Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Resumo

< class = 'jove_content '> Um protocolo para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais covalentemente em uma ponta AFM é apresentado. Procedimentos e exemplos para determinar a força de adesão e a energia livre dessas moléculas em suportes sólidos e bio-interfaces são fornecidos.

Resumo

Espectroscopia de força atômica é uma ferramenta ideal para estudar moléculas em superfícies e interfaces. Um protocolo experimental para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais de forma covalente para uma ponta de AFM é apresentado. Ao mesmo tempo, a ponta de AFM é passivado para evitar interacções não específicas entre a ponta e o substrato, o que é um pré-requisito para estudar moléculas individuais ligados à ponta de AFM. As análises para determinar a força de adesão, o comprimento de aderência, e a energia livre destas moléculas em superfícies sólidas e bio-interfaces são pouco apresentados e referências externas para leitura são fornecidos. Exemplos são as moléculas a polytyrosine poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas são dessorvida a partir de diferentes superfícies como CH ₃ -SAMs, hidrogénio terminada diamante e suportado bicamadas lipídicas sob várias condições do solvente. Finalmente, ovantagens da força espectroscópicas experiências de moléculas individuais são discutidas, incluindo meios para decidir se verdadeiramente uma única molécula tem sido estudada no experimento.

Introdução

Ao longo dos últimos 30 anos, microscopia de força atômica (AFM) acabou por ser uma técnica valiosa imagem para estudar biológicos ^1,2 e sintéticas ³ materiais e superfícies, uma vez que fornece resolução espacial molecular em todas as três dimensões e pode ser operado em vários solvente ambientes. Além disso, a força molécula espectroscopia AFM-single (SMFS) permite medir forças que vão desde o PN a μN regime e deu uma visão sem precedentes por exemplo em proteína dobrar ^4,5, física polímero ^6-8, e interação molécula de superfície única ^{9 - 12} .A lógica por trás estudar moléculas individuais, em vez de um conjunto de moléculas é para evitar efeitos que muitas vezes mascaram eventos raros ou estados moleculares escondidos em média. Além disso, um grande número de parâmetros moleculares, tais como o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adesão, etc., podem serobtida. Este é detalhado nos exemplos abaixo. Numa experiência típica AFM-SMFS, a molécula de sonda é acoplada a uma ponta muito afiada através de uma molécula ligante. A ponta em si está localizado na extremidade de um braço de suporte flexível. Se a ponta é colocada em contacto com a superfície da molécula de sonda irá interagir com esta superfície. Observando-se a deflexão do braço de suporte à retracção da ponta, a força, e, por conseguinte, a energia livre, para separar a molécula de superfície pode ser determinada. Para obter estatísticas significativas, um grande número de chamadas curvas força-distância tem que ser adquirido. Além disso, para ter verdadeiros experimentos única molécula (isto é, utilizando uma e a mesma molécula sonda ao longo da duração de todo o experimento) a molécula sonda deve ser acoplado de forma covalente à ponta de AFM. Aqui, um protocolo experimental para a funcionalização cantilever com uma única molécula através de uma ligação covalente é apresentado. A única molécula ou pode ser acoplada por via de um grupo amino ou um tiol grupo para a ponta do AFM. O processo de conjugação pode ser realizada numa ampla variedade de solventes orgânicos e aquosos () para ter em conta as propriedades de solvatação dos polímeros usados.

Na primeira parte, um protocolo geral para ligar covalentemente uma molécula única ("molécula sonda") através de uma molécula ligante de uma ponta de AFM é descrito. Para este fim, NHS- orgânico ou maleimida-química é utilizado ^13. Junto com o protocolo por três moléculas de exemplo, os processos de aquisição de dados e análise de dados são descritos e referências para leitura são fornecidos. Os exemplos de moléculas são: o (linear) tirosina polímero, o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA lipídica. Isto inclui ligeiras variações do protocolo, por exemplo, para ligar covalentemente cisteínas. Além disso, uma secção dedicada à preparação de superfícies diferentes, tais como uma superfície de diamante, um _CH3 montado -auto-monocamada e bicamadas lipídicas. Essas interfaces tem proven ser boas referências e exemplos.

Protocolo

NOTA: Consulte a Figura 2 para uma visão geral do fluxo do processo que compreende a preparação, as etapas de aquisição de dados e análise de dados.

1. Instalação do Reagente

NOTA: Todos os produtos químicos devem ser manuseados com cuidado, e, portanto, um jaleco, luvas e proteção para os olhos devem ser usados. Todas as operações devem ser realizadas numa hote de laboratório. Em particular, as luvas especiais devem ser usados ​​em caso de utilização de clorofórmio.

1. Use produtos químicos com baixo teor de água, tais como clorofórmio seca rapidamente e armazenar seco, mas não mais de uma semana. Armazenar os produtos químicos a -20 ° C e sob atmosfera de azoto ou árgon no estado gasoso, porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (ver Tabela 1) e PEG (polietilenoglicol) são higroscópicos e PEG é sujeito a oxidação no ar.
2. Para evitar a exposição freqüente do estoque de oxigênio atmosférico e umidade, preparar alíquotas menores, de preferência dentro de um sistema de porta-luvas com uma atmosphe nitrogêniore.

2. Preparação do Equipamento

NOTA: Para evitar uma possível contaminação cruzada, use vasos frescas e limpas para cada etapa.

1. Limpa vidros e uma pinça em solução detergente durante 30 minutos num banho de ultra-sons a 60 ° C.
2. Enxágüe e equipamentos sonicate do passo 2.1 duas vezes com água ultrapura.
3. Equipamento de calor a partir do passo 2.1 em solução RCA (água ultrapura, peróxido de hidrogénio e amoníaco (5: 1: 1)) a 75 ° C num forno durante 45 minutos e, subsequentemente, lavar com água ultrapura.
4. Finalmente, secar os utensílios de vidro e pinças sob uma corrente de azoto seco ou num forno (100 ° C, 3 h).

3. Dica funcionalização

NOTA: Use uma pinça, navios, etc. feita a partir de aço inoxidável, PTFE, vidro ou qualquer outro material que seja quimicamente estável em soluções orgânicas, se aplicável. Salvo disposição em contrário, realizar todas as etapas em RT. A quantidade de solução de incubação necessário depende do número de fichas de cantilever. Certifique-se de que as consolas estão imersos nas respectivas soluções em todos os tempos.

NOTA: Use um capuz para evitar a inalação de vapores orgânicos.

1. A formação de grupos OH na superfície do cantilever ("activação") (aproximadamente 0,5 horas):
   1. Use uma pinça para colocar fichas frescos cantilever (materiais: o pecado, constante da mola: 10-100 PN / nm) sobre uma lâmina de vidro limpa e colocá-los em uma câmara de plasma (100 W).
   2. Evacuar câmara (~ 0,1 mbar).
   3. Flood câmara com gás oxigênio e evacuar novamente.
   4. Ative o processo de plasma (poder: 20%, duração: 15 min, a pressão do processo: 0,25 mbar).
2. Amino-silanização de consolas (aproximadamente 1 hr):
   1. Prepare os 2,5 ml de solução de APTES (ver Tabela 1) numa placa de Petri de vidro - fazer isso idealmente durante o processo de plasma.
   2. Immediately após o processo de plasma, mergulhe cada cantilever por 1 segundo em acetona e colocá-los logo em seguida na solução APTES.
   3. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
   4. Cuidadosamente lavar os chips cantilever duas vezes em 10 ml de acetona e uma vez com 10 ml de clorofórmio.
   5. Opcionais etapa final: fichas Lugar cantilever a partir da etapa anterior em uma lâmina de vidro limpa e asse por 30 minutos a 70 ° C. Note-se que também existem estratégias alternativas para a ativação de superfície, por exemplo, o tratamento UV ^12.
3. PEGuilação (aproximadamente 2 horas):
   NOTA: Execute as operações de 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanização. NHS e grupos maleimida estão sujeitas a hidrólise em ambientes aquosos e PEG em si é sujeito a oxidação no ar. Portanto, o tempo (em especial entre as etapas) é um parâmetro crítico. Consulte a ¹³ para obter mais informações.
   1. Preparar a solução de clorofórmio (ver Tabela 1).
   2. Para evitar a condensação, Quente PEG pulveriza até RT antes de abrir a alíquota e pesando a quantidade apropriada.
   3. Para o acoplamento de polímeros ou de lípidos com grupos amino, resolver separadamente NHS-PEG-NHS (6 kDa) e metil-PEG-NHS (5 kDa) em solução de clorofórmio com vortex até que eles estão completamente resolvido. Consulte a Tabela 1 para concentrações.
      1. Alternativamente. para o acoplamento de polímeros com grupos tiol resolver separadamente NHS- PEG-Mal e metil-PEG-NHS em solução de clorofórmio.
   4. Misturar as soluções como necessária para ajustar uma determinada relação entre o número ou o NHS- maleimide- e as moléculas de PEG terminado em metilo (tipicamente 1: 500). Note-se que a proporção ideal tem de ser determinada de forma iterativa em uma série de ciclos de preparação-experimentais.
   5. Incubar fichas cantilever na solução de PEG durante 1 hora num ambiente saturado de clorofórmio para evitar a evaporação do clorofórmio.
4. Sonda conjugação molécula(> 1 hora):
   NOTA: No seguinte 3.4.1-3.4.3, três exemplos para o acoplamento covalente de diferentes moléculas sonda para a ponta do AFM são descritos. Para cada molécula do protocolo tem de ser ajustada. Além disso, note, que no exemplo 1 e 3 do SNS-química é utilizada ao passo que no exemplo 2, o polímero funcionalizado tiol PI-g-PS é acoplado ao PEG por meio de maleimida-química. Para mais detalhes ver ^14.
   1. Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
      1. Dissolver o polytyrosine conjugado molécula sonda em NaOH 1 M. Ajustar a concentração de 1 mg / ml.
      2. Troque o NaOH para tampão de borato de sódio (pH 8,1), utilizando colunas de spin dessalinização (7 kDa MWCO) imediatamente antes da funcionalização
      3. Lavar as consolas primeiro com 5 ml de clorofórmio, em seguida, com 5 ml de etanol e finalmente com 5 ml de tampão de borato.
      4. Incubar os chips cantilever durante 1 hora na solução tampão polytyrosine borato e depois enxaguar com tampão boratoe água ultrapura. Guarde em água ultrapura até que a medição.
   2. Para polímeros com uma espinha dorsal linear (poli-isopreno, 119 kDa), que tem cadeias laterais enxertadas (poliestireno, 88 kDa) ¹⁴
      1. Dissolve-se o PI- g -PS em clorofórmio seco. Ajustar a concentração da solução de conjugação a 4 mg / ml.
      2. Lavar as consolas com 5 ml de clorofórmio e incubar durante pelo menos 1 h na solução de conjugação.
      3. Lavar novamente em 5 ml de clorofórmio e armazenar em clorofórmio num ambiente saturado-clorofórmio (para evitar a evaporação clorofórmio) até que a medição.
   3. Para o Papa lipídico
      1. Dissolver PAPA em clorofórmio seco. Ajustar a concentração para 20 mM.
      2. Lavar as consolas com 5 ml de etanol e 5 ml de água ultrapura antes da incubação das consolas de 1 h na solução de lípidos.
      3. Após a incubação, lavar consolas com 5 ml de clorofórmio, 5 ml de etanol e 5 ml de, água ultrapura quente (por esta ordem) para remover moléculas de sonda não ligados e se livrar de resíduos de clorofórmio. Use dicas funcionalizados imediatamente. Alternativamente, armazená-los em clorofórmio até ser necessário.

Figura 1. (A) esquemático, mostrando o processo de funcionalização ponta usando o exemplo de NHS química. Ligação (B) Chemical empregada para anexar uma molécula sonda para a ponta através de um grupo amino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Preparação 4. Superfície

1. Auto-montado monocamada (SAM)
   NOTA: Como a superfície para o primeiro exemplo, uma monocamada auto-montada foi escolhido. Consulte a literatura ¹⁵
2. Lâminas de vidro limpas com uma solução de detergente e em seguida, duas vezes em água ultrapura num banho de ultra-sons durante 30 min cada. Em seguida, como um passo adicional de limpeza, colocá-los na solução de RCA (ver passo 2.3) a 75 ° C durante 15 min.
3. Brasão as lâminas com 10 níquel cromo nm e 100 nm de ouro em um coater vácuo. Então guarde na geladeira e limpo novamente na solução RCA diretamente antes da próxima etapa.
4. Incubar as lâminas do passo anterior em 2 mM de solução de 1-dodecanthiol / etanol durante 12 horas. Os grupos tiol que se ligam a superfície de ouro e uma monocamada auto hidrofóbico monta. Lavar as lâminas com etanol e água ultrapura e depois seco por uma corrente de azoto gasoso. Confirme a hidrofobicidade da superfície preparada com medidas de ângulo de contato estáticos em um goniômetro com uma câmera CCD ^{de 10.}

Hydrogen diamante encerrado
NOTA: Como uma superfície para o segundo exemplo, um diamante terminada hidrogénio foi escolhido. A preparação da superfície foi realizada como descrito anteriormente ^16.

Bicamada lipídica Compatível
NOTA: No último exemplo, uma superfície apoiada bicamada lipídica (SLB), foi utilizado como uma superfície. Para obter uma tal superfície, uma solução (0,1 mg / ml) de vesículas unilamelares grandes (LUV), contendo o fosfolipido POPC foram formados pelo método de extrusão. Em seguida, 50 ul da solução LUV foram colocadas sobre uma folha de mica clivada de fresco (A = 1 cm) e incubadas durante 30 min. Finalmente a solução foi lavada com 20 ml de água ultrapura. Veja ^17,18 para uma descrição detalhada da preparação do SLBS.

5. Aquisição de Dados

NOTA: Para os experimentos, use um AFM, que oferece a capacidade de medir em líquidos. Os procedimentos de aquisição de dados e análise de dados são aplicáveis ​​independentemente do modelo de AFM usado. Além disso, em algumas experiências, é vantajoso ter a possibilidade de controlar a temperature líquido no interior da célula. Cantilever deflexão foi detectado através do método de deflexão do feixe de laser ^19. Constantes de flexão foram determinados com o método térmico ruído ^20.

1. Inserir o braço de suporte funcionalizado em um suporte de AFM cantilever que é adequado para a medição de fluidos.
2. Colocar a superfície (preparação ver acima) para ser amostrada na AFM e cobri-lo com o líquido. Ambos, o braço de suporte e a superfície deve agora ser imerso no líquido com a ponta cantilever que aponta na direcção da superfície. Note-se que, em muitos casos, uma gota de líquido é suficiente. Em qualquer caso, a evaporação do fluido deve ser evitado, por exemplo, usando uma célula de fluido em circuito fechado.
3. Se for o caso, ajustar a temperatura desejada no controlador.
4. Deixar o sistema equilibrar durante pelo menos meia hora.
5. Gravar um espectro de ruído térmico do cantilever com o cantilever longe a partir da superfície, a fim de excluir quaisquer efeitos de amortecimento superfície. Note-se que geralmente 10 ou mais espectros têm de ser acumulados para obter uma razão sinal-para-ruído suficiente.
6. Aproxime-se da superfície. Note-se que, a fim de conservar a geometria da ponta e ponta funcionalização o processo de abordagem tem de ser realizada com cuidado. Isto pode ser conseguido através de, por exemplo, aproximando-se em modo de contacto intermitente.
7. Determinar a sensibilidade inversa óptica alavanca (InvOLS) medido em nm / volt. Para fazer isso, empurrando a ponta cantilever contra uma superfície dura.
   1. Determinar os InvOLS medindo a inclinação da distância do curso de piezo versus a mudança na tensão fotodiodo. Unir a parte da curva de força-distância, em que a ponta do braço de suporte se encontra em contacto com a superfície. Em experimentos envolvendo uma superfície macia como bicamadas lipídicas, realizar esta etapa em áreas que não são cobertas com uma bicamada lipídica ("pontos de defeitos").
8. Determinar a constante da mola (pN / nm) por montagem de um oscilador de harmónica do espectro de ruído térmico. Usofunção de software automatizado para a primavera determinação constante; caso contrário, consultar a literatura ^20.
9. Iniciar a experiência.
   1. Curvas numerosos força-recorde distância em cada condição experimental. Normalmente, usar os seguintes valores para os parâmetros experimentais: Taxa de amostragem de 5 kHz, velocidade de ponta de 1 mm / s, retrair distância de 1 m.
      NOTA: Por vezes, dependendo da dinâmica do experimento estudado, pode ser necessário esperar uma certa quantidade de tempo com a sua extremidade em contacto com a superfície ("Tempo paragem").
      NOTA: O experimento parâmetros específicos pode desviar-se substancialmente dos valores indicados acima.
   2. Durante a medição a longo prazo, de zero a posição do laser sobre o fotodíodo de tempos a tempos, reposicionando o fotodiodo.
   3. Opcional: Depois de cada curva de força, mudar o local da AFM-ponta para outra posição xy.
   4. No final da experiência, determinam a sensibilidade e a mola CONSTAnt novamente para verificar a consistência e estabilidade do sistema.
      NOTA: Comparando a constante da mola e sensibilidade antes e depois da experiência é também um meio para assegurar que as propriedades do sistema e as propriedades da ponta permaneceu inalterada ao longo do curso do experimento. Se a diferença das constantes de mola não é demasiado grande (<= 15%), que pode ser calculada a média, uma vez que a incerteza intrínseca da mola determinação constante é também cerca de 15%. Para diferenças maiores, é aconselhável primeiro encontrar e eliminar a causa para a constante de mola aparente mudança antes de prosseguir com mais experiências.

6. Data Preparation

NOTA: Nesta seção geral etapas de preparação de dados que são tipicamente realizadas independente do tipo específico de experiência para converter unidades de Newton e nanométrica, bem como para corrigir os dados são descritos. As análises de dados específicos da experiência estão briefly descrito mais abaixo na respectiva seção exemplo representativo.

1. Normalmente, realizar toda a preparação e análise de dados passos automaticamente por um algoritmo de home-escrita, por exemplo, com base no software IGOR Pro 6.
2. Converter o sinal de deflexão raw (Defl) [V] em vigor, multiplicando-o com os InvOLS [nm / V] e primavera constante [nN / nm].
3. Compensar a força de tal forma que a força sobre o braço de suporte de uma distância suficiente da superfície (cantilever descarregada) torna-se 0 nN.
4. Calcula-se a posição real da ponta (também chamado de separação, quando medido em relação à superfície) z *, o que leva a flexão do braço de suporte em conta:
   
5. Deslocamento z *, de tal maneira que z * = 0 corresponde à posição z da superfície.
   NOTA: Aqui, F é a força que actua sobre a ponta e, por conseguinte, curvaé o braço de suporte (determinado no passo 6.2.), z é a posição medida do sensor z (determinado directamente pelo instrumento) e o símbolo k representa a constante da mola (determinado no passo 5.8).

Figura 2. Processo de diagrama de fluxo mostrando a preparação da amostra, a aquisição de dados e análise dos dados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

No que se segue, os resultados para o exemplo acima descrito, ou seja, a moléculas polytyrosine polímeros de poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido, são apresentados. Primeiro para cada exemplo, experimentar detalhes específicos para a aquisição de dados e preparação de dados são fornecidos. Em seguida, os resultados exemplares para experimentos onde essas moléculas foram dessorvidas de superfícies diferentes _(CH3 -SAMs, hidrogênio encerrado diamante e lipídios bicam...

Discussão

Durante as últimas décadas, os experimentos única molécula ter fornecido informações sem precedentes sobre mecanismos moleculares e acabou por ser uma abordagem de valor inestimável em ciências da vida e além. Para alcançar bons e estatísticas significativas de experiências SMFS, de preferência uma e a mesma molécula é usado ao longo de todo o decurso da experiência. Em contraste com as experiências com conjuntos de moléculas, as experiências SMFS são capazes de detectar eventos raros e estados moleculares escondidos. O...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais
Hellmanex III concentrado líquido alcalino (solução detergente)	Hellma
RCA (água ultrapura, peróxido de hidrogênio (35%), amônia (32%); 5:1:1(v/v/v))Reagente	Sigma
Vectabond / APTES (3-Aminopropil)trietoxissilano	Vectorlabs Acetona
seca (< 50 ppm H< sub>2O)	Sigma
Clorofórmio seco (> 99,9%)	Sigma
Trietilamina	Sigma
Água ultrapura	Biochrom, Alemanha
Tetraborato dissódico (>  99,5%)	Biochrom, Alemanha
Ácido bórico	Biochrom, Alemanha
Monofuncional &alfa;-metoxi-&ômega;-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS"	Rapp, Alemanha
Heterobifuncional α,ω-bis-NHS PEG, 6  kDa, " NHS-PEG-NHS"	Rapp, Alemanha
Heterobifuncional &alfa;-maleimidohexanoico-ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"	Rapp, Alemanha
Molécula de sonda (polímero, lipídio, etc.)
Equipamento
Quantidade suficiente de pratos cristalizantes de vidro com bico (10  ml), placas de Petri de vidro (500 µ l) e tampas de vidro	VWR International GmbH, Alemanha
[header]
Forno de laboratório modelo UF30	Memmert, Alemanha
Sonicador com temperatura controlada	VWR International GmbH, Alemanha
Sistema de plasma "Femto", 100 W	Diener, Alemanha
Uma seringa de vidro separada para cada solvente orgânico	VWR International GmbH, Alemanha
Vortex misturador	VWR International GmbH, Alemanha
Tubos de microcentrífuga (0,5 ml ou 1,5 ml)	Pipetas Eppendorf
: 10-100 µ l, 50-200 e micro; l e 100-1.000  µ l	Eppendorf
AFM com célula de fluido com temperatura controlada (por exemplo MFP-3D com BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilevers, normalmente feitos de nitreto de silício (SiN) (constante de mola inferior a 100 pN/nm, e.g. MLCT)	Bruker AXS, Santa Bárbara