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Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

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DOI:

10.3791/52475

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19 de fevereiro de 2015

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Resumo

A degeneração dos neurônios dopaminérgicos mesencefálicos (mesDA) é a marca patológica da doença de Parkinson. O estudo dos processos biológicos envolvidos nas funções fisiológicas e na vulnerabilidade e morte desses neurônios é imparativo para entender as causas subjacentes e desvendar a cura para esse distúrbio neurodegenerativo comum. As culturas primárias de neurônios mesDA fornecem uma ferramenta para a investigação das propriedades moleculares, bioquímicas e eletrofisiológicas, a fim de entender o desenvolvimento, a sobrevivência a longo prazo e a degeneração desses neurônios durante o curso da doença. Aqui apresentamos um método detalhado para o isolamento, cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de embriões de camundongos E12.5 (ou ratos E14.5). As condições otimizadas de cultura celular neste protocolo resultam na presença de projeções axonais e dendríticas, conexões sinápticas e outras propriedades morfológicas neuronais, o que torna as culturas adequadas para o estudo das características fisiológicas, biológicas celulares e moleculares desta população neuronal.

Introdução

A perda de neurónios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta conduz aos sintomas motores cardinal de doença de Parkinson (PD), a segunda perturbação neurodegenerativa mais prevalente. A causa básica da morte dessa população neuronal mesencephalic não é conhecido. Para estudar os mecanismos bioquímicos responsáveis ​​pelo desenvolvimento e propriedades moduladoras neurofisiológicos e sobrevivência de neurónios MESDA, várias culturas de células e estudos em modelos animais têm sido utilizados. As linhas celulares imortalizadas, incluindo a linha celular de rato dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), o dopaminérgico linha celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, a linha celular híbrida ratinho dopaminérgicos do mesencéfalo e MN9D humano LUHMES células foram utilizadas para estudos bioquímicos e mecanísticos limitados 1 -5. Para o estudo da perda específica de neurónios MESDA, vários neurotoxina baseada em modelos genéticos e foram desenvolvidos 6-8. Culturas do mesencéfalo ventral primárias, Fornecer uma ferramenta indispensável para o estudo das propriedades neuronais e sinápticos dos neurônios dopaminérgicos e os caminhos envolvidos na patogênese desta doença comum.

Aqui apresenta-se um protocolo detalhado para o isolamento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, que contém modificações resultando em maior capacidade de sobrevivência e o aumento de rendimento de lamelas por embrião. O uso de pré-madura mesencéfalo E12.5 rato (E14.5 no rato) aumenta a capacidade de sobrevivência. Nesta idade neurônios não desenvolveram axônios ainda, o que deixa as células intactas durante a dissecção e minimiza o estresse aumentando assim significativamente a viabilidade. Além disso, dissecção cuidadosa do mesencéfalo ventral, conforme descrito no capítulo 2 do presente protocolo, aumenta ainda mais a capacidade de sobrevivência. Para aumentar o número de lamelas por embrião, um método de plaqueamento alternativa é apresentada na seção 4 deste protocolo. Isto conduz a um rendimento de até 10 lamelas por embrião em comparação com 4 lamelas sobcondições de chapeamento padrão reduzindo assim a quantidade de animais por experimentação.

Neurônios em cultura apresentam crescimento dos axônios e dendritos, formam conexões sinápticas e revelar a presença de marcadores neuronais e sinápticos fazendo essas culturas adequado para imagens de células vivas, imunocitoquímica e estudos eletrofisiológicos. Além disso, a utilização de culturas neuronais facilita a manipulação genética e farmacológica. Crescimento de neurites de dia 2 in vitro permite estudos de desenvolvimento. Além disso, a sobrevivência a longo prazo de culturas (até seis semanas) torna-os adequados para o estudo do processo de degeneração lenta e progressiva destes neurónios.

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Protocolo

NOTA: Os animais foram mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais e de todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Bem-Estar Animal da Faculdade Imperial e Corpo Revisão Ética (AWERB) e do Office Home and Harvard University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC), em conformidade com os regulamentos federais e estaduais.

1. Reagente e configuração de equipamento

  1. Thaw, alíquota e armazenar 1 mg / ml solução Laminin a -80 ºC. Dissolve-se 2 ul de 1 ml de DMEM / F12, resultando em uma concentração de revestimento de 1-2 ug / cm 2.
    NOTA: Thaw Laminin lentamente no gelo e dissolver em frio DMEM / F12 e imediatamente adicioná-lo às placas / lamelas.
  2. Diluir 75 ml de 0,01% poli-L-ornitina em 425 ml PBS e armazenar a 4 ºC.
    NOTA: A vida útil da solução de trabalho é de até um mês.
  3. Dissolve-se 25% (p / v) de BSA em PBS, pH 7,4, e armazenar a 4 ° C durante até uma YEar.
  4. Preparar 50% de FBS (em HBSS) meios de desactivação.
  5. Prepare meio completo por adição de 50 U / ml de penicilina e estreptomicina, 1x suplemento N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% de D - (+) - Glucose (peso / vol), BSA a 0,25% (p / vol) de DMEM / F12 e armazenar a 4 ºC.
    NOTA: O prazo de validade é de até 10 dias.
  6. Coloque as lamelas em ebulição 70% (vol / vol) etanol durante pelo menos 30 minutos para remover quaisquer vestígios de gordura e autoclave.
  7. Coloque as lamelas em placas de 24 poços e adicionar uma solução de 500 ul de poli-L-ornitina a cada poço. Incubar 1 h, sob o capuz de cultura de tecidos à temperatura ambiente e, em seguida, lavar 3 vezes com 500 ul de água. Adicionar solução de laminina de 500 uL a cada placa e incubar S / N na incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ºC.
    NOTA: Enquanto não há lavagens são necessárias após o tratamento laminina, lavando os poli-L-ornitina menos de três vezes resulta em morte das células 24 h após a cultura.
  8. Polonês as pontas de pipetas de vidro sobre o gás natural ou tocha fcoxo.
    NOTA: Após este passo, o diâmetro da ponta deve ser de cerca de metade do seu tamanho normal.
  9. Corte as tampas de 1,5 ml microtubos, usando uma tesoura esterilizada e autoclave.

2. Dissecção da Embryonic Ventral Midbrain

  1. Narcotizar cronometrado-grávidas (E12.5) barragens por inalação de CO 2 e, em seguida, a eutanásia por deslocamento cervical.
  2. Pulverizar o abdómen com etanol a 70% e fazer uma incisão abdominal até que os sacos uterinas são todos expostos. Utilizando uma pinça cortar o acessório vaginal e retirada do útero. Inserir o útero em gelo-HBSS frio, numa placa de Petri de 100 milímetros.
  3. Remover os embriões do útero e do saco amniótico, usando uma pinça (Figura 1C). Coloque em embriões frescos HBSS gelada.
    NOTA: O retângulo na Figura 1D indica a localização do mesencéfalo ventral embrionário.
  4. Coloque os embriões sob um microscópio de dissecção (10x) e dissecar o mesencephalicarco cortando o cérebro no istmo e região de fronteira mesencephalic-diencephalic, usando o bioscissor e fórceps (Figura 1E, por favor, consulte a Figura 1A para linhas de incisão).
  5. Depois de tirar todo o mesencéfalo, faça um corte no mesencéfalo mediodorsal (Figura 1F).
  6. Remover meninges, usando duas pinças (Figura 1H).
    NOTA: passo crítico: Este passo é essencial para o rendimento ideal neuronal e sobrevivência. Uma vez que as condições são óptimas para a cultura de células cerebrais, a maioria das células do tecido circundante morrer após o plaqueamento e o sinal apoptótico deste tecido pode prejudicar a integridade das culturas.
  7. Nivelar o tecido do mesencéfalo na placa de Petri para observar a forma de borboleta e cortar aproximadamente metade de cada asa, utilizando uma lâmina de barbear esterilizada (Figura 1H, I).
    NOTA: Figura 1J retrata o mesencéfalo ventral isolado.
  8. Transferir opedaço de mesencéfalo ventral em gelada HBSS em um tubo cônico de 15 ml e prosseguir com a próxima embrião.
    NOTA: As etapas 2,1-2,8 não deve demorar mais do que 1 hora. Mantendo-se os embriões para além deste período de tempo no gelo diminui significativamente a viabilidade celular.

3. A dissociação de mesencéfalo ventral Cells

  1. Transferem-se as peças de mesencéfalo ventral sob uma câmara de fluxo laminar. Remover o HBSS e adicionar 1 ml de pré-aquecido (37 ºC) de 0,05% de tripsina-EDTA para o tubo cónico (volumes suficientes para até 12 partes de mesencéfalo ventral). Incubar o tecido a 37 ºC durante 5-10 min.
  2. Remover tripsina-EDTA sob o capô e adicionar 1 ml de meio de desactivação (o soro vai desactivar tripsina) para o tecido.
  3. Remover o meio de desactivação e lavar o tecido em 1 ml de meio completo duas vezes.
    NOTA: Evitar a remoção de todo o meio a partir do tubo e a pipetagem do tecido, para impedir a descartar as células dissociadas.
  4. Adicionar completa médio e trit 1mlurato o tecido com um vidro polido pipeta-fogo. Evitar a formação de bolhas e continuar triturando até a suspensão de célula única é alcançado.
    NOTA: Normalmente, 8-10 passa através da ponta restrito são necessários para a dissociação completa.
  5. Centrifuga-se as células a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o meio.
  6. Re-suspender o sedimento em 1 ml de meio completo por lentamente pipetando para cima e para baixo por até quatro vezes.

4. chapeamento Ventral mesencéfalo Cells

  1. Misturar 10 ul da suspensão celular com 90 ul solução de azul de tripano e contagem do número de células com um hemocitómetro.
    NOTA: A viabilidade das células também pode ser verificado, nesta fase.
  2. Coloque tampas de tubos de microcentrífuga esterilizado em pratos de Petri 100 milímetros e transferir as lamelas / laminina revestidas com poli-L-ornitina, usando uma pinça, um de cada vez em cima das tampas.
    NOTA: Não lave as lamelas e evitar a secagem da laminina, uma vez que isso pode causar uneven culturas e diminuição da capacidade de sobrevivência das células.
  3. Ajustar o volume a 1.500 células por 1 ml por adição de meio completo e adicione 100 mL (total de 150.000 células) da suspensão de células no topo de cada lamela (o volume é óptima para cobrir a superfície da lamela sem entornar). Feche os pratos de Petri e incubar durante 1 hora numa incubadora de cultura de tecidos humidificada (37 ° C, 5% CO 2).
    NOTA: PASSO CRÍTICO: Este passo é necessário para aumentar a fixação e a viabilidade das células e para aumentar o número de lamelas por embrião. Alternativamente, as células podem ser transferidos directamente para dentro dos poços contendo lamelas (), mas o número de células poderá ser aumentada para 350.000 por poço (em vez de 150.000). Em outras palavras, usando esse método, 8-10 lamelas podem ser adquiridos, enquanto a transferência direta produz cerca de 3-4 lamelas por causa das células, que ligam às placas (ao lado ou embaixo das lamelas). A viabili médiaty das culturas, utilizando este método era de cerca de 90%.

5. Crescimento e Manutenção de Cultura

  1. Após 1 hora de incubação, transferir cuidadosamente as lamelas incluindo a forma em placas de 24 poços, contendo 400 ul de pré-aquecido (a 37 ° C) de meio completo (volume total: 500 mL). Incubar as células O / N a 37 ºC.
  2. Dentro de 24 horas após a incubação dos poços, adiciona cuidadosamente 500 ul de meio completo para cada poço.
    NOTA: As primeiras horas é a fase mais crítica para a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos eo número de células sobreviventes não muda significativamente para além deste ponto.
  3. Não adicione o meio adicional para as culturas durante as duas primeiras semanas ou até que o meio torna-se amarelo. Se a cultura por mais de duas semanas ou alterações de cor média para amarelo, troca de metade dos meios de comunicação (500 mL), com frescos completos mídia pré-aquecido (normalmente a cada duas semanas).
    NOTA: neurónios dopaminérgicos no interior daculturas iria sobreviver por mais de 6 semanas sob estas condições.

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Resultados

A imuno-histoquímica contra a tirosina hidroxilase (TH) mostra que entre 0,5-1% de células em cultura são dopaminérgica. Projecções neuronais aparecer dentro de 2 horas após o plaqueamento e por o primeiro dia, axónios e dendritos são distinguíveis (Figura 2), utilizando-se para tirosina hidroxilase (TH) e Proteína 2 (Map2) anticorpos associada a microtúbulos (Figura 3). Os neurônios sobreviver por mais de seis semanas e mostrar grande conseqüência. A proporção neurónio-glia nas cultura...

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Discussão

Neurónios dopaminérgicos no mesencéfalo são a principal fonte de dopamina no sistema nervoso central. Eles são divididos em três grupos, substância negra compacta (SNPC), área tegmental ventral (VTA) eo campo retrorubral (RRF) 10, 11. Os neurônios no SNPC e VTA dar origem a grandes vias dopaminérgicas, mesocorticais, mesolímbica e Nigro-estriato, envolvidos em funções, como controle de emoção, motivação e comportamento motor. A decadência dos neurônios no SNPC e perturbação funcional do sistema nigrostriatal ...

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Divulgações

Nenhum conflito de interesses declarado.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado usando os fundos iniciais da Divisão de Ciências do Cérebro, Departamento de Medicina, Imperial College London para K.N.A.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco modificado Eagle mistura de nutrientes médios F-12Invitrogen11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), líquidoInvitrogen24020-117
Soro fetal bovino, inativado por calor (FBS)Invitrogen16140
N2 Suplemento (100X), líquidoInvitrogen17502-048
D-(+)-Glicose solução (45% (peso / vol) em águaSigmaG8769
Albumina de soro bovino BSASigmaA9430
Laminina da membrana basal do sarcoma murino Engelbreth-Holm-SwarmSigmaL2020
Penicilina / estreptomicinaInvitrogen15070
Tripsina (0,05% (peso / vol)Invitrogen25300
Soro bovino cultura de células de albumina (BSA) testadaSigma A9418
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)SigmaP3813
Anti-tirosina hidroxilase (Th)anticorpo Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poli-L-ornitina, solução a 0,01%Anti-Map2 SigmaP4957
(proteína associada a microtúbulos-2A e -2B) anticorpoMilliporeMAB3418
Anti-Sinapsina-1MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 burro anti-coelho IgG    anticorpo Sondas MolecularesA-21206
Alexa Fluor 594 burro anti-coelho IgG    anticorpoSondas MolecularesA-21207
Alexa Fluor 488 burro anti-ovelha IgG    anticorpoSondas MolecularesA-11015
Alexa Fluor 594 burro anti-ovelha IgG    anticorposMolecular ProbesA-11016
Alexa Fluor 594 burro anti-rato IgG    anticorpoSondas MolecularesA-21203
Solução azul de tripano (0,4% (peso / vol))Biowhittaker17-942E
Microscópio EstéreoCarl ZeissStemi 2000-C
Microscópio de contraste de fase invertidaCarl ZeissAxiovert 40 C
Dumont FórcepsFine Scientific ToolsMay-45
Fórceps de lamínula – Ferramentas Científicas Finas Dumoxel11251-33
Duas Pinças Dumont #45 - ndash; DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Porta-lâmina/Disjuntor Punho Plano - 11cmFine Scientific Tools10052-11
Tesoura de Íris de Estudante - Reta 11,5 cmFine Scientific Tools91460-11
Iluminador de halogênio de fibra ópticaMKII
Pipetas Pasteur de Vidro Borossilicato DescartáveisFisherbrandHemocitômetro 13-678-20C
ProscitechSVZ2NIOU
0.2 µ m unidades de filtro estérilNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm Placas de PetriBD Biosciences351005
Lamínula de Cobertura Redonda #1 Espessura Vidro Alemão 12 mmVidro Bellco1943-10012 
Nikon

Referências

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