Artigo de método

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

DOI:

10.3791/52451

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19 de abril de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

Neste artigo

Resumo

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Para investigar a permeabilidade da barreira hemato-retiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doença da retina, usamos várias variantes de vírus adeno-associados (AAV) como ferramentas para rotular neurônios da retina e glia. A expressão gênica repórter mediada por vírus é então usada como um indicador da permeabilidade da barreira retiniana.

Resumo

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Células de Müller são as principais células gliais da retina. Os finais pés formam os limites da retina nas membranas limitantes exteriores e interiores (ILM), e em conjunto com os astrócitos, células endoteliais e pericitos eles estabelecer a barreira hemato-retiniana (BRB). BRB limita o transporte de material entre a corrente sanguínea e da retina, enquanto o ILM actua como uma membrana basal que define histologicamente a fronteira entre a retina e a cavidade do vítreo. Rotular células de Müller é particularmente relevante para estudar o estado físico das barreiras da retina, uma vez que estas células são uma parte integrante da BRB e a ILM. Ambos BRB e ILM são freqüentemente alterados em doenças da retina e são responsáveis ​​por sintomas da doença.

Existem vários métodos bem estabelecidos para estudar a integridade do BRB, tais como o ensaio de azul de Evans ou angiografia com fluoresceína. No entanto, estes métodos não fornecem informações sobre o grau de permeabilidade BRB to moléculas maiores, em escala nanométrica. Além disso, eles não fornecem informações sobre o estado de outras barreiras da retina, tais como a ILM. Para estudar a permeabilidade ao lado BRB ILM da retina, utilizou-se um método baseado AAV que fornece informações sobre a permeabilidade do BRB para moléculas maiores, enquanto que indica o estado das proteínas e de ILM da matriz extracelular em estados de doença. Duas variantes de AAV são úteis para tal estudo: AAV5 e ShH10. AAV5 tem um tropismo natural para os fotorreceptores, mas ela não pode passar para a retina externa, quando administrada no vítreo quando a ILM está intacto (ou seja, em retinas de tipo selvagem). ShH10 tem uma forte tropismo para células gliais e rotular selectivamente glia Müller em ambas as retinas saudáveis ​​e doentes. ShH10 prevê a entrega gene mais eficiente em retinas onde ILM está comprometida. Essas ferramentas virais juntamente com imunohistoquímica e-DNA do sangue análise lançar luz sobre o estado das barreiras da retina na doença.

Introdução

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Células de Müller são o principal componente da glia da retina. Morfologicamente, a envolver o retina radialmente e sua endfeet, em contacto com o vítreo, enfrentar o ILM e componentes secretos do último. A ILM é uma membrana basal composta por cerca de dez diferentes proteínas da matriz extracelular (laminina, agrina, perlecano, nidog�io, colagénio e proteoglicanos de sulfato de heparina vários). Durante o desenvolvimento, a sua presença é indispensável para a histogénese de retina, a navegação de axónios óptica, e a sobrevivência de células ganglionares 1-3. No entanto, não é essencial na ILM adulto retina e pode ser removido cirurgicamente em determinadas patologias, sem causar danos na retina 4. Em terapia génica, esta membrana torna-se uma barreira física para a transdução eficiente da retina utilizando AAV por injecção intravítrea 5.

Através da vasta arborização de seus processos, as células de Müller fornecer suppo nutricional e regulamentarrt para ambos os neurónios da retina e células vasculares. Müller células estão também envolvidas na regulação da homeostase da retina, na formação e manutenção da BRB 6. Junções apertadas entre as células endoteliais dos capilares da retina, células de Müller, astrócitos e pericitos formar o BRB. BRB impede certas substâncias de entrar nas retina.In muitas doenças como a retinopatia diabética, oclusão da veia da retina e doenças respiratórias, hipóxia da retina provoca fuga através do BRB 7-9. Esta ruptura é associada com um aumento da permeabilidade vascular que conduz ao edema vasogénico, descolamento da retina e danos na retina.

Células de Müller estão fortemente associados com os vasos sanguíneos e a membrana basal, desempenhando um papel importante tanto na integridade BRB e ILM. Consequentemente, marcação das células gliais de Müller é particularmente relevante para o estudo do estado físico dessas barreiras da retina.

Clássicoaliado, BRB permeabilidade é medida utilizando o ensaio de azul de Evans que consiste em injecção sistémica de corante azul de Evans, que se liga de forma não covalente à albumina do plasma. Este ensaio mede a perda de albumina (proteína de tamanho intermediário, ~ 66 kDa) de vasos sanguíneos na retina (ver protocolos Seção 5) 10. Como alternativa, o vazamento vascular podem ser visualizados por angiografia fluorescência retinal atestando por vazamento de fluoresceína (molécula pequena, ~ 359 Da; consulte Protocolos Seção 6) 11. No entanto, ambos os métodos permitem a avaliação da permeabilidade BRB para pequenas moléculas e proteínas, mas eles não fornecem informações sobre a integridade ILM.

Assim, para estudar BRB permeabilidade, foi utilizado um método com base de AAV que dá informação sobre a permeabilidade BRB para moléculas maiores (por exemplo, partículas de AAV, 25 nm de diâmetro). Partículas de efeito, o nosso método pode detectar a presença de AAV de transgene no sangue, o que sugere que ~ 25 nm de diâmetro fariaser capaz de se infiltrar na corrente sanguínea. Este método também proporciona informação sobre a estrutura da ILM e proteínas da matriz extracelular em condições patológicas. Duas variantes de AAV são úteis para tal estudo: AAV5 e ShH10. Subretinally injetado, AAV5 tem um tropismo natural para fotorreceptores e epitélio pigmentar da retina 12, mas não pode passar para a retina externa quando administrada no vítreo no tipo selvagem retinas com ILM intacta 5,13. ShH10 é uma variante de AAV que foi concebida especificamente para alvejar células gliais mais neurónios 14,15. ShH10 etiquetas selectivamente células de Müller em ambas as retinas saudáveis ​​e doentes com maior eficiência em retinas com barreiras comprometidos 16. Essas ferramentas virais juntamente com immuhistochemistry e análise em DNA de sangue fornecer informações sobre o estado das barreiras da retina e do seu envolvimento na doença (Figura 1).

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Protocolo

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Todos os animais utilizados neste estudo foram atendidas e tratadas de acordo com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research.

1. Produção de AAV recombinante (rAAV) por transiente transfecção de células HEK-293 17,18

NOTA: Ver McClure C, Jove (2011) 19.

  1. Purifica-se uma preparação de plasmídeo em larga escala (pelo menos 1 mg / ml) dos plasmídeos de vector de AAV. Use 3 plasmídeos. O plasmídeo ajudante de AAV carregando os genes de replicação e da cápside sem o terminal invertida de AAV ITRs repete, a cassete de expressão do transgene transportando o ITR de AAV referida como o plasmídeo de transferência, o plasmídeo e fornecendo os genes de adenovírus ajudante E2, E4, e os genes de ARN AV referido como pHELPER.
  2. Transfectar células 293 com estas três plasmídeos utilizando polietilenoimina (ou outro reagente de transfecção). Acima de 80% de eficiência de transfecção é necessário para uma boa viyields ral.
  3. Purifica-se o AAV recombinante a partir de 293 de lisados ​​de células em um gradiente de iodixanol. 15%, 25%, 40%, 60% e o iodixanol é usado para obter o gradiente. Recolha 40% fracção contendo iodixanol partículas de AAV, concentrar a fracção após ultracentrifugação a 500.000 xg durante 1 h e troca de tampão contra PBS (solução salina tamponada com fosfato) com 0,001% de Pluronic.
  4. Para determinar título genômico viral 20, realizar uma DNAse ProteinaseK digest seguido por qPCR. Os iniciadores directo e inverso, amplificar a região de 62 pb situada na ITR de AAV2. Para o plasmídeo padrão, a sonda é marcada com FAM e tem um extintor buraco negro (BHQ).
  5. Efectuar qPCR (reacção em cadeia da polimerase quantitativa) em um volume final de 25 ul usando 340 nM de iniciador reverso ITR, 100 nM iniciador ITR para a frente, de 100 nM de sonda de AAV2 ITR, dNTPs 0,4 mM, MgCl2 2 mM, 1x tampão de Taq Platinum, 1U platina Taq e 5 template ul (padrão, amostra e sem controle template).
  6. Parao padrão, usar o plasmídeo para a transfecção de 7 x 10 diluições em série (cada 5 ul de 2 x 09-2 outubro 3 x 10 genomas / ml resultando numa concentração final de 10 outubro - 10 abril genomas / ml).
  7. Inicie o programa por um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 15 min, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C em 1 min de recozimento e / extensão a 60 ° C durante 1 min. Armazenar a 4 ° C durante um armazenamento de curto prazo ou a -20 ° C durante longos períodos de armazenamento.

2. Injeção intravítrea de AAV

  1. Anestesiar ratos C57BL6J com cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificar a perda do reflexo de endireitamento, o reflexo de retirada da cauda e pitada de resposta, indicando uma anestesia adequada. Dilatar alunos pela aplicação da córnea de neosynephrine 5% e 0,5% mydriaticum colírio. Use vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
  2. Passe um G disposab ultrafine 30le agulha através do equador e próxima ao limbo, na cavidade vítrea (ver Chiu K, Jove (2007) 21). Injectar 1 ul estoque contendo 1 a 4 x 10 11 pv de ShH10-GFP ou AAV5-GFP com a observação directa da agulha no centro da cavidade vítrea (Figura 1). Use um olho como um controle para experimentos de ILM. Injectar ambos os olhos para experimentos BRB. Aplicar um tratamento tópico anti-inflamatório e anti-bacteriano em olhos injetados.
  3. Dilatar alunos com neosynephrine e mydriaticum colírio para geração de imagens. Realizar exames de fundo de olho com uma câmera de fundo de olho para seguir GFP (proteína verde fluorescente) expressão, 1 semana, 2 semanas, 1 mês e 2 meses após a injeção intravítrea (Figura 1). Sacrifício ratos por inalação de CO2 1 a 2 meses pós-injecção.

3. A imuno-histoquímica

  1. Para criosecções retina (Figura 1), dissecar olhos enucleados para remover lens e córnea, e imersão em solução de 4% de paraformaldeído durante uma hora.
    1. Cryoprotect os olhos previamente fixados em 10% de sacarose durante 1 hora à temperatura ambiente, 20% de sacarose para outra hora à temperatura ambiente. Cryoprotect em solução de sacarose a 30%, durante a noite a 4 ° C. Congelar e eyecups incorporar na incorporação de resina, como Cryo-matriz. Faça 10 mm criosecções e montagem em lâminas com tratamento especial para cortes de tecidos congelados e que melhorar a aderência do tecido durante a coloração.
    2. Permeabilizar secções com Triton X100 a 0,1% em PBS pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2x com PBS e bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente, em PBS com 1% de BSA, 0,1% de Tween 20.
  2. Para flatmounts da retina (Figura 1), fixar os olhos enucleados em paraformaldeído a 4% durante 15 minutos para facilitar a dissecação.
    1. Em 15-30 minutos, dissecar os olhos para remover a córnea e do cristalino. Separa-se a retina a partir do epitélio pigmentado da retina (RPE) e esclera por corte em torno da ora serrata eo nervo óptico. Mergulhar em paraformaldeído a 4% durante mais 30 min para fixar a retina e a proteína fluorescente em células da retina transduzidas (fixação não deve ser superior a 24 horas). Lavar 5 min em PBS estéril, pH 7,4.
    2. Mudar o tampão PBS para bloqueio (PBS com 1% de BSA, 2% de cabra normal ou de soro de burro, 0,5% Triton X-100), e incubar em tampão de bloqueio quer por 4 horas à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
  3. Incubar tecidos com anticorpos primários em tampão de bloqueio quer por 4 horas à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. Lavar 3x com PBS.
    NOTA: Os anticorpos utilizados são os seguintes: anti-laminina (1 / 1.000) marcação dos ILM, clone anti-rodopsina 4D2 (1/500) hastes de rotulagem, anti-glutamina sintetase clone GS-6 (1 / 1.500) rotulagem células de Müller , PNA Lectin (1/40) cones de rotulagem.
  4. Incubar tecidos com diluição 1: 500 de anticorpos secundários conjugados fluor alexa em tampão de bloqueio durante 1 h (criocortes) ou 2 hr (flatmounts) a tempe quartoratura e protegida da luz. Lavar 3x com PBS.
  5. Fazer cortes de alívio para a retina e que flatmount numa lâmina de vidro quer com o foto-receptor ou de células ganglionares da retina (RGC) voltado para cima. Adicionar mountingmedium aquosa, aplique lamela e armazenar a 4 ° C.
  6. Execute microscopia confocal de varredura a laser em microscópio confocal. Adquirir imagens em sequência, linha por linha, para reduzir a excitação e crosstalk emissão. Definir tamanho do passo de acordo com o teorema de amostragem de Nyquist-Shannon. Use as configurações de exposição que minimizem pixels supersaturados nas imagens finais. Processar imagens de 12 bits com FIJI, Z-seções do projeto em plano único com intensidade máxima sob função Z-projeto e finalmente converter-se ao modo de cores RGB de 8 bits.

4. Análise de PCR de rato As amostras de sangue

  1. Injectar 100 ul estoque contendo 1 a 4 10 x 11 partículas de um AAV-GFP na veia peniana de ratinhos C57BL6J anestesiados (5% de isofluranopara a indução de uma câmara de perto e 2,5% de isoflurano através de um cone de nariz durante a cirurgia), utilizando uma seringa de insulina com um ultra-fino 6 milímetros agulha. Este animal irá servir como um controlo positivo de partículas de AAV de circulação.
  2. Amostra de sangue da cauda do rato antes da injeção e 3 horas, 24 horas, 2 dias, e 3 dias após ShH10 injeção intravítrea ou após a injeção intrapenile (Figura 1). Cerca de 10-20 ul é recolhido em tubos de heparina. Sacrifício ratos por inalação de CO2, após a conclusão do procedimento.
  3. Extrair DNA genômico a partir de amostras de sangue, utilizando o kit de extração de sua escolha.
  4. Efectue a amplificação por PCR de ADN genómico. Para este protocolo utilizar o seguinte par de iniciadores: GFP, sentido 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', anti-sentido 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. O seguinte programa de PCR foi realizada: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 seg, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 seg (30 ciclos); 72 ° C, 5 min (1 ciclo);4 ° C espera.

5. Método de Azul de Evans Opcional

NOTA: Quantificar permeabilidade vascular medindo perda de albumina a partir de vasos sanguíneos na retina usando o método do azul de Evans 10.

  1. Prepare corante azul de Evans por dissolução em solução salina normal (6 mg / ml), ultra-sons durante 5 minutos num aparelho de limpeza de ultra-sons, e filtração através de um filtro de 5 | im.
  2. Anestesiar ratos C57BL6J (isoflurano inalação, veja o passo 4.1), verifique a perda do reflexo de endireitamento, o reflexo de retirada e resposta cauda pitada indicando uma anestesia adequada, e injetar azul de Evans (45 mg / kg) através da veia peniana (Figura 1). Verifique se patas, focinho e orelhas de ratos tornam-se claramente azul seguinte Evans injeção de azul, confirmando a captação e distribuição do corante.
  3. Anestesiar ratos C57BL6J 3 horas após a injecção do corante com cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificar a perda de righting reflex indicando uma anestesia adequada. Amostra intracardial cerca de 500 ul de sangue em tubos de heparina e perfundir ratinhos durante 2 min através do ventrículo esquerdo com um tampão de citrato (0,05 M, pH 3,5; dissolve-se 7,8 g de ácido cítrico e 3,8 g de citrato de sódio em 1 L de água destilada) pré-aquecido a 37 ° C para impedir a vasoconstrição. Os ratinhos são sacrificados por perfusão.
  4. Após a perfusão, enuclear e dissecar cuidadosamente ambos os olhos sob um microscópio cirúrgico para recolher as retinas (ver Secção 3.2). Retinas seco em um evaporador centrífugo durante a noite, pesar, e extrair o corante azul de Evans por incubação retinas com 100 ul de formamida durante 18 hr a 65 ° C com agitação (100 xg). Centrifugar as amostras da retina de 30K omega filtro em tubos 20,798.5 xg durante 2 horas a 4 ° C e as amostras de sangue centrifugar a 20,798.5 xg durante 15 min a 4 ° C.
  5. Use os dois sobrenadantes para medir absorção. Determinar a absorvância de cada amostra subtraindo a absorvância máxima for azul de Evans a 620 nm para o mínimo de absorvência a 740 nm. Calcular a concentração azul de Evans no plasma e da retina a partir de uma curva padrão de azul de Evans em formamida. Expresse permeabilidade BRB em microlitros de azul de Evans por grama de retina seco por hora (l plasma / g de peso seco da retina / h).

6. Opcional Angiofluoresceinografia

NOTA: O vazamento de vasos sanguíneos da retina em ratos podem ser visualizados por injeção intraperitoneal de fluoresceína.

  1. Anestesiar ratos C57BL6J (isoflurano inalação, veja o passo 4.1) e dilatar os alunos com colírio (neosynephrine e mydriaticum). Use vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
  2. Injectar por via intraperitoneal 0,01-0,02 ml de fluoresceína de sódio a 10% em 0,1 ml de solução salina estéril para angiofluoresceinografia.
  3. Coletar imagens de ambos os olhos após a injeção, utilizando uma câmera de fundo de olho. Sacrifique ratos por inalação de CO2 após a proprocedimento.
    NOTA: 20 segundos são necessários para os vasos da retina para se tornar visível na angiografia. As imagens têm de ser capturado entre 3-10 min após a injecção máxima de fluoresceína. Os pontos de fuga (se houver) são observáveis ​​após 2,5 min. Em pontos de tempo posteriores a qualidade da imagem é perdida devido à fluoresceína de sódio difundir-se, assim, apenas as imagens vítreo, logo após obtidos são utilizados para a análise.

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Resultados

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Esperamos o aumento da transdução de células gliais da retina Müller ShH10 se utilizando o modelo animal mostra perturbações na estrutura da ILM (Figura 2A - B). Por exemplo, demonstramos que na ausência de DP71, alvos ShH10 especificamente, mas de forma mais eficiente Müller células gliais por injecção intravítrea, indicando um aumento da permeabilidade da ILM nesta linha de ratinhos em comparação com ratinhos de tipo selvagem 16 (Figura 2C - F).

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Discussão

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O BRB regula a troca de moléculas entre o sangue e da retina. A sua composição está associada com várias doenças, tais como a retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD). Mostrámos recentemente que em um ratinho knock-out de distrofina, que exibe permeável BRB, a retina se torna mais permissiva para a entrega de genes mediada por vectores virais adeno-associados (AAV). No entanto, apesar BRB partículas de AAV permeabilidade injectado via intra-ocular permanecer confinadas ao compartimento ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a plataforma de imagens do Institut de la Vision. Agradecemos à Associação Francesa de Distrofia Muscular (AFM) por uma bolsa de doutorado para O.V. e Allergan INC. Este trabalho realizado no âmbito do LABEX LIFESENSES [referência ANR-10-LABX-65] foi apoiado por fundos estatais franceses geridos pela ANR. Agradecemos a Peggy Barbe e Mélissa Desrosiers pela assistência técnica nos preparativos do AAV. Somos gratos a Stéphane Fouquet pela excelente assistência técnica em microscopia confocal e sua contribuição especializada na interpretação dos resultados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C57BL6J camundongos cepaJANVIER LABS camundongos
Cetamina 500Virbac Françaanestésico
Xylazine Rompun 2%Bayer Healthcareanestésico
Neosynephrine 5% FaureEurophtadilatador
Mydriaticum 0,5%Theadilatador
SterdexNovartisresina de incorporação criomatriz anti-inflamatória
Thermo Scientific6769006
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo Scientific10143352slides
anti-lamininaSigmaL9393anticorpo
anti-rodopsina clone 4D2MilliporeMABN15anticorpo
anti-glutamina sintetase clone GS-6MilliporeMAB302anticorpo
anti-glial fibrilar ácido Dako334anticorpo
PNA LectinaInvitrogenL32459sonda
Alexa anticorpos secundários conjugados com flúorAnticorpoInvitrogen
ReagenteFluorsave Calbiochem345789meio de montagem
QIAmp DNA Micro KitQIAGEN56304
GoTaq DNA polimerasePromegaM3001
Evans Blue dyeSigmaE2129dye
5 µ FiltroMillipore
Citrato de sódioSigmaS1804
Ácido cítricoSigmaC1909-2.5KG
Formamida espectrofotométricaSigma295876-2L
FluoresceínaSigmaF2456corante
Micron IIIPhoenix Research LabsO sistema de microscopia baseado em câmera colorida 3-CCD, captura de quadros e software pronto para uso permite que os pesquisadores obtenham imagens de retinas de camundongos.
Seringas de InsulinaTerumoSS30M3109
Seringa 10 µ l HamiltonDutscher74487Seringue 1701
Agulha RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332Injeção Intravítrea
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3O injetor versátil usa microseringas para fornecer volumes de picolitros
UltraMicroPump (UMP3) (um) com Controlador SYS-Micro4 ControladordigitalUMP3-1
Lupa binocular SZ76ADVILABADV-76B2Zoom 0,66 x 5 x LEDs com suporte epi e diâmetro / Dissecção de retinas
Tesoura de mola reta - 8,5 cmBionic France S.a.r.l15003-08Dissecção de retinas
curvada Tesoura Vanna15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti 96-Well Thermal CyclerLife technologies4375786Termociclador
Limpador ultrassônicoSuprimentos de laboratórioG1125P1T
Nanosep 30k tubos ômegaVWR
SpeedvacFisher ScientificSC 110 A
EspectrofluorômetroTECANinfinito M1000

Referências

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