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Artigo de método

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

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DOI:

10.3791/52460

⸱

17 de fevereiro de 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um método para criar uma lesão mecânica do vaso em embriões de peixe-zebra. Este modelo de lesão fornece uma plataforma para estudar hemostasia, inflamação relacionada a lesões e cicatrização de feridas em um organismo ideal para microscopia em tempo real.

Resumo

Embriões de peixe-zebra (Danio rerio) provaram ser um modelo poderoso para estudar uma variedade de processos de desenvolvimento e doenças. O desenvolvimento externo e a transparência óptica tornam esses embriões especialmente passíveis de microscopia, e numerosas linhagens transgênicas que rotulam tipos específicos de células com proteínas fluorescentes estão disponíveis, tornando o embrião de peixe-zebra um sistema ideal para visualizar a interação de vasculares, hematopoiéticas e outros tipos de células durante a lesão e reparo in vivo. A genética direta e reversa no peixe-zebra está bem desenvolvida e a manipulação farmacológica é possível. Descrevemos um modelo de lesão vascular mecânica usando técnicas de micromanipulação que explora várias dessas características para estudar as respostas à lesão vascular, incluindo hemostasia e reparo de vasos sanguíneos. Usando uma combinação de microscopia de vídeo e timelapse, demonstramos que esse método de lesão vascular resulta em respostas mensuráveis e reprodutíveis durante a hemostasia e o reparo da ferida. Este método fornece um sistema para estudar lesões vasculares e reparos em detalhes em um modelo animal inteiro.

Introdução

O peixe-zebra tem sido usado extensivamente para estudar uma variedade de tópicos em biologia vascular, incluindo desenvolvimento vascular, angiogênese e desenvolvimento e patologia hematopoiética1-3. Os embriões desenvolvem uma circulação funcional, bem como leucócitos e outros componentes do sistema imunológico inato até 1 dia após a fertilização (dpf) 1,4,5. A conservação da resposta inflamatória e leucocitária à lesão tornou o embrião de peixe-zebra um modelo informativo para processos inflamatórios tão diversos como infecção tuberculosa, enterocolite e regeneração tecidual6-9. Embriões de peixe-zebra têm sido usados para estudar a inflamação relacionada à lesão, particularmente no contexto de ferimento epitelial e resposta de neutrófilos10,11. A lesão do embrião resulta em uma resposta celular altamente conservada das células no local da lesão e das células imunes inatas recrutadas para responder à lesão e regular sua resolução11,12. Outros modelos de lesão usaram pulsos de laser focalizados para localizar espacialmente a lesão em tipos específicos de células, incluindo neurônios, células musculares e cardiomiócitos13-15.

Embriões de peixe-zebra têm sido utilizados como modelo para estudar hemostasia e trombose em condições de manipulação farmacológica e genética, utilizando tanto a formação de trombos mecânicos quanto os induzidos porlaser16-19. Os componentes da cascata de coagulação parecem estar bem conservados e os transgênicos têm permitido estudos detalhados da deposição de trombócitos e fibrina no local da coagulação17,20,21. O procedimento apresentado neste artigo complementa esses métodos, fornecendo um sistema para estudar a lesão mecânica do vaso, resultando em ruptura do vaso, formação e resolução de trombos e reparo do vaso.

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Protocolo

NOTA: Os procedimentos que utilizam peixe-zebra foram aprovados pelo Institutional Animal Care da UCSF e Comitê de Uso.

1. Preparação de Ferramentas

  1. Insira pin minúcia em um suporte de pino e prenda o pino.
  2. Utilizando uma pinça de ponta fina, dobre com cuidado a ponta do pino para criar um ligeiro gancho.
  3. Para manipulação e estabilização do embrião durante a lesão, dobre a extremidade de um calibre 28 ½ polegadas agulha montada em uma seringa de insulina usando alicates.

2. Preparação de embriões Zebrafish por lesão

  1. Configure casais reprodutores de peixes-zebra e recolher os ovos em água ovo (60ug / sais aquário ml) como mostrado anteriormente 22.
  2. Adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água de ovos quando os embriões são aproximadamente 8 horas pós-fertilização (hpf) para impedir que a melanização.
  3. Dechorionate dois dia após a fertilização (DPF) embriões antes da experiência com a pinça de ponta fina.
    NOTA: Os embriões podem ser ferido a qualquer momento após a circulação começa. Os dados aqui apresentados são para 2 dpf embriões, mas a técnica foi aplicada com sucesso em embriões de até 5 dpf.
  4. Anestesiar os embriões com 0,02% tamponado com ácido 3-aminobenzóico (tricaina) aproximadamente 10 min antes de manipulações.

3. Vessel Mecânica Lesão de Embriões

  1. Transferência de embriões anestesiados para uma lâmina de depressão em um microscópio estereoscópico de dissecação usando uma pipeta de transferência.
  2. Usando o lado curto plana da agulha da seringa para manipular o embrião com a mão dominante, posicionar o embrião de lado, com a superfície ventral virada para fora da agulha.
  3. Posicionar o pino minúcia com a ponta virada directamente contra a superfície ventral do peixe para a posterior abertura urogenital. Posicionar o pino minúcia com um ligeiro ângulo de tal modo que a ponta curvada é capaz de perfurar o periderme directamente na veia caudal (Figura 1 </ Strong>).
  4. Usando a agulha da seringa para manipular o embrião, perfurar a veia caudal com o pino de minúcia tocando no embrião para o pino de gancho ligeiramente o pino para dentro da veia.
  5. Usando a agulha da seringa, puxe o embrião para longe do pino de minúcia para criar um pequeno rasgo no recipiente.
    NOTA: A lesão de sucesso vai resultar em sangramento imediato a partir da veia.

4. Análise da hemostasia

  1. Escolha apenas os embriões com visivelmente células circulantes no sangue para este procedimento.
  2. Prepare-se para iniciar o temporizador assim que o pino de minúcia é puxado a partir do vaso.
  3. Inicie o cronometro logo que a perda de sangue pode ser visualizado a partir da ferida. Quando a perda de sangue da ferida cessa, parar o temporizador e registrar o tempo total, como o tempo de sangramento. Se a coagulação é inibida, o tempo para gravar quando não há mais visivelmente células circulantes no sangue.

5. Análise da cicatrização de feridas

  1. Transferência posanimais t-lesão em placas de imagem com fundo de vidro para microscopia.
  2. Remover a maior parte da água do ovo.
  3. Cubra os embriões em 0,3-1,2% baixo ponto de fusão agarose dissolvidos na água do ovo, aquecido a entre 42 e 45 ºC e suplementadas com 0,02% tricaina.
  4. Embriões posição sobre os seus lados, usando uma pinça.
  5. Após a agarose esfria, encher o prato com 0,02% tricaina em água ovo.
  6. Adquirir imagens usando brightfield, epifluorescência, ou microscopia confocal.
  7. Remover embrião do agarose usando uma pinça e transferência de volta para a água ovo.

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Resultados

A lesão mecânica vaso foi realizada em 2 dpf embriões (Figura 2A - C). Resultados da lesão em um resposta rápida e confiável de coagulação medida pelo tempo de interrupção do sangramento (Figura 2D). Para determinar se ou não diferenças na resposta de coagulação pode ser medido, o anticoagulante hirudina foi administrada aos embriões por injecção para dentro da conduta de Cuvier imediatamente antes do ferimento (5-10 nl de 1 unidade por ul de hirudina dissolvidos em águ...

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Discussão

Zebrafish têm sido utilizados com sucesso como um modelo para vários tipos de feridas, incluindo lesão de laser 13-15, trombose induzida por laser 16, e epitelial ferindo 10. Relata-se um método de ferimento mecânico que é simples de executar e produz uma lesão controlada num modelo in vivo, que é altamente favorável à microscopia em tempo real. Resultados da lesão em um resposta hemostática rápida e mensurável e um programa de reparação ferida reprodutível que pode ser...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Stephen Wilson e Lisa Wilsbacher pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH HL054737.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Minutia PinsFine Science Tools26002-10Diâmetro da ponta 0.0125 mm, diâmetro da haste 0.1 mm
Suporte de pinoFine Science Tools26016-12
Dumont #5 Fine Tip ForcepsFine Science Tools11254-20
Slide de Depressão de VidroAquatic Eco-SystemsM30
Baixo Derretimento AgaroseLonza 50081Pré-aquecido a 42 º C
N-feniltioureia (PTU)Sigma AldrichP7629
ácido 3-aminobenzóico (tricaína)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Placas de imagem com fundo de vidroMattekP35G-1.5-14-C
Microscópio de dissecaçãoOlympusSZH10
ZeissAxio Observer
Sais de aquário Seringainstantânea para o oceano
com agulha de 28,5 GBecton Dickinson 
Microscópio de fluorescência de insulina 329461

Referências

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