Artigo de método

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

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DOI:

10.3791/52469

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2 de fevereiro de 2015

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1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo de co-cultura em três dimensões, que é útil para investigar interações multicelulares e modulação dependente de matriz extracelular do comportamento das células cancerígenas. Neste modelo experimental, as células cancerígenas são cultivadas em géis de colágeno incorporados com fibroblastos associados ao câncer humano.

Resumo

A progressão do câncer (iniciação, crescimento, invasão e metástase) ocorre por meio de interações entre células malignas e as células estromais tumorais circundantes. O microambiente tumoral é composto por uma variedade de tipos de células, como fibroblastos, células imunes, células endoteliais vasculares, pericitos e células derivadas da medula óssea, incorporadas na matriz extracelular (MEC). Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) têm um papel pró-tumorigênico por meio da secreção de fatores solúveis, angiogênese e remodelamento da MEC. Os modelos experimentais para sobrevivência, proliferação, migração e invasão de células cancerígenas basearam-se principalmente em culturas de tecidos monocelulares e monocamadas bidimensionais ou ensaios de câmara de Boyden. No entanto, esses experimentos não refletem precisamente as condições fisiológicas ou patológicas em um órgão doente. Para obter uma melhor compreensão das interações estromais tumorais ou da matriz tumoral, as culturas multicelulares e tridimensionais fornecem ferramentas mais poderosas para investigar a comunicação intercelular e a modulação dependente de ECM do comportamento das células cancerígenas. Como plataforma para este tipo de estudo, apresentamos um modelo experimental no qual as células cancerígenas são cultivadas em géis de colágeno incorporados com culturas primárias de CAFs.

Introdução

O tecido canceroso pode ser percebido como um tipo de órgão, que evolui por meio de interações estreitas entre o câncer e o microambiente estromal tumoral, composto por fibroblastos associados ao câncer (CAFs), células imunes, vasos tumorais e a matriz extracelular (MEC). Os CAFs são a principal fonte de fatores solúveis (citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas) que exercem efeitos mitogênicos, pró-migratórios e pró-invasivos sobre as células cancerígenas. Eles também estimulam a formação de vasos tumorais e recrutam células precursoras, como células derivadas da medula óssea (BMDC). Os CAFs ativados estão envolvidos na produção e remodelação da MEC, promovendo assim o crescimento e a disseminação de células cancerígenas1. Os CAFs também fornecem um nicho que facilita a colonização e metástase de células tumorais e são capazes de conferir fenótipos de células-tronco a células cancerígenas vizinhas. Observações patológicas sugerem que reações estromais ou alterações fibróticas nos tecidos cancerígenos são indicativas de um prognóstico ruim. Estudos recentes também demonstraram que as características estromais do tumor, como a assinatura do gene, podem prever o prognóstico do paciente. Além disso, fatores derivados de CAF podem modular a sensibilidade à quimioterapia, destacando o papel dos CAFs na determinação da sensibilidade e resistência aos medicamentos2.

Como os CAFs desempenham um papel multifacetado na promoção da progressão do tumor por meio de vias de sinalização que medeiam as interações entre CAFs e diferentes tipos de células dentro do microambiente tumoral, eles têm atraído cada vez mais atenção como novos alvos para terapias contra o câncer. A heterogeneidade das populações de células dentro do microambiente do câncer apresenta um obstáculo para o direcionamento de CAFs. Vários marcadores para CAFs foram propostos, como actina de músculo liso α (α-SMA), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e proten-1 específico de fibroblastos (FSP-1: também chamado de S100A4); no entanto, esses marcadores moleculares não são específicos para distinguir CAFs de outras células presentes em tecidos não cancerosos3. Portanto, mais estudos são necessários para obter mais conhecimento sobre as propriedades específicas dos CAFs. Para este fim, é informativo caracterizar CAFs cultivados primários em comparação com fibroblastos normais pareados com pacientes.

Recentemente, análises de CAFs derivados de pacientes foram relatadas em vários tipos de câncer, revelando padrões únicos de expressão gênica e comportamentos celulares em comparação com fibroblastos derivados de tecidos não cancerosos. Usando CAFs isolados de tecidos de câncer de pulmão humano, desenvolvemos um método de co-cultura tridimensional, permitindo-nos avaliar as propriedades dos CAFs de pulmão. Nesse modelo, investigamos os efeitos dos CAFs na invasão, proliferação e contração do gel de colágeno de câncer de pulmão, que recapitularam experimentalmente os papéis promotores de tumores dos CAFs de pulmão4.

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Protocolo

NOTA: Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética apropriados.

1. cultura primária de pulmão fibroblastos humanos

  1. Coleta de tecido pulmonar:
    1. Obter amostras de tecido pulmonar humanos da sala de operação cirúrgica diretamente. Recolha cerca de 1 cm a 3 quarteirões do tecido pulmonar cancerosos e não cancerosos, com a amostra não-cancerosas recolhido o mais longe possível do tumor.
    2. Suspender as amostras em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 0,25 ng / mL de anfotericina B (meio isento de soro). Manter as amostras em suspensão na estéreis tubos de 50 ml e transferir para o laboratório.
      NOTA: Os fibroblastos são altamente migratório e proliferativo em comparação com outros tipos de células, tais como epiteliais, células endoteliais e do músculo liso. O método excrescência aproveita esses recursos de fibroblastos, e outgrocélulas asa de cortes de tecido são abundantes em fibroblastos. Depois de várias passagens de células, outros tipos de células não conseguem sobreviver e propagar em DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), resultando em culturas de células de fibroblastos purificadas. As células podem ser usadas 3-7 passagens seguintes cultura primária.
  2. Cultura explante e condicionado para crescimento celular:
    1. Execute cultura primária de fibroblastos, utilizando um protocolo previamente notificados com modificações 5.
    2. No laboratório, colocar a amostra de tecido em 10 cm de prato de cultura de tecidos sem meio de cultura e cortado em pequenos troços ~ 2-3 mm de tamanho usando fórceps esterilizados e bisturi. Durante este processo, evitar que a secção seca, de outro modo a eficiência da excrescência da célula é prejudicado.
  3. A separação da camada de células epiteliais e do tecido conjuntivo:
    1. Embeber as secções de tecido cortado em meio de cultura contendo 2,000 PU / ml de dispase I e cultura durante 16 horas a 4 ° C.
    2. Transferem-se as secções de tecido para um prato, e separar a camada de células epiteliais do tecido conjuntivo adjacente. Processe as seções em uma bancada limpa para evitar a contaminação de microorganismos.
      NOTA: Se for necessário a cultura primária de células epiteliais, executar o passo 1.3. Se apenas os fibroblastos estão a ser isolado, omitir o passo 1.3 porque a cultura explante e celulares passagens subsequentes são desfavoráveis ​​para as células epiteliais, que produzem populações de fibroblastos purificados.
  4. Penhora de cortes de tecido:
    1. Picar os tecidos em um milímetro pedaços usando dois bisturis. Se as peças não são suficientemente pequenas, elas retirar mais facilmente a partir da placa, e as células irão falhar a ultrapassar na superfície do prato.
    2. Coloque pequenas secções de tecido pulmonar afastados um do outro para manter um espaço vazio em torno de cada peça. Adicione arranhões na superfície do prato de cultura de tecido usando uma lâmina de bisturi para facilitar a ligação de secções de tecido.
      NOTA: CoçarTambém parece facilitar a excrescência de células, proporcionando faixas ao longo do qual as células podem migrar.
      1. Em alternativa, colocar as peças de tecidos picados, individualmente, em cada poço de uma placa de 6 poços, e cobri-los com uma lamela de cobertura. Fixe a tampa de deslizamento para a superfície da placa usando graxa de silicone.
      2. Coloque graxa de silicone em dois pontos 1.5 cm de distância em cada poço, utilizando um pino estéril. Cobertura de pedaços de tecido aumenta a eficácia do crescimento de células e propagação de células após diversas passagens.
  5. Subsequente cultura explante:
    1. Adicionar cuidadosamente meio de cultura para o prato antes de as secções de tecido de secar, como crescimento celular eficaz é perdido para a maior parte, se as amostras secarem. Não despeje o meio muito rapidamente como as secções de tecido seria separar.
    2. Células de cultura em DMEM com 10% de FBS. Use médio suficiente apenas para cobrir o tecido, mas não muito que ele permite flutuante, como flutuabilidade adicional promove a separação doprato.
  6. Passagem Cell:
    1. Lidar com o meio de cultura com cuidado em todos os momentos como movimentos repetidos da placa de cultura pode levar ao descolamento dos cortes de tecido.
    2. Colocar as placas de cultura numa incubadora a 37 ° C durante 5-7 dias. Atualizar o meio todos os dias, e lidar com as placas de cultura minimamente durante as médias alterações. Os fibroblastos superar a partir da borda das secções de tecido ao longo das próximas semanas.
      NOTA: ~ Após 2-3 semanas, os fibroblastos superando quase atingem confluência, dependendo da quantidade de área de superfície.
    3. Lavar as células com PBS 1x, e adicionar 1 ml de tripsina I do prato.
    4. Após tripsinização, separar as células utilizando 9 ml de DMEM suplementado com FBS a 10%. Recolher as células em suspensão no meio de um tubo de 10 ml, juntamente com as secções de tecido. A seguir à centrifugação para formar sedimentos celulares, ressuspender as peletes resultantes em meio novo.
    5. Semente as células e os cortes de tecido para um novo culture prato, altura em que os tecidos não conseguem anexar ao prato, enquanto as células aderir e crescer. No dia seguinte, retire os pedaços de tecido flutuantes por aspiração, e mudar o meio. Fibroblastos anexados propagar com culturas subsequentes.

2. tridimensional Co-cultura de fibroblastos humanos pulmão e células cancerosas

  1. Preparação de células e reagentes:
    1. Aproximadamente usar 2 x 10 5 células epiteliais e 2,5 x 10 5 fibroblastos por poço. Prepare o colagénio tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampão de reconstituição (NaOH 50 mM, 260 mM de NaHCO3, 200 mM de HEPES), 5x de DMEM, meio DMEM suplementado com FBS a 10% para a cultura de fibroblastos, e um meio de co-cultura em 3D (uma mistura 1: 1 de meio de cultura de fibroblastos e meio de cultura para as células cancerosas).
    2. Células de adenocarcinoma do pulmão A549, a cultura, os fibroblastos e a co-cultura 3D A549 em DMEM suplementado com FBS a 10%.
  2. O colagénio em gel de formação:
    1. Lavar fibroblastos em cultura em placa de 10 cm com 1x PBS, e adicionar 1 ml de tripsina I do prato. Após tripsinização durante ~ 5 min a 37 ° C, separar as células utilizando 9 mL de DMEM suplementado com FBS a 10%. Recolher as células em suspensão no meio num tubo de 10 ml e centrifugar para a 200-300 xg para formar sedimentos celulares.
    2. Ressuspender as peletes resultantes em 100% de FBS a uma densidade de 5 x 10 5 / ml.
    3. Prepare o gel de colagénio em gelo. Arrefecer os reagentes, pipetas e tubos no frigorífico antes do procedimento seguinte. Mesmo em gelo, a mistura solidifica, em certa medida, e o volume total é menor do que a soma de todos os constituintes.
    4. Em cada poço, preparar o gel de colagénio por mistura de 0,5 ml de suspensão de fibroblastos (2,5 x 10 5 células) em FBS, 2,3 ml de colagénio do tipo IA, 670 ul de DMEM 5x, e 330 ul de tampão de reconstituição. Permitir que os geles para definir facilmente à temperatura ambiente.
      1. Vigorosamente pipeta de modo que a mi homogéneaxture. Evite a criação de bolhas durante o processo de pipetagem.
    5. Adicionar a mistura de (3 ml) a cada poço de uma placa de 6 poços e deixa-se gelatinizar na incubadora a 37 ° C, sem perturbação durante 30-60 min.
  3. Cultura de células do cancro no gel de colagénio:
    1. Execute co-cultura tridimensional usando um protocolo previamente notificados com modificações 6.
    2. Ressuspender as células cancerosas em meio de co-cultura em 3D (ou em DMEM com FBS a 10%, no caso de células A549) a uma densidade de 1 x 10 5 / ml.
    3. Pour 2 ml da solução de células ressuspenso (2 x 10 5 células) sobre a superfície de cada gel. Modifique o número de células de células cancerosas ou fibroblastos em co-cultura, dependendo das condições experimentais.
  4. Contração gel:
    1. Incubar géis noite a 37 ° C de modo que as células cancerosas podem aderir ao gel de colagénio. Separe cada gel, e gerar uma "cultura flutuante 'em cada poço of a placa de 6 poços.
      NOTA: Ao utilizar uma cultura flutuante, várias modificações no tamanho de gel são induzidas por tensão mecânica e degradação do colagénio, que são mediados por interacção celular entre as células cancerosas e fibroblastos co-cultivadas.
    2. Utilize uma agulha G 21 angular ou pequena espátula para separar cada um gel a partir do bordo do poço. A cada 2-3 dias, atualizar os poços com 2 ml de meio 3D co-cultura. Medir o tamanho de cada gel todos os dias durante 5 dias.
  5. Análise de géis de colagénio:
    1. Meça o conteúdo de colágeno de cada gel, utilizando métodos de quantificação de colágeno, tais como o ensaio Sircol. Realizar análise do transcriptoma ou RT-PCR quantitativo após a recolha de RNA a partir dos géis 5.

Cultura da Interface e Invasion Ensaio 3. Air-líquido

  1. Após cultura das géis de colagénio a 37 ° C durante 5 dias, expor os géis contraídos para o ar, colocando-os sobre uma malha (70 de tamanho de poro) no novo 6-placas de poços. Faça a malha a partir de filtros celulares disponíveis comercialmente usados ​​para citometria de fluxo.
  2. Suavemente encher cada poço com 11 ml de 3D meio de co-cultura.
  3. Posicionar os géis para a malha usando uma colher esterilizada, e remover qualquer meio remanescente dos géis. Nesta condição, submergir em geles a forma enquanto expor a superfície superior do gel de ar. Definir essa condição cultura como interface de ar líquido.
    NOTA: Depois de 5-7 dias de manutenção da cultura de interface ar-líquido, a 37 ° C na incubadora, as células cancerosas invasivas migrar para dentro do gel. Dependendo do tipo de célula e, como resultado de interacções celulares, graus variáveis ​​de alterações morfológicas em células, as células cancerosas são induzidas pela cultura de interface ar-líquido.
  4. Para a avaliação histológica, fixar o gel em formol durante a noite a temperatura ambiente e incorporar em parafina. Mancha seções verticais (4 mm) com HE (H & E). Realizar análise imuno-histoquímica on as seções 4.

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Resultados

Este método de co-cultura, imitando o microambiente tumoral, é uma ferramenta útil para pesquisar as interacções entre as células cancerosas e fibroblastos embebidos no gel de colagénio. No estudo anterior, os três parâmetros foram avaliados neste modelo experimental: contração gel de colágeno, a invasão das células do câncer e alteração morfológica. Proliferação de células cancerosas também foi estimado usando Ki67 immunostaining 4. Amostras de tecido pulmonar foram colhidos a partir de secções cancerosas e ...

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Discussão

FAC formam um dos principais componentes da MEC células cancerosas e não apenas fornecer um andaime para o tumor, mas também participar activamente no desenvolvimento do tumor 7. As evidências acumuladas desvenda o impacto da FAC ou suas moléculas relacionadas à eventual prognóstico, com destaque para os papéis críticos de progressão do tumor CAF mediada 8.

No estudo anterior, foram empregados método consequência de isolar FAC pulmonares 4. Nesta experiência,...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 e 25460137).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Colágeno tipo IANitta gelatina Inc.CELL-1A
Tampão de reconstituiçãoNitta gelatina Inc.
LamínulaNUNC174934
Graxa de siliconeDow Corning TorayGraxa
Dispase IWAKO386-02271
Placa de 6 poçosBD Falcon353046
Cell strainer (70 μ m)Falcão BD352350
de alto vácuo

Referências

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62(2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747(2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).

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