Aqui descrevemos um protocolo eficiente e versátil para induzir, monitorar e analisar novos glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que absorvem o plasmídeo, transformam-se, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.
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Artigo de método
Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Existe uma necessidade urgente de testar a contribuição de novos genes para a patogênese e progressão dos glioblastomas humanos (GBM), o tumor cerebral primário mais comum em adultos com prognóstico sombrio. Novas terapias potenciais estão surgindo rapidamente da bancada e exigem testes sistemáticos em modelos experimentais que reproduzem de perto as características salientes da doença humana. Aqui descrevemos em detalhes um método para induzir novos modelos de GBM com integração mediada por transposon de DNA plasmidial em células da zona subventricular de camundongos neonatais. Apresentamos uma maneira simples de clonar novos transposons passíveis de integração genômica usando o sistema de transposons da Bela Adormecida e ilustramos como monitorar a captação de plasmídeos e a progressão da doença usando bioluminescência, histologia e imuno-histoquímica. Também descrevemos um método para criar novas linhagens celulares primárias de GBM. Idealmente, este relatório permitirá uma maior disseminação do sistema de transposons da Bela Adormecida entre os pesquisadores de tumores cerebrais, levando a uma compreensão profunda da patogênese e progressão do GBM e ao projeto e teste oportunos de terapias eficazes para os pacientes.
Introdução
O glioblastoma multiforme (GBM) é o (60%) de tumor cerebral primário mais comum em adultos, com uma sobrevivência média de 15-21 meses, quando tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia e 1. Os novos tratamentos para GBM são imperativos. Terapias experimentais requerem testes em modelos animais que se reproduzem de forma adequada as principais características da doença humana. Estratégias para induzir GBM em roedores incluem mutagênese química com agentes alquilantes, germline ou alterações genéticas somáticas, ou transplante utilizando linhas celulares de glioma 2. Os modelos mais correntemente utilizados empregam a implantação de linha....
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Protocolo
NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pela Universidade de Michigan Comitê para o Uso e tratamento dos animais (UCUCA).
1. Clonagem da sequência de interesse em novos dormir Transposons Beleza
Observação: para inserir genes ou elementos inibidores (como shRNA), utilizando o sistema de transposase Bela Adormecida, clonar a sequência de interesse para a espinha dorsal de uma pKT ou pT2 plasmídeo. Dirigir a clonagem de tal modo que os elementos reguladores, o gene de interesse e marcadores permanecem flanqueado pelas repetições invertidas (IR / DR). Um exemplo de clonagem PDGFβ em uma espinha dorsal ....
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Resultados
Para caracterizar as alterações histopatológicas de glioblastomas induzidas-SB, ratinhos neonatais C57 / BL6 foram injectados em P1 com um plasmídeo que codifica a luciferase (pT2 / SB100x-Luc), em combinação com plasmídeos codificando os transposons com ADN oncogénico, ou seja, NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) ou um plasmídeo que codifica uma p53 curto hairpin PDGFβ e com um repórter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) em combinação com NRAS (Figura 3d).<.......
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Discussão
Neste artigo, que detalhe um método versátil e reprodutível para a geração de novos modelos de GBM utilizando integração mediada SB transposase- de ADN plasmídeo oncogénica em células vizinhas da zona subventricular dos ratinhos neonatais. Nós apresentamos um protocolo para gerar plasmídeos transposon com novos genes de interesse, ilustrar como monitorar a progressão dos tumores em animais vivos, e como caracterizar características histopatológicas e imuno-histoquímica destes tumores.
Como n.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. John Ohlfest e à Dra. Stacey Decker13 pelo generoso presente de plasmídeos e pelo treinamento fornecido para dominar este método. Agradecemos a Marta Dzaman pela ajuda na padronização do procedimento de coloração de hematoxilina-eosina de seções embebidas em parafina. Também agradecemos a Molly Dahlgren por ler este manuscrito e fornecer sugestões úteis. Este trabalho é apoiado por doações do NIH / NINDS para MGC e PRL, doação da Leah's Happy Hearts Foundation para MCG e PRL. Prêmio de jovem investigador da Alex's Lemonade Foundation e bolsa da St. Baldrick's Foundation para CK.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Padrão de Laboratório da Stoelting com Adaptadores de Rato e Mouse | Stoelting | 51670 | Outras empresas produzem quadros semelhantes, qualquer um deles com pequenos adaptadores de mouse são adequados |
| Injetor Estereotáxico Quintessencial (QSI) | Stoelting | 53311 | As injeções podem ser feitas sem ele, mas O injetor automático permite maior reprodutibilidade e conveniência |
| 10 μ l Seringa de MICROLITRO montada à mão da série 700 | Hamilton | Modelo 701 | Este modelo de seringa fornecerá de 0,5 a 500 ul de solução de forma confiável. Outras agulhas (por exemplo, 5 ul, Modelo 75) também podem ser usadas |
| agulha hipodérmica de calibre 30 (1,25", 15o chanfro) | Hamilton | S/O# 197462 | Esta agulha é ideal para perfurar a pele e o crânio de um camundongo neonatal sem a necessidade de outros procedimentos invasivos. Se ficar opaco (não entrar facilmente na pele), precisa ser substituído. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfecção | 201-10G | Alíquota em pequenos volumes e manter a -20 oC |
| D-Luciferina, Sal de Potássio | Goldbio.com | LuckK-1g | Outras fontes de lucifierase de vaga-lume são igualmente adequadas Solução de |
| Hematoxilina, Harris | Modified Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Microscopia Eletrônica Composta | Ciências | 62550-01 | Para incorporar cérebros para criosseccionamento e imuno-histovhemistia |
| DMEM/F-12 avançado, sem glutamina | Vida Tecnologias | 12634-010 | Para a cultura de neuroesferas |
| B-27¨ Suplemento (50X), sem soro | Life Technologies | 17504-044 | Suplemento sem soro para a cultura de neuroesferas |
| N2 Suplemento (100x) | Life Technologies | 17502-048 | Suplemento sem soro para a cultura de neuroesferas |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | Agente anti-micoplasma para a cultura de neuroesferas |
| Humano recombinante EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | Suplemento de fator de crescimento para a cultura de neuroesferas |
| Humano Recombinante FGF-básico | PEPROTECH | 100-18B | Suplemento de fator de crescimento para a cultura de neuroesferas |
| [header] | |||
| HyClone HyQTase Reagente de Desprendimento de Células | Thermo Scientific | SV3003001 | Para a dissociação de neuroesferas |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | Para a dissociação de tumores recém-dissecados Filtros de |
| de falcão tamanho de malha 70 um | Fisher Scientific | 08-771-2 | Para gerar suspensões de células únicas de neuroesferas dissociadas |
| Xilenos Grau histológico | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocolo Harris Hematoxilina Mercúrio livre (acidificado) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocolo Solução Eosyn Y (intensificada) | Fisher Scientific | 314-631 |
Referências
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Ri....
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Reimpressões e permissões
