Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo Caenorhabditis elegans

Resumo

Descrevemos as etapas detalhadas de um ensaio químico de alto rendimento no nematóide Caenorhabditis elegans usado para avaliar a toxicidade da linha germinativa. Neste ensaio, a interrupção da função germinativa após a exposição química é monitorada usando um repórter fluorescente específico para embriões aneuploides.

Resumo

A identificação da toxicidade reprodutiva das milhares de substâncias químicas presentes em nosso ambiente tem sido um dos desafios mais tentadoras no campo da saúde ambiental. Isto é devido em parte à falta de sistemas modelo que podem (1) recapitulam precisão chaves características dos processos reprodutivos e (2) fazê-lo em um meio a high-throughput forma, sem a necessidade de um elevado número de animais vertebrados.

Descrevemos aqui um ensaio no nemátodo C. elegans que permite a rápida identificação de substâncias tóxicas da linha germinal por monitorização da indução de embriões aneuplóidicos. Ao fazer uso de uma linha repórter GFP, erros na segregação cromossoma resultante da interrupção da linha germinativa são facilmente visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência automatizada. Assim, o rastreio de um determinado conjunto de compostos para a sua toxicidade pode ser realizada num formato de placa de 96 a 384 poços numa questão de dias. Análise secundária de h positivoseu pode ser realizado para determinar se as anomalias cromossómicas originado meiótica perturbação ou de erros iniciais de segregação cromossoma embrionárias. Ao todo, este ensaio representa uma estratégia de primeira passagem rápida para a rápida avaliação da disfunção germline seguinte exposição a substâncias químicas.

Introdução

Há cerca de 87.000 produtos químicos registrados para o comércio nos Estados Unidos, mas apenas um pequeno número destes foram testados quanto aos efeitos potenciais sobre a saúde ^1. Daqueles que foram testados, apenas uma parte foi avaliada para efeitos de saúde reprodutiva, em parte devido à dificuldade em determinar a alteração dos eventos precoces reprodutivas em mamíferos, especialmente durante o desenvolvimento de células germinativas femininas e diferenciação. Na verdade, os primeiros eventos da meiose ocorrem durante os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário em mamíferos do sexo feminino e são, portanto, de difícil acesso e coletar em números adequados para fins de rastreio.

A linha germinativa proporciona a ligação crucial entre gerações, e a sua função apropriada depende da execução precisa do programa intrincado da divisão celular e alterações cromossómicas denominado meiose. A desregulação do processo meiótico pode resultar na redução da fertilidade e da produção degametas e embriões com um número anormal de cromossomos, uma condição denominada aneuploidia. Erros de segregação cromossômica na meiose são altamente relevantes para a saúde humana. Anormalidades cromossômicas são comuns, com uma frequência de 1 em cada 150 nascidos vivos, Trissomia 21, 18 e 13, bem como X e Y erros de cromossomos, sendo os tipos mais prevalentes ^2,3. Além disso, malformações congênitas, incluindo os de origem cromossômicas, são a principal causa de morte infantil em os EUA ⁴ A idéia de que as influências ambientais podem afetar a segregação e do comportamento cromossômico não é nova ^5, mas ainda é pouco compreendida. Assim, é fundamental investigar qual dos produtos químicos introduzidos no nosso ambiente estão a interferir com a fertilidade humana, o desenvolvimento precoce e saúde reprodutiva em geral.

À luz dessas limitações dos modelos de mamíferos, temos desenvolvido um ensaio de tela de alto rendimento para testar a toxicidade reprodutiva na lombriga C. elegans. Temos mobilizou várias características importantes oferecidos por este sistema modelo genético comumente utilizadas, tais como seu pequeno tamanho, baixo custo, ciclo de reprodução curta, alta proporção de células germinativas e facilidade de manipulação ^6. Os vermes podem ser cultivadas em placas de 96 poços ou em culturas líquidas de alto volume e por causa de sua transparência pode ser visualizado directamente em placas para a detecção de repórteres fluorescentes. O ensaio descrito a seguir aproveita estas características e tira vantagem de uma estirpe repórter que contém o sem-fim fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar perturbações da linha germinal e indução de aneuploidia embrionária.

A utilização desta estirpe repórter é baseada na ocorrência rara geralmente de machos na população verme principalmente hermafroditas. Estes homens (<0,2%) originam naturalmente de erro na segregação do cromossomo X ^7. No entanto, como a interrupção da linha germinativa frequentemente leva a erros na segregação dos autossomose de heterochromosomes, correlaciona-se ambos com uma incidência elevada de machos do fenótipo (X missegregation), bem como a letalidade embrionária (autosome missegregation). Para detectar facilmente a indução de machos, contornando o problema da letalidade embrionária, um promotor específico do macho (Xol-1) é utilizado para conduzir a expressão da GFP em embriões precoces ainda contidos no interior do útero do sem-fim. Como tal, o aparecimento de embriões que expressam GFP é utilizado como um substituto para a presença de embriões aneuplóidicos. Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados na manutenção da linha germinal e meiose ^8,9. Adaptado para filtragem de produtos químicos, esta estirpe é empregue numa forma de tela de alto rendimento. É importante ressaltar que a cepa relata fielmente a aneugenicity de produtos químicos e é, portanto, relevante para endpoints reprodução de mamíferos ^10. O ensaio descrito aqui será particularmente útil para toxicologistas em configurações da indústria química farmacêutica e à procurapara avaliar rapidamente a toxicidade dos produtos químicos para com terminais reprodutivos. Além disso, este ensaio se alinha totalmente com as prioridades governamentais destacadas na toxicidade no ^st relatório 21 do século ^11.

Protocolo

1. Preparação da alimentação Bactérias

NOTA: Esta seção descreve a preparação de bactérias alimentam (E. coli OP50).

1. Isolar uma única colônia de E. coli estirpe OP50 a partir de um caldo de lisogenia (LB) e agar de placa inocular assepticamente em 300 ml de caldo LB autoclavado.
2. Permitir que a cultura inoculada a crescer durante a noite num agitador a 200 rpm e 37 ° C, até que é atingida a saturação.
3. Transfira a OP50 em 6 estéreis, pré-pesado de 50 ml tubos cônicos. Sedimentar as bactérias por centrifugação durante 5 min a 6000 rpm (5000 xg).
4. Descartar o sobrenadante e lava-se as bactérias com 50 ml de M9 estéril. Repita duas vezes.
5. Após a segunda lavagem remover o restante M9, assegurando que nenhum M9 é deixado no tubo.
6. Determinar o peso do sedimento por pesagem do tubo contendo o sedimento de bactérias e subtrair o peso do tubo de 50 ml.
7. Ressuspender o pellet in M9 a uma concentração de 100 mg / ml.
8. Guardar a solução OP50 a 4 ° C até ser utilizado para a cultura sem-fim.

2. Preparação de crescimento de nemátodos Médias Plates (NGM) Petri

NOTA: Esta seção descreve a preparação de placas NGM Petri, que são as placas onde o C. elegans vermes são rotineiramente mantidas em laboratório.

1. Autoclave o meio agar NGM.
2. Utilizando procedimentos de esterilização, dispensar 17 ml de solução de agar NGM em seis centímetros placas de Petri utilizando uma bomba peristáltica.
   NOTA: uma quantidade constante de agar nas placas reduz a necessidade de reorientar o microscópio quando se muda de uma placa para outra.
3. Deixar as placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para deixar o agar solidificar e permitir que o excesso de humidade se evapore.
4. Semente as placas NGM usando uma técnica estéril. Aplicar 1-2 gotas de OP50 cultura líquida e espalhado utilizando uma vareta de vidro. Certifique-se que nãopara espalhar o relvado bactérias todo o caminho para as extremidades das placas.
5. Permitir que o relvado OP50 a crescer durante 1-2 dias à temperatura ambiente antes de utilizar as placas de crescer vermes.

3. Elaboração de um População Worm Synchronous

NOTA: O ciclo de vida de C. elegans é constituída pela fase embrionária, quatro estádios larvares (L1-L4) e na idade adulta. Esta seção descreve a preparação de uma população síncrono-idade de worms. Todos os materiais que entram em contacto com C.elegans após o tratamento de branqueamento deve ser estéril.

1. Dia 1 - Preparação de Gravid Worm População
   1. Utilizar placas NGM em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 faminto.
   2. Colete as larvas L1 com um verme esterilizado escolher e transferi-los para novas placas de 6 cm NGM semeado com OP50. Incubar durante cerca de 65 horas a 20 ° C até que a maioria dos vermes são adultos grávidos. Paraevitar placa superlotação e permitir que os vermes de crescer sem esgotar as bactérias, não transferir mais do que um ou dois grupos de larvas L1 para cada placa NGM fresco.
2. Dia 4 - Criação de um Synchronized L1 Larvas População
   1. Recolha os vermes grávidas a partir das placas NGM, lavando-as com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cônico de 15 ml.
   2. Deixe os vermes fêmeas grávidas sedimentar para o fundo do tubo de 15 ml durante aproximadamente 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme.
   3. Transfira o pellet worm para 2-4 microtubos e adicionar 1 ml de água sanitária / solução de NaOH. Incubar durante 2-3 minutos à temperatura ambiente. Monitorar o progresso da reação, ao microscópio estereoscópico para confirmar todos os vermes estão mortos. Não lixívia mais de 5 min como os embriões poderiam morrer.
   4. Recolha os vermes por centrifugação por 1 min a 3.000 rpm (900 xg). Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução estéril para M9neutralizar a reacção.
   5. Lave os vermes duas vezes por centrifugação durante 1 min a 3000 rpm (900 xg).
   6. Remover o sobrenadante e adicionar a M9 até 100-200 ul.
   7. Usando uma pipeta de pasteur de vidro adicionar uma gota do verme / M9 misturar para limpar placas NGM e incubar durante pelo menos 24 horas a 20 ° C para permitir que os embriões para eclodir.
      NOTA: Sem comida crescimento das larvas será interrompido na fase L1.
3. Dia 5 - Criação de um Synchronized L4 Larvas População
   1. Recolhe-se o larvas L1 a partir das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml.
   2. Deixe a vermes adultos mortos sedimentos para o fundo do tubo cónico de 15 mL durante aproximadamente 5 min.
   3. Recolhe-se o sobrenadante, em que os vermes são L1, em um novo tubo cónico de 15 ml, e precipitar os vermes por centrifugação durante 2 min a 2600 rpm (1000 xg).
   4. Remover o sobrenadante leendo cerca de 500 ul.
   5. Determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas.
   6. Ajustar a concentração dos vermes para vermes 20-25 / ul e adicionar 50 ul de o sem-fim / M9 mistura para placas NGM semeados com OP50.
   7. Incubar durante 65 horas a 15 ° C (por meio de incubação a fim-de-semana) para permitir que a população sincronizada L1 a crescer até atingirem a fase de L4.

4. Exposição de Worms para Chemicals em placas de 96 poços

NOTA: Esta seção descreve o uso de Pxol1 :: repórter transcricional GFP contendo C. elegans estirpe para pesquisar a indução de aneuploidia.

1. Recolhe-se o larvas L4 das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml.
2. Deixe a L4 vermes sedimentos para o fundo doTubo de 15 ml por cerca de 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme.
3. Adicionar 3-5 ml de M9 e determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas de cada amostra.
4. Ressuspender os vermes, a uma concentração de 1.000 / ml em vermes M9.
5. Diluir as bactérias OP50 da seção 1 10 vezes com M9. Certifique-se que as bactérias em ressuspensão atingir a temperatura ambiente, porque temperatura mais baixa afeta o desenvolvimento worm.
6. Usando uma pipeta de canais múltiplos, primeiro adicionar 100 ul do verme / mistura M9 (a partir do passo 4.4) e, em seguida, adicionar 400 ul das OP50 bactérias diluídas (a partir do passo 4.5) em cada poço de uma 2 ml de fundo redondo profunda placa de 96 poços. No final, cada poço terá 100 vermes em 500 ul.
7. Adicionar 0,5 uL de quer o produto químico de teste ou de controlo apropriado para os poços desejados, para alcançar uma concentr definitiva sugeriução de 100 pM, uma concentração utilizada em telas químicos em C. elegans ^12. Expor etanol ou controlos de solvente de DMSO a uma concentração final de 0,1%.
   NOTA: Recomendamos a utilização de nocodazole (100 M) como controle positivo.
8. Selar a placa usando película adesiva. Certifique-se de selar a placa bem para evitar a contaminação cruzada entre os poços.
9. Enrole a placa com papel alumínio.
10. Transferir a placa para um agitador (170-180 rpm) de uma temperatura adequada para o período de tempo adequado (24 ou 65 horas). A temperatura da sala afecta o crescimento dos vermes; manter a temperatura a cerca de 20 ° C.

Aquisição 5. Imagem de grávidas Worms em 384 poços Placa

NOTA: Esta secção descreve o uso de um elevado teor de microscópio de imagem exposto a Pxol1 :: vermes gfp, para visualizar a expressão da GFP nos embriões no útero de hermafroditas adultos. Paracada placa de 384 poços a serem rastreados, vermes de utilizar placas de 4 x 96 poços.

1. Após a exposição a substâncias químicas com o agitador, deixar a placa de 96 poços repouso durante 10-15 minutos para permitir que os vermes adultos para sedimentar para o fundo da placa.
2. Usando uma pipeta de canais múltiplos, remover 350 ul da M9, ​​sendo muito cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa.
3. Lave os vermes com 1 ml de M9 e repita o passo 5.1.
4. Usando uma pipeta de canais múltiplos, 1 ml de remover o M9, sendo vey cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa.
5. Usando uma pipeta de canais múltiplos, ressuspender os vermes no restante M9 e recolher 100 uL do verme / M9 mistura a partir das placas de 96 poços e carregá-lo nas cavidades de paredes pretas de / fundo transparente placa de 384 poços. Repetir o processo de utilização de vermes das placas 4 x 96 cavidades, até que todos os poços da placa de 384 poços foram carregadas.
   NOTA: É importante que todos os poços, para ter o mesmo volume, a fim de aumentar aeficiência e velocidade do autofoco durante o processo de aquisição de imagem. Cada poço deverá conter entre 80 a 100 vermes.
6. Adicionar 1 ml de levamisol (100 uM) a cada poço e deixar os vermes incubar durante aproximadamente 30 min.
   NOTA: Levamisol actua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes.
7. Transferir a placa com um alto teor de microscópio de campo amplo capaz de fornecer imagem automatizado.
8. Para aquisição de imagem, use uma aquisição e análise de imagem de software alto teor de acordo com as orientações do fabricante. Selecione o objetivo 4X para adquirir uma imagem por poço.
9. Antes de iniciar a aquisição de imagem, ajustar os parâmetros de imagem GFP para 45 ms de exposição e resolução de imagem de 2160 x 2160.
10. Recolher os dados como o número de vermes positivas para GFP divididos pelo número total de vermes no poço, sendo a última medida relativamente consistente entre poços.

Resultados

Exposição do Pxol-1 :: GFP estirpe repórter de agentes químicos, tais como o veneno de microtúbulos Nocodazole (Figura 1) leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP no útero de hermafroditas adultos expostos em comparação com controlo de DMSO. Os embriões GFP positivas são significativamente mais brilhantes do que a fraca fluorescência de fundo observada em outros embriões, assim como a auto-fluorescência observada no intestino dos animais. Vermes são expostos directamen...

Discussão

O método aqui descrito constitui a primeira estratégia de grande escala para a identificação de substâncias tóxicas da linha germinal. Ele requer o uso de um transgênico GFP Pxol-1 :: GFP contendo tensão que relata fielmente a indução de aneuploidia em embriões, que é usado como um proxy para a disfunção da linha germinativa. O método envolve a sincronização cuidadosa de um C. população sem-fim elegans e exposição dos vermes aos agentes químicos em formato de 96 poços seguido pela imagem dos v...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri ventiladas de 60 mm, de borda afiada	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96 poços transparentes com fundo redondo 2 ml de polipropileno placa de poço profundo	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptona	Apex	20-261
Bacto-triptona	Fisher Scientific	BP1421-2
Alvejante	Clorox
Cloreto de cálcio (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Colesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Centro		de Genética de Caenorhabditishttp://www.cbs.umn.edu/cgc
Etanol 200 prova	VWR	EM-4455S
	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Cloridrato de levamisol	Fluka	31742
Sulfato de magnésio anidro (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress Aquisição de imagem de alto conteúdo e Software de análise	Molecular Phosphate
monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Películas de rayon para culturas biológicas	VWR	60941-086
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Estereomicroscópio	Nikon	SMZ 745	Este microscópio tem uma forma de ampliação total de 3,35X a 300X. Qualquer microscópio com características semelhantes funcionará.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP cepa repórter	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Extrato de levedura	Becton Dickinson	212750