Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.
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Artigo de método
Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem multifotônica em tempo real oferece uma grande oportunidade para estudar o tráfego celular e as interações célula a célula em seu ambiente fisiológico tridimensional. As atividades biológicas das células imunes dependem principalmente de suas capacidades de motilidade. Os monócitos sanguíneos têm meia-vida curta na corrente sanguínea; eles se originam na medula óssea e são constitutivamente liberados dela. Na condição inflamatória, esse processo é potencializado, levando à monocitose sanguínea e subsequente infiltração dos tecidos inflamatórios periféricos. Identificar os eventos biomecânicos que controlam o tráfego de monócitos da medula óssea para a rede vascular é um passo importante para entender a relevância fisiopatológica dos monócitos. Realizamos imagens de lapso de tempo in vivo por microscopia de dois fótons da medula óssea do crânio do camundongo Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). O camundongo MacBlue expressa a proteína fluorescente ciano aprimorada (ECFP) sob o controle de um promotor específico mielóide 1, em combinação com a marcação da rede vascular. Descrevemos como essa abordagem permite o rastreamento de monócitos medulares individuais em tempo real para quantificar ainda mais o comportamento migratório dentro do parênquima da medula óssea e da vasculatura, bem como as interações célula a célula. Essa abordagem fornece novos insights sobre a biologia dos subconjuntos de monócitos da medula óssea e permite abordar ainda mais como essas células podem ser influenciadas em condições patológicas específicas.
Introdução
A medula óssea desempenha um papel central na hematopoiese e representa o principal reservatório de monócitos que recirculam constitutivamente entre o sangue e o parênquima medular, renovam o pool de monócitos circulantes com vida curta 2,3 e participam da reconstituição dos macrófagos teciduais e células dendríticas em estado estacionário 4. Durante a inflamação ou após a aplasia transitória, os monócitos são mobilizados ativamente da medula óssea ou do baço 5, 6, 7 e colonizam os órgãos inflamados. Vários eixos quimioatraentes têm sido envolvidos no processo de mobilização de células mieloides da medula óssea 8, 5, 6,....
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Protocolo
NOTA: Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Experimentação Animal e Ética Comitê de francês e validado pelo "Serviço de Proteção ao et Santé Animales, Environnement" com o número de A-75-2065. Os tamanhos das amostras são escolhidos para assegurar a reprodutibilidade dos ensaios, e de acordo com o 3R de regulação ética dos animais.
1. Preparação do Rato
- Anestesia
- Para curto período de imagem (menos do que 1 hora), anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 200 ul de uma solução salina contendo cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- Em alternativa, por um período mai....
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Resultados
A estrutura do crânio mouse oferece uma boa oportunidade para estudar a fisiologia da medula óssea por imagem intravital. O osso ser magro em torno da área frontal-parietal, é possível ter acesso a nichos medulares sem abrasão do osso. A Figura 1 representa um campo 2D grande do crânio de um camundongo transgênico MacBlue. A matriz do osso é composta principalmente de colagénio I facilmente detectável por SHG 19. Injecção de rodamina-dextrano mancha da rede vascular da medula óssea e permite .......
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Discussão
Os pontos críticos da metodologia de imagiologia in vivo, são para assegurar a estabilidade do foco, de modo a maximizar a duração das imagens e para minimizar o risco de contaminação bacteriana e inflamação, que pode ter impacto na dinâmica das células inflamatórias. Imagem da medula óssea do crânio segue estes objectivos como a cirurgia realizada para obter o acesso para a medula óssea é mínima. A utilização de materiais estéreis e anti-sépticos é essencial para limitar o risco de infecção que pode ind.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Anne Daron e Pierre Louis Loyher de assistência editorial, o Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) para a assistência com o microscópio de dois fótons e do Mecanismo de animal "NAC" e Camille Baudesson para ratos reprodutores assistência. A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão n ° 304810 - RAIDs, e n ° 241440-Endostem, do Inserm, pela Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", de la" Ligue contre le câncer ", de" Association pour la Recherche sur le Cancer "e de" Agence Nationale de la Recherche "Emergence Pro....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ketamin | Merial | 100 mg / ml, anestésico | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg / ml, anestésico | |
| Isofluran | Baxter | 2,5%, anestésico | |
| O2< / sub> / NO2< / sub> | 70/30 mistura, anestésico | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg / ml, Coloração vascular | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, coloração de neutrófilos | |
| Suporte estereotáxico | Cirurgia | caseira | |
| Etanol 70% | cirurgia | ||
| Tesoura estéril e pinça | |||
| cirurgia Anel | 18 mm de diâmetro, cirurgia | ||
| Glubran 2 | Queryo Cola Cirúrgica Médica | , fixação de anel de borracha | |
| Agulhas de pequeno calibre | Cirurgia | Terumo | |
| Microscópio multifotônico Zeiss LSM 710 NLO | Microscópio Carl Zeiss | ||
| Ti:Laser de cristal de safira | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulsos de luz NIR | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Software de Aquisição | |
| Imaris Bitplane | plano | , rastreamento automático 3D | |
| PBS 1X | D. Dutscher | cirurgia | |
| Câmara termostatizada | Carl Zeiss | intravital |
Referências
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I.
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Reimpressões e permissões
