Artigo de método

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos In Vivo

DOI:

10.3791/52476

⸱

27 de fevereiro de 2015

 ,  ,  , 
1Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

Neste artigo

Resumo

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Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Resumo

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A imagem multifotônica em tempo real oferece uma grande oportunidade para estudar o tráfego celular e as interações célula a célula em seu ambiente fisiológico tridimensional. As atividades biológicas das células imunes dependem principalmente de suas capacidades de motilidade. Os monócitos sanguíneos têm meia-vida curta na corrente sanguínea; eles se originam na medula óssea e são constitutivamente liberados dela. Na condição inflamatória, esse processo é potencializado, levando à monocitose sanguínea e subsequente infiltração dos tecidos inflamatórios periféricos. Identificar os eventos biomecânicos que controlam o tráfego de monócitos da medula óssea para a rede vascular é um passo importante para entender a relevância fisiopatológica dos monócitos. Realizamos imagens de lapso de tempo in vivo por microscopia de dois fótons da medula óssea do crânio do camundongo Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). O camundongo MacBlue expressa a proteína fluorescente ciano aprimorada (ECFP) sob o controle de um promotor específico mielóide 1, em combinação com a marcação da rede vascular. Descrevemos como essa abordagem permite o rastreamento de monócitos medulares individuais em tempo real para quantificar ainda mais o comportamento migratório dentro do parênquima da medula óssea e da vasculatura, bem como as interações célula a célula. Essa abordagem fornece novos insights sobre a biologia dos subconjuntos de monócitos da medula óssea e permite abordar ainda mais como essas células podem ser influenciadas em condições patológicas específicas.

Introdução

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A medula óssea desempenha um papel central na hematopoiese e representa o principal reservatório de monócitos que recirculam constitutivamente entre o sangue e o parênquima medular, renovam o pool de monócitos circulantes com vida curta 2,3 e participam da reconstituição dos macrófagos teciduais e células dendríticas em estado estacionário 4. Durante a inflamação ou após a aplasia transitória, os monócitos são mobilizados ativamente da medula óssea ou do baço 5, 6, 7 e colonizam os órgãos inflamados. Vários eixos quimioatraentes têm sido envolvidos no processo de mobilização de células mieloides da medula óssea 8, 5, 6,9. Além do compartimento mieloide, a medula óssea também é um importante local de priming de linfócitos T 10 e um nicho de memória imunológica 11,12. Assim, esse tecido é central para inúmeras investigações no campo da hematologia e imunologia. Nosso conhecimento sobre a organização estrutural das células mieloides medulares decorre principalmente da análise da secção histológica dos tecidos fixos 13. Essa visão estática não permite um estudo da dinâmica de troca celular entre os diferentes compartimentos da medula óssea, que é a base de sua atividade funcional.

A imagem intravital constitui um importante insumo biológico no estudo da mobilidade celular, adesão celular e interações célula a célula, que foram descritas anteriormente apenas em sistemas in vitro. Os desafios técnicos para imagens intravitais adequadas incluem a capacidade de alcançar o tecido de interesse do ponto de vista óptico e maximizar seu isolamento de desvios fisiológicos (respiração, músculos ou contrações peristálticas) ou mecânicos (ruptura e extensão do tecido após a cirurgia e exposição à objetiva microscópica, bem como perturbações de temperatura e vascular/oxigenação). Desvios microscópicos podem limitar a capacidade de manter o foco por muito tempo e podem introduzir artefatos na quantificação da motilidade celular. Uma alternativa, validada para vários tecidos para reduzir essas dificuldades técnicas, é trabalhar em tecido explantado incubado em meio termostatizado e oxigenado; no entanto, a interrupção completa da circulação linfática e vascular pode ser problemática. A imagem intravital da medula óssea do crânio tem várias vantagens em relação a essas questões. Em primeiro lugar, requer ação cirúrgica mínima. Em segundo lugar, a espessura do osso nesta região permite a visualização direta dos nichos da medula óssea sem abrasão, reduzindo assim as perturbações fisiológicas. A rede medular pode ser visualizada na região parassagital do osso; no entanto, os sinusóides são mais visíveis na área fronto-parietal, onde a matriz óssea é mais fina12,14.

A imagem intravital depende da disponibilidade do repórter fluorescente mais preciso marcando a população de interesse. A marcação in vitro da população de células purificadas antes da transferência adotiva levou a uma importante caracterização de nichos de células-tronco hematopoiéticas 15 ou microdomínios endoteliais da medula óssea favorecendo o enxerto tumoral 16 e forneceu várias informações fundamentais sobre conceitos-chave em imunologia 17. No entanto, essa abordagem geralmente requer centenas de milhares de células para ter a chance de detectá-las posteriormente in vivo. Isso pode ser explicado pela alta taxa de mortalidade após a coloração, a diluição em todo o corpo e a mudança no estado de ativação, o que pode levar a um homing tendencioso. A marcação endógena do sistema de camundongos transgênicos supera muito essas limitações e permitiu a imagem do comportamento de osteoblastos endógenos 8, megacariócitos 18 ou subconjuntos de linhagem mielóide 6. No entanto, é preciso ser cauteloso ao considerar a especificidade do repórter fluorescente entre o subconjunto estudado.

O Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, chamado MacBlue mouse 1, é um sistema transgênico valioso para estudar monócitos medulares com imagens em tempo real 6. A injeção intravenosa de rodamina-dextrana de alto peso molecular distingue o parênquima medular da rede sinusóide vascular da medula óssea. Usando essa abordagem, é possível rastrear o comportamento dos monócitos nos diferentes compartimentos medulares em um contexto fisiopatológico específico de interesse. Além disso, propomos uma estratégia adicional para comparar a dinâmica dos monócitos com a dos neutrófilos por meio da marcação in vivo usando um anticorpo específico.

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Protocolo

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NOTA: Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Experimentação Animal e Ética Comitê de francês e validado pelo "Serviço de Proteção ao et Santé Animales, Environnement" com o número de A-75-2065. Os tamanhos das amostras são escolhidos para assegurar a reprodutibilidade dos ensaios, e de acordo com o 3R de regulação ética dos animais.

1. Preparação do Rato

  1. Anestesia
    1. Para curto período de imagem (menos do que 1 hora), anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 200 ul de uma solução salina contendo cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
    2. Em alternativa, por um período maior de imagiologia (até 4 horas), anestesiar o rato com uma inalação de isoflurano 2,5% vaporizado numa mistura de O 2 / N 2 O, 70/30 através de uma máscara adaptada.
    3. NOTA: Este modo fornece para inconsciência mais estável e evita a injeção intraperitoneal de série de drogas.
    4. Uma vez que o mouse é anestesiado, verifique se há perda de consciência por meio da estimulação da pata traseira com pinças.
  2. Coloração Vascular / coloração adicional
    1. Para a coloração vascular: injectar por via intravenosa na veia da cauda, ​​a 200 ul de rodamina-dextrano (MDA 2, 10 mg / ml em tampão de solução salina).
    2. Para a coloração dos neutrófilos: injectar 2 ug de Ly6G-PE (clone 1A8) em 100 ul de solução salina por via endovenosa na veia da cauda.
  3. Imobilização
    1. Para a imobilização, use um suporte stereotactic custom made adaptada ao microscópio e à inhalator gás anestésico.
      NOTA: O titular sterotactic é um suporte de metal com dois suportes de placa de metal, sendo uma fixa e outra removível e adaptável, para apertar a cabeça do animal.
    2. Instale a cabeça do rato entre as placas de retenção para garantir o isolamento dos movimentos respiratórios. Aperte os ouvidos entre as placas de retenção e de cabeça para esticar a sk. Verifique para a estabilidade eo bem-estar do animal respirando.
  4. Remover o couro cabeludo
    1. Usar cuidadosamente etanol a 70% para molhar o cabelo do couro cabeludo com um aplicador estéril, evitando o contacto com os olhos.
    2. Corte a pele com tesouras e pinças estéreis para remover totalmente o couro cabeludo do trás do osso parietal até o osso frontal. Mantenha-se afastado até 3 mm de olhos e ouvidos para prevenir hemorragia extensa. Remover o tecido conjuntivo frouxo que cobre o crânio (periósteo). Lave o cabelo restante com toalha de papel embebido PBS-quente.
  5. O sistema de imersão configurado
    1. Cole um anel de borracha de 18 milímetros de diâmetro com cola cirúrgica diretamente no crânio com uma pequena agulha de calibre para controlar a distribuição. Cola de toda a periferia do anel de borracha para evitar fugas (30 mL deve ser suficiente).
    2. Limpe o crânio debaixo do ringue pela última vez com toalha de papel PBS-encharcado e em seguida, adicione 37 ° C PBS para imersão completa docrânio. Adicionar uma gota de solução de NaCl a 0,9% ou uma pomada oftálmica específica em cada olho do rato para evitar a secura ocular. Arraste o titular estereotáxica no âmbito do objectivo.
    3. Cerca de posicionar o campo usando o microscópio ocular através da transmissão direta.

2. Dois fótons Imaging Acquisition

  1. Use um microscópio multiphoton juntamente com um laser de Ti: cristal de safira, que fornece 140fs pulsos de luz NIR, ajustáveis ​​seletivamente de 680 a 1080 nm, e um modulador acústico-ótico para o controle de potência do laser. Usar uma configuração incluindo 3 detectores externos não descanned (NDD) (que permitem a gravação simultânea de três canais fluorescentes) com uma combinação de dois espelhos dicróicos (565 nm e 690 nm), 565/610 e 500/550 filtros passa-banda, e um 485 filtro de passagem curta, com um plano de Apochromat × 20 (NA = 1) objetiva de imersão em água.
  2. Defina a câmara de aquecimento para permitir uma boa homeothermy dos Anaesrato thetized.,
    NOTA: Temperatura pode ser definido de 1 hora antes de imagem sessão para melhor estabilidade. No nosso caso, de 32 ° C foi escolhida para obter a temperatura ideal do corpo do rato anestesiado (36-37 ° C) e é mantida até 4 horas. Esta temperatura pode ser adaptado para o sistema utilizado (sonda digital pode ser utilizado para verificar este ponto). Além disso, a câmara de aquecimento é utilizada escuro / preto e cobre uma parte do sistema (placa de objectivos e motorizado) para evitar a contaminação de luz externa.
  3. Ligue o sistema
    1. Ligue o laser de Ti: Safira, então todo o sistema de microscópio. Inicie o software de aquisição. Defina o intervalo de comprimento de onda do laser de 870 nm. Selecione NDD apropriado para a gravação.
      NOTA: No nosso caso, geração de segundo harmônico (SHG) 19 e proteína fluorescente ciano (ECFP) são detectados pelo NDD após o filtro de passagem curta 485. ECFP também é detectado pelo NDD depois do filtro passa-banda e 500/550 rodamina-dextrano é detectado por tele NDD após o filtro passa-banda 565/610.
  4. Ajustar as definições de aquisição
    1. Use o comando de imagem "aquisição ao vivo" do software e utilizar o controle direcional microscópio, ajustar o foco em uma região com sinal ECFP e Rhodamine. Definir a potência do laser para o mínimo para se obter a melhor relação sinal-para-ruído com um mínimo de foto-lesão.
      NOTA: O ajuste de potência utilizada varia de acordo com a profundidade da região de interesse. Normalmente as configurações de OMA estão situados em torno de 20%, o que representa uma potência do laser para além do objetivo em torno de 15 mW. É melhor aumentar o ganho de poder nas PMT para cada NDD para reduzir foto-branqueamento e foto-dano. Configurações de aquisição típicos são a digitalização única, com um tempo de permanência de pixel de 1,58 uS, e uma resolução de 512 x 512 pixels com uma ampliação de 1,5.
  5. Selecione as regiões de interesse
    1. Uma vez que os parâmetros de gravação são definidos, use novamente o comando de aquisição "ao vivo",e examinar o tecido para escolher um (x y z,) campo desejado para ser monitorado em tempo real.
      NOTA: Normalmente, nós escolhemos um campo incluindo tanto vascular e áreas de parênquima.
    2. Registre-se o campo com o comando de software "posição".
      NOTA: Este comando memoriza x, y, z coordenadas de diferentes áreas distantes.
    3. Selecione e registrar campos adicionais de interesse (até 3), utilizando o mesmo procedimento.
    4. Definir um z-pilha 3D com o comando de software "z-stack" na primeira posição memorizado de acordo com o volume necessário com a ampliação escolhida. Memorize posição mais profunda em primeiro lugar, e, em seguida, a posição mais alta. Normalizar poder do laser com a profundidade.
      NOTA: Para múltiplos imaging campo concomitante, adquirimos 5 fatias separadas por 3 um z-passos para cada campo de adquirir um volume de 12 mm de espessura. Estas configurações podem ser adaptadas ao tipo de célula estudada.
  6. Aquisição de Lançamento
    1. Selecione o220; comando série "software e escolher a duração do intervalo de tempo e do número de ciclos de tempo. Comece imagem time-lapse de acordo com o lapso de tempo e duração necessária escolhendo o comando software "iniciar a experiência".
      NOTA: No nosso caso, nós adquirimos um volume cada 30 segundos durante 60 ciclos que representam 30 min tempo real. Menor lapso de tempo pode ser executada para controlar rolagem celular rápido no vaso sanguíneo. Neste caso, mais fina z-pilha e não mais do que dois domínios diferentes podem ser gravadas ao mesmo tempo.
    2. O acompanhamento regular do set up.
      1. Sempre monitorar o animal para se certificar de que está inconsciente.
        NOTA: Agitação de bigodes ou pernas do animal são indicadores de avivamento. Em caso de respiração do animal é irregular, a quantidade de isoflurano pode ser ligeiramente reduzida. Deriva tecido forte durante a aquisição é um indicador do rato avivamento.
      2. Verifique se o objetivo for devidamente imerso. Renove 37 ° C PBS between duas aquisições (30 min).
        NOTA: o desaparecimento progressivo de sinal durante a aquisição é indicador de PBS vazamento.
  7. Fim do procedimento
    1. Uma vez que os vídeos exigidos sejam registrados, sacrificar o animal por deslocamento cervical rapidamente antes de reanimação.
      NOTA: a cicatrização de feridas, conduz à formação de uma crosta em de 24 a 48 horas o que limita a possibilidade de realizar imagem longitudinal.

Análise 3. Dados

  1. Correção de deriva
    1. Use software Imaris Bitplane para rastreamento automático 3D.
    2. Abra a sequência de imagens 3D em Imaris. Selecione "spot" de comando e gerar rastreamento manual (clique do mouse + shift) para todos os pontos de tempo para um mínimo de quatro pontos de ancoragem diferentes, se possível homogeneamente distribuída no campo.
    3. Aplique a correção de desvio utilizando o comando "deriva correta" na aba "editar faixa".
    4. Verifique a existência de tele qualidade da correcção em x, y e z, em particular para evitar a vacilação artefactual.
      NOTA: Se a correção não for satisfatória, tentar outros pontos de ancoragem ou excluir o vídeo da análise.
  2. Rastreamento de celular
    1. Use "adicionar novos pontos de comando" e selecione "pontos de trilha ao longo do tempo" ajuste algoritmo. Ir para a próxima etapa.
    2. Aplicar procedimento de rastreamento automático de células, quer por todo o canal de interesse usando o comando "canal de origem". Conjunto de objectos (isto é, células) de diâmetro e 10 um. Ir para a próxima etapa.
      NOTA: A escolha dependerá da distinção entre objectos e especificidade do sinal medido. Em suma, o rastreamento automático em todo o canal só é possível se o sinal detectado é específica para o objeto de interesse. Porque tanto SHG e ECFP são detectados pelo NDD após o filtro 485 passe curto, rastreamento será mais específico e eficiente utilizando o sinal ECFP registrado pelo NDD após o 500/550 filtros passa-banda. Agrupado ou objetos embalados densas exigirá seleção manual de objetos individuais semelhantes, para a etapa 3.1.2.
    3. Selecione "qualidade" tipo de filtro, defina o limite para exclusão de rastreamento de objetos inespecíficos. Ir para a próxima etapa.
    4. Escolha "browniano Algorithm Motion" com parâmetros precisos de "distância Max" e "tamanho Gap" entre dois pontos. Validar geração pista.
    5. Uma vez que as faixas são calculadas automaticamente, selecione "duração faixa" tipo de filtro, definir o limite para eliminar faixas mais curto do que 120 segundos (o que representa 4 pontos de tempo).
    6. Obrigatório: Após rastreamento automático, verificar a qualidade das faixas.
      1. Desenrole a barra de tempo para verificar se os objetos de seguir os caminhos de trilha. Se não, use as opções de correção ponto de trilha disponíveis na aba "editar": Excluir faixas falsas ou inadequadas com "excluir" comando (excluir qualquer faixa point individualmente usando o comando "Desligar"). Se trajeto da trilha é descontínua, adicionar pontos de tempo em falta (clique do mouse + Shift), selecione todos os pontos em uma determinada faixa e usar "conectar" o comando na aba "editar faixa".
  3. Parâmetros de quantificação
    1. Selecione a aba "Estatísticas" no comando "Preferências", escolha os parâmetros dinâmicos de interesse na lista. Selecione "Exportar todas as estatísticas para o arquivo" comando e salvar o arquivo excel gerado.
      Nota: Vários parâmetros dinâmicos são directamente obtidos a partir do software, tais como comprimentos de pista, velocidade instantânea, velocidade média, e acompanhar retidão. Coeficiente de motilidade 6, 20 pode ser determinada, mas não é directamente fornecida pelo software.
    2. Para cada célula, calcular a média dos deslocamentos para cada período de tempo (dt) (para um filme de 30 segundos lapso de tempo, dt será de 30, 60, 90 s, etc.).Traça-se a média de deslocamento do quadrado como uma função do intervalo de tempo. Obter coeficiente de motilidade, calculando o declive da parte linear da curva.

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Resultados

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A estrutura do crânio mouse oferece uma boa oportunidade para estudar a fisiologia da medula óssea por imagem intravital. O osso ser magro em torno da área frontal-parietal, é possível ter acesso a nichos medulares sem abrasão do osso. A Figura 1 representa um campo 2D grande do crânio de um camundongo transgênico MacBlue. A matriz do osso é composta principalmente de colagénio I facilmente detectável por SHG 19. Injecção de rodamina-dextrano mancha da rede vascular da medula óssea e permite ...

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Discussão

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Os pontos críticos da metodologia de imagiologia in vivo, são para assegurar a estabilidade do foco, de modo a maximizar a duração das imagens e para minimizar o risco de contaminação bacteriana e inflamação, que pode ter impacto na dinâmica das células inflamatórias. Imagem da medula óssea do crânio segue estes objectivos como a cirurgia realizada para obter o acesso para a medula óssea é mínima. A utilização de materiais estéreis e anti-sépticos é essencial para limitar o risco de infecção que pode ind...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Anne Daron e Pierre Louis Loyher de assistência editorial, o Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) para a assistência com o microscópio de dois fótons e do Mecanismo de animal "NAC" e Camille Baudesson para ratos reprodutores assistência. A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão n ° 304810 - RAIDs, e n ° 241440-Endostem, do Inserm, pela Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", de la" Ligue contre le câncer ", de" Association pour la Recherche sur le Cancer "e de" Agence Nationale de la Recherche "Emergence Programa 2012 (ANR-EMMA-050). PH foi apoiada por la "Ligue contre le cancer".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
KetaminMerial100 mg / ml, anestésico
XylazinBayer HealthCare10 mg / ml, anestésico
IsofluranBaxter2,5%, anestésico
O2< / sub> / NO2< / sub>70/30 mistura, anestésico
Rhodamin-DextranInvitrogen2 MDa, 10 mg / ml, Coloração vascular
Ly6G-PEBecton-Dickinsonclone 1A8, coloração de neutrófilos
Suporte estereotáxicoCirurgiacaseira
Etanol 70%cirurgia
Tesoura estéril e pinça
cirurgia Anel18 mm de diâmetro, cirurgia
Glubran 2Queryo Cola Cirúrgica Médica, fixação de anel de borracha
Agulhas de pequeno calibreCirurgiaTerumo
Microscópio multifotônico Zeiss LSM 710 NLO Microscópio Carl Zeiss
Ti:Laser de cristal de safira Coherent Chameleon Ultra140 fsec pulsos de luz NIR
Zen 2010Carl ZeissSoftware de Aquisição
Imaris Bitplane plano, rastreamento automático 3D
PBS 1XD. Dutschercirurgia
Câmara termostatizadaCarl Zeissintravital
de borracha Software de análise de de bits

Referências

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