Artigo de método
As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.
A degeneração dos neurônios dopaminérgicos mesencefálicos (mesDA) é a marca patológica da doença de Parkinson. O estudo dos processos biológicos envolvidos nas funções fisiológicas e na vulnerabilidade e morte desses neurônios é imparativo para entender as causas subjacentes e desvendar a cura para esse distúrbio neurodegenerativo comum. As culturas primárias de neurônios mesDA fornecem uma ferramenta para a investigação das propriedades moleculares, bioquímicas e eletrofisiológicas, a fim de entender o desenvolvimento, a sobrevivência a longo prazo e a degeneração desses neurônios durante o curso da doença. Aqui apresentamos um método detalhado para o isolamento, cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de embriões de camundongos E12.5 (ou ratos E14.5). As condições otimizadas de cultura celular neste protocolo resultam na presença de projeções axonais e dendríticas, conexões sinápticas e outras propriedades morfológicas neuronais, o que torna as culturas adequadas para o estudo das características fisiológicas, biológicas celulares e moleculares desta população neuronal.
A perda de neurónios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta conduz aos sintomas motores cardinal de doença de Parkinson (PD), a segunda perturbação neurodegenerativa mais prevalente. A causa básica da morte dessa população neuronal mesencephalic não é conhecido. Para estudar os mecanismos bioquímicos responsáveis pelo desenvolvimento e propriedades moduladoras neurofisiológicos e sobrevivência de neurónios MESDA, várias culturas de células e estudos em modelos animais têm sido utilizados. As linhas celulares imortalizadas, incluindo a linha celular de rato dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), o dopaminérgico linha celular de neuroblastom....
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NOTA: Os animais foram mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais e de todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Bem-Estar Animal da Faculdade Imperial e Corpo Revisão Ética (AWERB) e do Office Home and Harvard University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC), em conformidade com os regulamentos federais e estaduais.
1. Reagente e configuração de equipamento
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A imuno-histoquímica contra a tirosina hidroxilase (TH) mostra que entre 0,5-1% de células em cultura são dopaminérgica. Projecções neuronais aparecer dentro de 2 horas após o plaqueamento e por o primeiro dia, axónios e dendritos são distinguíveis (Figura 2), utilizando-se para tirosina hidroxilase (TH) e Proteína 2 (Map2) anticorpos associada a microtúbulos (Figura 3). Os neurônios sobreviver por mais de seis semanas e mostrar grande conseqüência. A proporção neurónio-glia nas cultura.......
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Neurónios dopaminérgicos no mesencéfalo são a principal fonte de dopamina no sistema nervoso central. Eles são divididos em três grupos, substância negra compacta (SNPC), área tegmental ventral (VTA) eo campo retrorubral (RRF) 10, 11. Os neurônios no SNPC e VTA dar origem a grandes vias dopaminérgicas, mesocorticais, mesolímbica e Nigro-estriato, envolvidos em funções, como controle de emoção, motivação e comportamento motor. A decadência dos neurônios no SNPC e perturbação funcional do sistema nigrostriatal .......
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Nenhum conflito de interesses declarado.
Este trabalho foi realizado usando os fundos iniciais da Divisão de Ciências do Cérebro, Departamento de Medicina, Imperial College London para K.N.A.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco modificado Eagle mistura de nutrientes médios F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), líquido | Invitrogen | 24020-117 | |
| Soro fetal bovino, inativado por calor (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Suplemento (100X), líquido | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glicose solução (45% (peso / vol) em água | Sigma | G8769 | |
| Albumina de soro bovino BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminina da membrana basal do sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma | L2020 | |
| Penicilina / estreptomicina | Invitrogen | 15070 | |
| Tripsina (0,05% (peso / vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Soro bovino cultura de células de albumina (BSA) testada | Sigma | A9418 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-tirosina hidroxilase (Th) | anticorpo Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poli-L-ornitina, solução a 0,01% | Anti-Map2 Sigma | P4957 | |
| (proteína associada a microtúbulos-2A e -2B) anticorpo | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Sinapsina-1 | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-coelho IgG | anticorpo Sondas Moleculares | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-coelho IgG anticorpo | Sondas Moleculares | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ovelha IgG anticorpo | Sondas Moleculares | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-ovelha IgG anticorpos | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-rato IgG anticorpo | Sondas Moleculares | A-21203 | |
| Solução azul de tripano (0,4% (peso / vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Microscópio Estéreo | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Microscópio de contraste de fase invertida | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Fórceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Fórceps de lamínula – Ferramentas Científicas Finas Dumoxel | 11251-33 | ||
| Duas Pinças Dumont #45 - ndash; Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Porta-lâmina/Disjuntor Punho Plano - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Tesoura de Íris de Estudante - Reta 11,5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Iluminador de halogênio de fibra óptica | MKII | ||
| Pipetas Pasteur de Vidro Borossilicato Descartáveis | Fisherbrand | Hemocitômetro 13-678-20C | |
| Proscitech | SVZ2NIOU | ||
| 0.2 µ m unidades de filtro estéril | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Placas de Petri | BD Biosciences | 351005 | |
| Lamínula de Cobertura Redonda #1 Espessura Vidro Alemão 12 mm | Vidro Bellco | 1943-10012 |
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