o cultivo convencional1,2.

Os precursores da índigo que ocorrem naturalmente em plantas incluem a índican (1), a insatana A (2) e a isatana B (3) (Figura 1). Todos eles consistem em um grupo indóxil ligado a um resíduo glicosídico. A clivagem da ligação glicosídica, por exemplo por hidrólise enzimática, leva à liberação do indóxil (4). O próprio indóxil é quase incolor, mas pode ser rapidamente oxidado para formar um corante índigo (5). Essa reação sensível tem sido adaptada em bioquímica, histoquímica, bacteriologia e biologia molecular para monitorar atividades enzimáticas. É possível realizar triagens de atividade in vivo sem isolamento ou purificação das enzimas, bem como testes rápidos em placas de ágar ou em solução (por exemplo, triagem azul-branca, microplacas). Dependendo do resíduo (por exemplo, ésteres, glicosídeos, sulfatos) ligado ao grupo indóxil, foram desenvolvidos substratos adequados para diferentes classes de enzimas (por exemplo, esterases, glicosidases, sulfatases)3. A seguir, o foco será na formação e aplicação dos glicosídeos de indóxil.

Diagrama do processo de hidrólise da indicana mostrando derivados de índole e formação do corante índigo.
Figura 1: Precursores naturais de índigo e formação do corante índigo por hidrólise. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

O padrão de substituição da porção indoxil determina a cor e as propriedades físicas do corante índigo resultante. Os padrões de substituição mais comuns são 5-bromo-4-cloro (abreviado por X; azul-esverdeado), 5-bromo (azul) e 5-bromo-6-cloro (magenta), já que esses formam as partículas de corante menores, não formam grânulos e apresentam a menor difusão a partir dos locais de hidrólise. A última propriedade é especialmente importante para experimentos in vivo3.

O primeiro relato de um método indigênico para detecção de atividade de esterase foi publicado em 1951 por Barrnett e Seligman, que utilizaram acetato e butirato de indoxil4. Cerca de uma década depois, o princípio indigênico foi adaptado para a localização de glicosidase de mamíferos5. Até hoje, diversos glicosídeos de indoxil foram desenvolvidos, embora sua síntese tenha se mostrado difícil. A maioria das sínteses baseia-se no uso de um indoxil N-acetilado como aceptor e o respectivo doador de haleto de glicosila6-14. A glicosilação é realizada em acetona com hidróxido de sódio. Nessas condições, ocorre uma série de reações laterais, reduzindo significativamente o rendimento. Especialmente para estruturas do tipo glicose, foram relatados rendimentos de glicosilação muito baixos (ex.: 15% para (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-gluco-piranosídeo6 e 26% para (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetil-β-ᴅ-xilobiosídeo14 em um exemplo mais recente). Por meio de uma abordagem inovadora, utilizando ésteres de ácido indoquílico, um número considerável de glicosídeos de indoxil foi preparado com bons rendimentos (ex.: (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-gluco-piranosídeo com rendimento de 57%).

O seguinte protocolo descreve a síntese direta do éster alila do ácido indoílico (5-bromo-4-cloro) e, com base nisso, a síntese de uma glicosídeo de indoxil (X-Gal). Um experimento modelo simples demonstra a reatividade enzimática da β-galactosidase utilizando X-Gal.

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Protocolo

Observações gerais:

Todas as reações foram realizadas com capela e equipamento de proteção individual adequado. Todos os reagentes e solventes (p.a.; teor de água para solventes secos: MeCN <50 ppm; et2o <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) foram comprados de fontes comerciais e usados conforme recebidos. A TLC foi realizada em placas Merck sílica gel 60 F254. Os compostos foram detectados por UV e/ou por tratamento com EtOH/H2SO4 (9:1) e posterior aquecimento. A cromatografia em coluna foi realizada com sílica gel Merck/Fluka 60 (malha 230-400). As filtrações foram realizadas com funil de Büchner e bomba aspiradora. Os solventes foram removidos empregando um evaporador rotativo (40 °C, ~200 rmp). Os produtos foram secos em alto vácuo (bomba de palhetas rotativas). Reações que requerem solventes secos foram realizadas sob atmosfera de argônio.

A seguir, descreve-se a síntese de X-Gal (16) empregando éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico (12). Para outros compostos com padrões de substituição variados, bem como ésteres metílicos preparados de acordo com esta sequência sintética, ver ref.17-19.

1. Aceptor: Síntese de éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico18 (12)

  1. N-acetilação: síntese de N-(4-bromo-3-cloro-2-metilfenil)-acetamida (6)
    1. Dissolver 10,0 g (45,7 mmol) de 4-bromo-3-cloro-2-metilanilina em 30 ml de diclorometano.
      Cuidado! O diclorometano é prejudicial e resfria a solução em um banho de gelo.
    2. Adicione 6,50 ml (68,7 mmol) de anidrido acético gota a gota e deixe a mistura aquecer até a temperatura ambiente. A mistura pode ser mexida por 8 horas ou durante a noite. Cuidado! O anidrido acético é corrosivo e inflamável.
    3. Remova o solvente e recristalize de acetato de etila 9: 1 / metanol (rendimento: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), sólido incolor).
      Cuidado! O acetato de etila é irritante e inflamável. Cuidado! O metanol é tóxico e inflamável.
  2. Oxidação: Síntese de ácido N-acetil-5-bromo-6-cloro-antranílico (7)
    1. Refluxo: uma mistura de 2,30 g (8,76 mmol) de 6 (produto obtido na etapa 1.1) e 2,10 g (8,52 mmol) de MgSO4•7H2O em 40 ml de água em um balão de fundo redondo de 3 gargalos equipado com resfriador e funil de gota.
    2. Adicionar 50 ml de solução saturada de KMnO4 gota a gota em água à mistura de reacção durante um período de 3 horas. Em seguida, aqueça por 2 horas adicionais sob refluxo, cerca de 135 ° C banho de óleo. Cuidado! O permanganato de potássio é prejudicial e oxidante.
    3. Resfrie à temperatura ambiente e filtre a pirolusita (MnO2), que é formada durante a reação.
      Cuidado! A pirolusita é prejudicial.
    4. Adicionar ácido clorídrico (37%) ao filtrado até pH 1, filtrar o produto e secar em vácuo, (rendimento: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), sólido incolor).
      Cuidado! O ácido clorídrico é corrosivo.
  3. Desacetilação: Síntese de ácido 5-bromo-6-cloro-antranílico (8)
    1. Dissolver 3,90 g (13,3 mmol) de 7 (produto obtido do passo 1.2) em 70 ml de solução aquosa de hidróxido de sódio 1 N e aquecer a cerca de 100 °C (banho de óleo) durante 5 h
      Cuidado! O hidróxido de sódio é corrosivo.
    2. Resfrie à temperatura ambiente e adicione ácido clorídrico (37%) até pH 1, depois filtre o produto com um funil Büchner e seque no vácuo (rendimento: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), sólido incolor).
  4. Formação de anidrido: síntese de anidrido 5-bromo-6-cloroisatoico (9)
    1. Suspender 8,17 g (32,6 mmol) de 8 (produto obtido no passo 1.3) em 33 ml de acetonitrila seca.
      Cuidado! A acetonitrila é prejudicial e inflamável.
    2. Agitar à temperatura ambiente e adicionar 5,3 ml e uma solução de 3,22 g (10,8 mmol) de trifosgénio em 18,5 ml de diclorometano seco gota a gota simultaneamente durante um período de 30 minutos. Em seguida, aquecido por 3 horas a 50 °C (banho de óleo). Cuidado! A piridina é nociva e inflamável.
      Cuidado! O trifosgênio é tóxico e pode liberar fosgênio.
    3. Remova cerca de 75% do solvente e apague a reação adicionando 100 ml de água destilada e filtre seu produto. Lave com uma pequena quantidade de diclorometano frio.
    4. Seque o produto no vácuo, (rendimento: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), sólido incolor).
  5. N-alquilação: síntese de anidrido 5-bromo-6-cloro-N-[(metoxicarbonil)alil]-isatoico (10)
    1. Dissolver 25 g (90 mmol) de 9 (produto obtido no passo 1.4) em 250 ml de dimetilformamida anidra e arrefecer em banho de gelo.
      Cuidado! A dimetilformamida é prejudicial e inflamável
    2. Adicione 1,15 equivalentes de hidreto de sódio (60% em parafina) em porção.
      Cuidado! O hidreto de sódio é corrosivo e inflamável; reação pesada com água/gelo.
    3. Após 30 min de agitação a 0 °C, deixe aquecer à temperatura ambiente e adicione 1,2 equivalentes de bromoacetato de alilo gota a gota.
    4. Depois de mexer por 5 horas, sacie a reação adicionando 500 ml de água destilada e filtre seu produto.
    5. Lave com água (3 vezes, 100 ml) e seque o produto a vácuo, (rendimento: 93% (31,5 g, 84,1 mmol), sólido incolor).
  6. Abertura de anidrido: Síntese de éster alílico de ácido 5-bromo-6-cloro-N-(metoxicarbonilalil)-antranílico (11)
    1. Dissolver 10 g (27 mmol) de 10 (produto obtido no passo 1.5) em 100 ml de álcool alílico.
      Cuidado! O álcool alílico é prejudicial e perigoso para o meio ambiente.
    2. Adicione 350 mg (8,70 mmol) de hidreto de sódio (60% em parafina) em porção.
    3. Depois de mexer por 6,5 horas ou durante a noite, remova o solvente.
    4. Submeter o produto bruto a cromatografia em coluna (coluna 30 x 6 cm; 240 g de sílica) éter de petróleo/acetato de etilo 2:1; RF = 0,66), (rendimento: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), óleo amarelo).
      Cuidado! O éter de petróleo é inflamável, irritante e perigoso para o meio ambiente.
  7. Condensação de Dieckmann: Síntese de éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico (12)
    1. Misturar 3,0 g (7,7 mmol) de 11 (produto obtido no passo 1.6) e 1,75 g (15,6 mmol) de terc-butóxido de potássio em 100 ml de éter dietílico seco.
      Cuidado! O terc-butóxido de potássio é corrosivo e inflamável.
      Cuidado! O éter dietílico é prejudicial e extremamente inflamável.
    2. Aquecer a mistura em refluxo (mais frio) durante 2 horas a 40-45 °C.
    3. Remova cerca de 75% do solvente e adicione ácido clorídrico diluído (100 ml, 1 M).
      Cuidado! Não seque completamente, pode ocorrer decomposição.
    4. Filtrar o produto e secar em vácuo, (rendimento: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), sólido incolor a ligeiramente esverdeado).

2. Indoxil-glicosídeo: síntese de X-gal17

  1. Glicosilação por transferência de fase: Síntese de (éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indox-3-ílico) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galactopiranosídeo (14)
    1. Misturar 400 mg (1,21 mmol) do alilester 12 do ácido indoxílico (produto obtido na etapa 1.7), 410 mg (1,21 mmol) de hidrogenosulfato de tetrabutilamónio e 500 mg (1,21 mmol) do doador 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-ᴅ-galactopiranosil brometo (α-acetobromogalactose) em 10 ml de diclorometano. Cuidado! O hidrogensulfato de tetrabutilamônio é prejudicial.
    2. Adicionar 10 ml de uma solução aquosa de carbonato de potássio (1 M).
      Cuidado! O carbonato de potássio é corrosivo.
    3. Agitar à temperatura ambiente até ao consumo completo do dador (TLC: éter de petróleo/acetato de etilo).
    4. Separar a fase orgânica (ampola de separação), secar sobre Na2SO4 e remover o solvente.
    5. Submeter o produto bruto a cromatografia em coluna (éter de petróleo/acetato de etilo 1:1; RF = 0,33). (rendimento: 86% (690 mg, 1,04 mmol), sólido incolor).
  2. Clivagem e descarboxilação de éster: síntese de (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galactopiranosídeo (15)
    1. Dissolver 600 mg (0,908 mmol) de 14 (produto obtido na etapa 2.1) em 15 ml de tetra-hidrofurano seco.
      Cuidado! O tetrahidrofurano é prejudicial e inflamável.
    2. Adicione 800 μl de morfolina e 105 mg (9,09 μmol) de tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) e mexa durante a noite em temperatura ambiente.
      Atenção! A morfolina é inflamável e corrosiva.
    3. Remova o solvente.
    4. Adicione 400 mg (2,40 mmol) de acetato de prata, 800 mg (5,79 mmol) de carbonato de potássio e 10 ml de anidrido acético.
      Cuidado! O acetato de prata é irritante e perigoso para o meio ambiente.
    5. Aqueça a 90-100 °C por 20 min.
    6. Após o resfriamento à temperatura ambiente, diluir com diclorometano.
    7. Lavar a mistura duas vezes com água e uma vez com solução diluída de NaHCO3 (10%).
      Cuidado! O bicarbonato de sódio é corrosivo.
    8. Secar a fase orgânica sobre Na2SO4 (filtro) e remover o solvente.
    9. Submeter o produto bruto a cromatografia em coluna (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (rendimento: 88% (495 mg, 8,00 mmol), sólido incolor).
  3. Desacetilação de Zemplén: Síntese de (5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-β-ᴅ-galactopiranosídeo (16)
    1. Dissolver 396 mg (0,436 mmol) 15 (produto obtido na etapa 2.2) em 10 ml de metanol.
    2. Adicione uma quantidade catalítica de metanolato de sódio e mexa durante a noite em temperatura ambiente.
      Cuidado! O metanolato de sódio é inflamável e corrosivo.
    3. Neutralizar com Amberlite IR-120 H+ (filtro) e concentrar.
      Cuidado! Amberlite IR-120 H+ é irritante.
    4. Seque o produto em vácuo, (rendimento: 87% (170 mg, 0,416 mmol), sólido incolor).

3. Ilustrando o Experimento do Modelo: Prova de atividade da β-galactosidase empregando X-Gal

  1. Prepare uma solução de 0,5 mM de X-Gal em tampão de 500 μl (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; NaCl 50 mM, ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM; ou qualquer outro tampão adequado para sua enzima) em um tubo de microcentrífuga (X-Gal pode ser dissolvido em alguns μl de dimetilsulfóxido).
  2. Adicionar 1 μl de β,1-3-galactosidase (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml; ou qualquer outra β-galactosidase adequada) e agitar (600 rps) a 37 °C.
  3. Siga a reação. O corante do tipo índigo é formado após um curto período de tempo.

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Resultados

As primeiras sínteses de indicano e 5-bromo-indicano foram publicadas por Robertson já em 1927 e 192915,16. Ao empregar o éster metílico do ácido indoílico como aceitador, a posição reativa 2 foi bloqueada, suprimindo parcialmente reações laterais. A glicosilação em acetona/hidróxido de sódio, seguida de desproteção e descarboxilação (160 °C, anidrido acético, 1 h) e, por fim, desacetilação, forneceu indicano e 5-bromo-indicano. Com base nesse conceito, desenvolvemos uma síntese aprimorada de glicosídeos de in...

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Discussão

Devido aos baixos rendimentos e limitações, especialmente para estruturas do tipo glicose e sacarídeos mais complexos, uma nova abordagem sintética para glicosídeos indoxil foi desenvolvida. Os ésteres de ácido indoxílico provaram ser intermediários-chave preciosos e foram obtidos em uma via modular e escalável. Todas as etapas são de alto rendimento e, devido a materiais de partida baratos e fácil trabalho, são possíveis sínteses de vários gramas. A vantagem da abordagem de éster de alilo é o bloqueio da posição 2 reati...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O apoio a este trabalho da Glycom A/S, Copenhague, Dinamarca, é gratamente reconhecido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anidrido acéticoGrü ssing10298Acetonitrila corrosiva e inflamável
Sigma-Aldrich608-001-00-3Álcool
alílicoAldrich453021Nocivo, perigoso para o meio ambiente
Amberlite IR-120 H+Fluka06428
Ácido bromoacéticoMerck802260Corrosivo, tóxico, perigoso para o meio ambiente
4-Bromo-3-cloro-2-metilanilinaABCRAB 171687
DiclorometanoACROS326850010
Éter dietílicoGrü ssing10274
DimetilformamidaACROS348430010
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich41648
Acetato de etilaSigma-Aldrich607-022-00-5Irritante, inflamável
Ácido etilenodiaminotetracéticoAppliChemA1103.0500Irritante
β 1,3-galactosidase, recombinante, E. coliCalbiochem345795
Ácido clorídricoVWR20252.290Corrosivo
Sulfato de magnésio hidratadoMerck105885
MetanolACROS326950010Tóxico, inflamável
MorfolinaJanssen Chimica15.868.57Corrosivo, inflamável
Éter PeroleumAzelis111053Inflamável, irritante, perigoso para o meio ambiente
Carbonato de potássioGrü ssing12005
Permanganato de potássioGrü ssing12056Nocivo e oxidante
Terc-butóxido de potássioMerck804918Corrosivo, inflamável
PiridinaSigma-Aldrich613-002-00-7Nocivo, inflamável
Acetato de prataFluka85140Irritante, perigoso para o meio ambiente
Bicarbonato de sódioGrü ssing12144
Hidreto de sódioMerck814552corrosivo e inflamável
Riedel-de Hä ptS181200
Metanolato de sódioMerck806538Sulfato
de sódioGrü ssing12175
Tetrabutylammonium hydrogensulfateLancaster5438Harmful
TetrahydrofuraneSigma-Aldrich87371Nocivo, inflamável
Tetrakis (trifenilfosfina)paládio(0)Sigma-Aldrich216666
TriphosgeneFluka15217Tris
tóxico (hidroximetil)aminometano cloridratoSigmaT-3253Irritant
nocivo e inflamável irritante Irritante nocivo prejudicial e extremamente inflamável corrosivo corrosivo Hidróxido de sódio corrosivo corrosivo e inflamável

Referências

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