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Artigo de método

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

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DOI:

10.3791/52480

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7 de janeiro de 2015

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

Neste artigo

Resumo

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

Resumo

As células estromais regular o recrutamento de leucócitos circulantes durante a inflamação através de cross-talk com células endoteliais vizinhas. Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes de fluxo pelas células endoteliais inflamadas. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar o papel das células estromais, neste caso as células estaminais mesenquimais (MSC), em regular o recrutamento de leucócitos.

Células endoteliais primárias foram cultivadas isoladamente ou em conjunto com MSC humana em contacto directo em microslides Ibidi ou em lados opostos de um filtro Transwell durante 24 h. As culturas foram estimuladas com factor de necrose tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas e incorporadas num ensaio de adesão com base em fluxo. Um bolus de neutrófilos foi perfundidoao longo do endotélio, durante 4 min. A captura de fluir neutrófilos e suas interações com o endotélio foi visualizado por microscopia de contraste de fase.

Em ambos os modelos, a estimulação de citoquinas-endotelial aumento do recrutamento de neutrófilos fluindo de uma maneira dependente da dose. A análise do comportamento dos neutrófilos recrutados mostraram um decréscimo dependente da dose no rolamento e um aumento dependente da dose na transmigração através do endotélio. Em co-cultura, MSC suprimida adesão de neutrófilos ao endotélio estimulada-TNF.

Os nossos modelos baseados na aderência de fluxo de imitar as fases iniciais do recrutamento de leucócitos da circulação. Além de leucócitos, que pode ser usado para examinar o recrutamento de outros tipos de células, tais como células tumorais circulantes ou MSC administrados terapeuticamente. Os nossos modelos de multi-camadas de co-cultura MSC demonstraram que comunicam com endotélio para modificar a sua resposta a citocinas pró-inflamatórias, Altering o recrutamento de neutrófilos. Mais pesquisas utilizando esses modelos é necessário para entender completamente como células estromais de diferentes tecidos e condições (doenças inflamatórias ou câncer) influenciam o recrutamento de leucócitos durante a inflamação.

Introdução

A inflamação é uma resposta protectora contra a infecção microbiana ou lesão do tecido que requer regulação apertada de entrada e saída de leucócitos a partir do tecido inflamado para permitir a resolução de 1,2. Conversa cruzada entre as células endoteliais (CE) que os navios de linha de sangue, leucócitos circulantes e células do estroma do tecido residente é essencial para coordenar este processo 3. No entanto, o recrutamento descontrolada de leucócitos e sua desobstrução ineficaz de apoiar o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas 4. A nossa compreensão atual de recrutamento de leucócitos na saúde e na doença é incompleta e modelos mais robustos são necessários para analisar este processo.

Os mecanismos de apoio ao recrutamento de leucócitos do sangue por meio CE vascular em vênulas pós-capilares foram bem descritas 1,2,5. Leucócitos circulantes são capturados por receptores especializados (por exemplo, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) quesão-regulada no endotélio inflamado. Essas interações transientes permitir leucócitos para interagir com a superfície vinculado quimiocinas e mediadores derivados de lipídeos (ou endoteliais ou estromais na origem) que ativam integrinas expressas pelos leucócitos 6- 11. Este, por sua vez estabiliza adesão e migração unidades através do endotélio e no tecido 12- 15. Dentro do tecido, os leucócitos são recrutados sujeitos a agentes derivados de estroma que influenciam a motilidade, função e sobrevivência 16,17. Evidências crescentes sugerem fortemente que os sinais recebidos em cada etapa das condições do processo de recrutamento de leucócitos para a próxima. No entanto, a nossa compreensão do recrutamento de leucócitos permanece incompleta e muito pouco se sabe sobre o movimento de leucócitos componentes formação dentro do tecido.

Em Birmingham, temos desenvolvido vários modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de leucócitos a partir defluir 9,18,19. Agora entendemos que atuam CE vascular reguladores como imediatos de recrutamento de leucócitos de responder às mudanças em seu microambiente local. Especificamente, as células do estroma do tecido residente pode regular ativamente a resposta inflamatória, em parte, conversando com a vizinha CE vascular para influenciar o seu papel no recrutamento 3. Mostrámos previamente que várias células do estroma modular a capacidade da EC para suportar a adesão e migração de leucócitos de uma forma específica do tecido, e que estes efeitos são alteradas em doenças crónicas 13,16,20,21. Assim, as células do estroma estabelecer tecido 'Endereço-códigos "que definem o contexto de cada resposta inflamatória 22. Mais recentemente, têm demonstrado que o MSC de medula óssea derivada (BMMSC) potentemente a infra-regular a resposta de CE de citocinas, que conduz a uma redução no recrutamento dos neutrófilos e linfócitos 23.

Os mecanismos govlando recrutamento elucidados in vitro foram amplamente utilizados ensaios incorporando um único tipo de células (por exemplo, EC) ou proteína de forma isolada. No entanto, estes estudos não levam em consideração os efeitos do ambiente local do tecido (isto é, a presença de células estromais) sobre o recrutamento de leucócitos e a sua subsequente migração para o tecido. Aqui nós descrevemos dois métodos baseadas no fluxo em que as células do estroma, especificamente as células-tronco mesenquimais (MSC), são co-cultivadas com EC 23. Esses modelos permitem-nos examinar o efeito de células do estroma em respostas endoteliais, em particular a sua capacidade de apoiar o recrutamento de leucócitos de fluxo.

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Protocolo

1. Isolamento e cultura de células endoteliais humanas primárias e Células-Tronco Mesenquimais

  1. Células isolamento e cultivo de humanos umbilical endoteliais veia (HUVEC):
    1. Coloque cordão umbilical num tabuleiro com toalhas de papel e pulverizar com etanol a 70%. Coloque em uma capa de cultura de tecidos. Identificar a veia e canular em ambas as extremidades. Coloque uma braçadeira em torno do fim canulada para prendê-lo.
    2. Lave a sangue venoso com PBS usando uma seringa. Encha a seringa com ar e passar através da veia para remover e descartar o PBS residual.
    3. Descongelar 10 mg / ml de colagenase de tipo Ia e dilua 1:10 em PBS (com cálcio e cloreto de magnésio) a uma concentração final de 1 mg / ml. Passe solução de colagenase na veia até que ambas as cânulas são preenchidos. Feche os grampos em cânulas em ambas as extremidades.
    4. Cobrir a bandeja com o tecido e pulverizar com etanol a 70%. Colocar o cabo em uma incubadora durante 20 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
    5. Tire o cabo de forada incubadora e apertar abraçadeiras. Massageie suavemente o cabo de 1 min. Lave a suspensão de células com 10 ml de PBS e recolher num tubo de centrífuga de 50 ml.
    6. Encher a seringa com ar e passar através da veia para remover qualquer PBS residual duas vezes, recolher o PBS num tubo de centrífuga de 50 ml usado no passo 1.1.5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 1 ml médio completo da CE. Meio CE consiste em M199 suplementado com 35 ug / ml de sulfato de gentamicina, 10 ng / factor de crescimento epidérmico humano mL, 1 ug / ml de hidrocortisona, 2,5 ng / mL de anfotericina B, e 20% de soro fetal de vitelo.
    8. Adicione 4 ml de meio CE ea suspensão CE a um frasco de 25 cm2. Mudar a forma no dia seguinte e, em seguida, a cada 2 dias.
    9. CE apresentam uma morfologia paralelepípedos-like (Figura 1Ai). Para ensaios de adesão, CE são geralmente semeadas quando atingem 100% de confluência (ver secção 1.4 ).
  2. Isolamento de células-tronco mesenquimais geléia de Wharton (WJMSC) de cordões umbilicais humanos:
    1. Isolar derivados de geléia MSC, da Wharton (WJMSC) de cordões umbilicais frescas ou de cabos que já foram utilizadas para isolar CE. Cortar cordão umbilical em 5 centímetros de comprimento. Corte cada pedaço longitudinalmente para revelar os vasos sanguíneos (artérias 2 [brancos, rígida] e uma veia [amarelo, distendido]).
    2. Com uma tesoura e pinça estéril remover os vasos sanguíneos e descarte. Cortar todo o tecido em 2-3 mm3 peças. Usando fórceps lugar de 2 - 3 mm3 peças para um tubo de centrífuga de 50 ml.
    3. Descongelar 100 mg / mL de colagenase tipo II estoque e dilua 1: 100 em 10 mL de PBS a uma concentração final de 1 mg / ml. Descongelar 20.000 U / ml de hialuronidase estoque e dilua 1: 400 para uma concentração final de 50 U / ml em solução de colagenase.
    4. Adicionar cocktail enzimática para o tubo de centrífuga contendo os fragmentos de tecido. Incubar as Fragmen tecidots durante 5 horas a 37 ° C num agitador rotativo lento.
    5. Dilui-se a suspensão de células 1: 5 em PBS. Colocar um filtro de poro 100 para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Verter a suspensão de células sobre o filtro de poros de 100 um.
      NOTA: fragmentos de tecido restante será retida no filtro e as células serão coletadas no tubo de 50ml centrífuga.
    6. Descartar o filtro. Centrifuga-se a suspensão de células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em WJMSC 12 ml de meio de cultura completo WJMSC (DMEM de baixa glucose, 10% FCS e 100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de mistura de estreptomicina).
    7. Semente todas as células num frasco de cultura de tecidos de 2 75 cm. Alterar o meio após 24 horas, com 12 ml de meio de cultura completo WJMSC. Substituir médio a cada 2-3 dias. As células devem chegar a 70-80% de confluência dentro de 2 semanas. Passage quando WJMSC atingir 70-80% de confluência (ver Secção 1.4).
  3. Expansão de MSC derivadas de medula óssea (BMMSC):
    1. Isolar MSC derivadas da medula óssea humana (BMMSC) como previamente descrito 24. Adicionar 10 mL de meio de crescimento MSC pré-aquecido (MSCGM) para um tubo de centrífuga de 15 ml.
    2. Descongelar um frasco de p2 BMMSC por colocação em um banho de água a 37 C ° durante 2 min. Adicionar a suspensão BMMSC para o tubo de centrífuga contendo MSCGM. Misture bem por pipetagem.
    3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante completamente.
    4. Ressuspender as células em 1 ml MSCGM e contar as células utilizando um hemocitómetro ou um contador celular digital tal como uma cellometer.
    5. Semear as células em frascos de 75 cm2 de cultura com uma densidade de 5.000 - 6.000 células por cm 2 em 12 ml MSCGM. Alterar o meio após 24 horas com 12 ml MSCGM. Células alimentação animal, com 12 ml MSCGM a cada 2-3 dias.
    6. Passage quando BMMSC atingir 70-80% de confluência (ver Secção 1.4). As células exibem uma morfologia fibroblástica (Figura 1Aii).
  4. Destacamento da CE e MSC:
    1. Aspirar o meio de 25 cm2 frascos de cultura. Adicionar 2 ml de 0,02% EDTA durante 2 min. Aspirar EDTA e adicionar 2 ml de tripsina (2,5 mg / ml). Vista sob o microscópio até as células se tornam round.
    2. Toque no balão para separar as células. Inativar a tripsina, adicionando 8 ml de meio de cultura (depende do tipo de célula; médio CE para HUVEC, DMEM LG para WJMSC e MSCGM para BMMSC) para o frasco de cultura e suspensão transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml.
    3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento como descrito abaixo.
      1. Para passaging da MSC, pellet ressuspender em 3 ml de meio de cultura. Adicionar 11 ml de meio de cultura em três separados 75 centímetros 2 frascos de cultura. Adicionar 1 ml de suspensão de células de cada frasco de cultura (1: 3 de divisão). WJMSC passagem e BMMSC 3 vezes (p3) antes da utilização em ensaios de co-cultura.
      2. Para semear CE ou MSC em ensaios de adesão - ver Secções 2 e 3.
  5. MSC congelamento:
    1. Na passagem 3 detach MSC conforme descrito na Seção 1.4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 3 ml gelada CryoSFM. Pipetar alíquotas de 1 ml de suspensão de células em criotubos 1,5 ml de gelo-frio. Coloque criotubos num recipiente de congelação.
    2. Armazenar o recipiente a -80 ° CO / N. Transferir para nitrogênio líquido. Vial Thaw da MSC (siga os passos 1.3.1 - 1.3.6). Ressuspender MSC em 5 ml de meio de cultura (escolher meio apropriado para WJMSC ou BMMSC) e de sementes em um frasco de 25 cm2.

2. Estabelecer Endotelial-CTM a co-culturas em Ibidi Microslides

  1. Tripsinizar um balão de 2 cm CE confluente 25 (~ 1,5 x 10 6 células, como a Seção 1.4). Ressuspender CE em 380 ul MSCGM (1 x 25 cm 2, balão semearão dois microslides 6 canais Ibidi (~ 1,25 x 10 5 / canal), para ensaios de adesão tudo ty celularpes são cultivadas em MSCGM). Adicionar 30 mL de suspensão CE para cada canal (isto irá cobrir a área de crescimento através da ação capilar). Incubar Ibidi microlâmina a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 1 h.
  2. Adicionar 140 ul MSCGM para cada canal e, em seguida, aspirar-lo. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens. Adicionar 140 ul e MSCGM lugar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
  3. Para co-culturas destacar MSC (Seção 1.4). Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro ou um cellometer. Ajustar a concentração de MSC de 1,5 x 10 5 células / mL.
  4. Aspirar o excesso de meio de canais Ibidi (deixando apenas a área do crescimento do canal em meio). Adicionar 30 ul da MSC suspensão aos canais Ibidi. Aspirar o meio que foi ejectado a partir da área de crescimento do canal e adicionar mais 30 ul de suspensão MSC. Repetir mais uma vez e, em seguida, colocar a microlâmina Ibidi na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 </ Sub>, durante 1 hora.
  5. Adicionar 140 ul MSCGM para cada canal e, em seguida, aspirar-lo. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens. Adicionar um volume final de 140 ul MSCGM para cada canal e colocar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
  6. Descongelar 1 x 10 5 U estoque / ml de TNFa e dilua 1: 1000 em MSCGM para uma concentração final de 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Efectuar uma diluição em série através da diluição de 100 U / mL de TNFa por 1:10 em MSCGM obter 10 U / ml. Dilui-se 10 U / ml de TNFct por 1:10 em MSCGM obter 1 U / ml.
  7. Tratar canais com TNFa, a 37 ° C durante 4 horas antes do ensaio. As flutuações de temperatura durante o tratamento de citoquinas irá alterar os padrões de recrutamento de neutrófilos observados. Adicionar MSCGM fresco para canais não tratados.

3. Estabelecer Endotelial-CTM a co-culturas em filtros

  1. Retire WJ ou BMMSC conforme descrito na Seção 1.4. Ressuspender o sedimentoem 1 ml MSCGM. Realize um células de contagem de células utilizando um hemocitómetro ou um cellometer.
  2. Ajustar o volume de modo a que a concentração final é de 5 x 10 5 MSC em 500 ul de MSCGM.
  3. Utilizando uma pinça estéril inverter 6 poços, 0,4 mm filtros PET Transwell e coloque em uma caixa estéril.
  4. Semente de 5 x 10 5 MSC sobre a superfície exterior dos filtros. Incubar os filtros a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 1 h.
  5. Recolhe meios a partir da superfície exterior do filtro. Contar o número de não-aderentes MSC nos meios de comunicação. Re-invertido filtros usando uma pinça estéril e coloque em uma placa de 6 poços correspondência contendo 3 ml MSCGM.
  6. Adicionar 2 ml de MSCGM sobre a superfície interior do filtro (Figura 1B). Colocar numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas. Tripsinizar um balão de 2 cm CE confluente 25 (Figura 1Ai; como a Seção 1.4).
  7. Ressuspender CE, em 8 ml MSCGM (1 x 25 cm 2 balão wisemente ll quatro filtros de 6 poços; ~ 5 x 10 5 CE / filtro). Aspirar o meio da parte superior e na parte inferior dos filtros porosos. Adicionar 3 ml MSCGM fresco para dentro da câmara inferior (debaixo do filtro). Adicionar 2 ml de suspensão CE à superfície interna de cada filtro. Incubar durante 1 hora a 37 ° C e 5% de CO 2.
  8. Aspirar médio para lavar não aderente CE e substituir por fresco MSCGM. Configurar filtros de mono-cultura paralelas CE semeando células na superfície interna sem primeiro MSC semeadura. Incubar O / N a 37 ° C e 5% de CO 2.
  9. Verifique se o monocamada CE é confluente e não contém lacunas. Monocamadas sub-confluentes não podem ser utilizadas para ensaios de adesão (Figura 1B).
  10. Tratar as câmaras superiores e inferiores dos filtros com 1, 10 ou 100 U / mL de TNFa (equivalente a ~ 10 ng / ml) a 37 ° C durante 4 horas antes do ensaio (descrito na Secção 2).

4. Isolamento de Leucócitos

  1. Tome venososangue de voluntários saudáveis ​​e alíquota imediatamente em tubos com EDTA. Tubos inverter cuidadosamente para misturar.
  2. Camada de 2,5 ml HISTOPAQUE 1077 sobre 2,5 ml Histopaque 1119 em um 10 ml de fundo redondo tubo. Camada 5 ml de sangue total para o gradiente de Histopaque. Centrifugar a 800 xg durante 40 min à temperatura ambiente.
  3. Colheita neutrófilos periféricos polimorfonucleares (PMN) na interface de Histopaque 1077 e 1119 (acima da camada de eritrócitos). Coloque em um 10 ml de fundo redondo de tubo e fazer até 10 ml com PBSA. Inverter cuidadosamente tubo e centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Diluir solução de BSA a 7,5% a 1:50 em 100 ml de PBS (com cálcio e cloreto de magnésio) a uma concentração final de 0,15% (w / v; PBSA). Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de PBSA. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Ressuspender em 1 ml de PBSA. Tomar uma aliquota de 20 uL da suspensão de células e adicionar 380 ul de PBSA (diluição de 1:20). Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou um cellometer. Diluir para o conce necessáriantration (1 x 10 6 / ml em filtros Transwell e Ibidi microlâmina) em PBSA. Manter a suspensão de neutrófilos em RT até ao ensaio.

5. Montagem do Sistema de Fluxo

  1. Configurar o sistema de fluxo como mostrado na Figura 1C. Ligar o aquecedor e ajustado para 37 ° C. Anexar uma seringa de 20 ml (remover o êmbolo) e uma seringa de 5 ml a uma torneira de 3 vias. Fixe a torneira para a câmara de perspex usando fita micropore.
  2. Medir e cortar um pedaço comprido de silício 2/4 mm (espessura) tubagem que é aproximadamente a distância entre a válvula e a torneira de 3 vias. Cortar um 8-10 mm de comprimento pedaço de 1/3 mm (fina) tubulação e inserir em uma das extremidades do tubo de espessura. Prenda o lado tubulação grossa para o 3-way torneira.
  3. Ligue a extremidade da tubagem fina para um porto da eletrônica 3-way microválvula. Este é o "reservatório de lavagem". Corte um 6-8 mm de comprimento pedaço de tubo grosso e fino.
  4. Inserir o tubo fino em uma das extremidades do tubo de espessura. Attach acabar com a tubulação de espessura em uma seringa de 2 ml (remover o êmbolo).
  5. Ligue a extremidade da tubagem fina da seringa de 2 ml para um porto na microválvula eletrônico para fazer o "reservatório de amostra". Ligar-se a válvula para a câmara de filtro de fluxo através da medição e corte de um longo pedaço de tubo fino, que é a distância entre o microválvula e o centro da platina do microscópio.
  6. Para o modelo de microlâmina, anexar um 8 - mm pedaço de tubo de espessura 10 para a extremidade da tubagem fina. Inserir um conector em forma de L para a extremidade da tubagem de espessura. Isso vai se conectar à microlâmina. Para o modelo de filtro, anexar um 8 - mm pedaço de Portex Blue Line manômetro 10 a ligação de tubagens para a extremidade do tubo fino.
  7. Coloque a extremidade da tubagem fina para o microválvula. Esta é a saída comum para os reservatórios de lavagem e de amostra. Preencha reservatórios com PBSA. Tubing Prime fluindo PBSA através deles para remover quaisquer bolhas de ar.
  8. Anexar manômetro tubulação para um 29 mm (50 ml) de vidro syringe. Primeiro a seringa de enchimento com 10 ml PBSA. Inverta a seringa de modo a que a outra extremidade conectada ao tubo virado para cima e empurrar para fora todas as bolhas de ar. Recarga com 5 ml PBSA.
  9. Por apenas o modelo microlâmina, anexar a 10 - pedaço de tubo de 12 milímetros de espessura para a extremidade do tubo do manómetro levando à seringa de vidro. Inserir um conector em forma de L na extremidade da tubagem de espessura. Coloque a seringa de vidro em uma bomba de seringa para infusão / retirada.
  10. Calcula-se a taxa de fluxo de reenchimento (Q) necessária para gerar a tensão de cisalhamento de parede desejada (τ w em Pascal, Pa) de 0,1 (filtros Transwell Pa) ou 0,05 (microslides Ibidi Pa), utilizando as fórmulas seguintes:
    γ w = (6.Q) / (wh 2)
    τ = n.γ
    Quando a largura w = interno e h = profundidade interna do canal de fluxo. n = viscosidade da solução de fluxo; PBSA é n = 0,7 mPa.s. Para a câmara de fluxo do filtro de placas paralelas, a largura (w) é de 4 mm e a profundidade (h) é 0,133 milímetros. O depth da câmara pode variar ligeiramente devido às diferenças na espessura da junta de vedação utilizado Parafilm. Para a microlâmina Ibidi, a largura é de 3,8 mm e a profundidade é de 0,4 mm.
    NOTA: Devido a diferenças nas dimensões do canal de fluxo, e dinâmica de captura usamos tensões de corte diferentes para o modelo microlâmina em comparação com o modelo de filtro 6.

6. Configuração da Placa Paralela Fluxo Câmara Incorporando Filtros

  1. Cortar um pedaço de Parafilm (o mesmo tamanho que a lamela de vidro) utilizando um molde de metal. Cortar uma ranhura 20 x 4 mm de o Parafilm (para criar o canal de fluxo) utilizando um molde metálico. Use a junta para marcar o canal de fluxo na lamela de vidro.
  2. Alinhar as bordas do filtro de 6 poços na lamela de vidro. Certifique-se de que o filtro abrange as marcas de canais de escoamento. Retirar cuidadosamente o filtro usando um bisturi tipo 10A.
  3. Cobrir o filtro cuidadosamente com uma junta de Parafilm, assegurando que o canal de escoamentoranhura está no meio do filtro (Figura 1D). Use um pedaço de tecido limpo e empurrar para fora todas as bolhas.
  4. Coloque a lamela em recesso da chapa de fundo da câmara de fluxo de Perspex. Posicionar a placa de perspex de topo sobre a parte superior da junta e parafuso as placas em conjunto (Figura 1D).
  5. Virar a torneira de 3 vias para permitir que o tampão de lavagem (PBSA) para fluir através da válvula. Conectar Manómetro tubagem para a abertura de entrada da placa de topo Persex. Executar PBSA através do canal de fluxo para permitir que as bolhas de passar através.
  6. Ligar o tubo do manómetro da bomba de seringa para dentro do orifício de saída da placa de perspex. Defina a bomba de seringa para encher e tiragem. Limpar qualquer PBSA que tenha gotejado sobre a placa superior da câmara.
  7. Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido de contraste de fase. Ajustar o foco para visualizar o CE acima dos filtros (Figura 1B).

7. Configurando Microslides for Flow

  1. Coloque o microlâmina para o palco de um microscópio de contraste de fase invertido. Ligue o conector em forma de L na porta de entrada de um canal. Executar PBSA através do canal de fluxo.
  2. Inserir o conector em forma de L a partir da bomba de seringa para dentro do orifício de saída do canal. Defina a bomba de seringa para encher e tiragem. Limpe qualquer PBSA que pingou sobre a microlâmina. Ajuste o foco para visualizar a monocamada CE.

8. Ao longo de Perfusão de Leucócitos Células Endoteliais

  1. Coloque 2 ml de neutrófilos purificados para o reservatório da amostra e deixar a aquecer durante 2 min. Lavar o endotélio com PBSA durante 2 min.
  2. Gire a válvula ON para perfundir neutrófilos sobre o endotélio. Entregar o bolus de neutrófilos para 4 min. Desligue a válvula e perfundir PBSA a partir do reservatório de lavagem durante o resto da experiência.
  3. Verifique se o ar bolhas não passar pelo canal de fluxo em qualquer momento durante o ensaio, pois isso vai atrapalhar o monolay CEer e causa descolamento dos neutrófilos aderentes.

9. Recording Neutrophil Capture and Behavior

  1. Recrutamento de neutrófilos registro ou durante o fluxo de neutrófilos ou pós-perfusão.
  2. Adicione todas as gravações digitais de, pelo menos, 5 - 10 campos no centro do canal de fluxo. Identificar o centro do canal movendo o objectivo para a borda do canal na abertura de entrada e identificar o meio da porta.
    1. Para gravar durante o fluxo de neutrófilos, tirar fotos de um único campo a cada 10 segundos durante 1 min. Mover ao longo do canal e gravar outro campo para 1 min. Repita o procedimento para duração do bolus.
    2. Para a gravação de pós-perfusão, fazer a gravação de 10 seg de 5 - 10 campos para baixo o centro do canal de fluxo para avaliar o comportamento dos leucócitos (tipicamente de 2 minutos após o final do bolo de neutrófilos). Tire fotos a cada segundo dentro do intervalo de 10 segundos. Isso dá tempo suficiente para a captura de fluxo e do comportamento dos neutro aderentephils a ser analisado.
    3. Gravar um único campo que contém pelo menos 10 neutrófilos transmigrou durante 5 min, a tomada de imagens a cada 30 seg. Isto pode ser usado para calcular a velocidade de células que migraram (acima ou por baixo do endotélio).
    4. Grave outra série de 10 campos seg (normalmente 9 min pós-perfusão). Isto permite que os neutrófilos tempo para migrar através da monocamada endotelial.
    5. Parar a bomba de seringa e remover o tubo. Desmonte a câmara de fluxo e lave o reservatório de amostra e tubos. Repita o procedimento para filtros / canais MicroSlide subseqüentes.

10. Análise de Leucócitos Recrutamento e Comportamento

  1. Contar o número de neutrófilos em cada campo durante os 10 gravações seg no ponto de tempo de 2 min. Todas as células devem estar presentes no primeiro segundo campo, a fim de serem contados. As células que são parcialmente no campo em dois lados (por exemplo, superior / fronteira direita) do campo de visão estão incluídas naas contagens, enquanto eles permanecem no campo para a completa 10 seg.
  2. Calcula-se a média do número de neutrófilos aderentes por campo. Medir o comprimento e largura do campo gravado. Calcula-se a área do campo. Calcula quantos campos existem in 1 mm 2. Multiplicar a contagem de neutrófilos significativo pelo número de campos in 1 mm 2.
  3. Calcula-se o número total de neutrófilos perfundidos através da multiplicação da quantidade de neutrófilos perfundido (por exemplo, 2 x 10 6 / ml * Q [por exemplo, 0,0999 ml / min para o fluxo de placas paralelas câmara]) pela duração do bolus (por exemplo, 4 min ).
  4. Dividir a contagem de neutrófilos / mm 2 pelo número total de neutrófilos perfundidos para determinar o número total de células que aderiram (células aderentes / mm 2/10 6 O perfundido).
  5. Avaliar se os neutrófilos aderentes estão rolando, firmemente aderente ou transmigrou (Recurso Video 1 e 2).
    1. Aneutrófilo é a fase brilhante e lentamente vai se mover ao longo da monocamada endotelial (1-10 mm / seg; Suplementar Video 1).
    2. Células firmemente aderentes são fase brilhante e ligado à superfície CE, quer permanecer parado (ou seja, sem se mover durante a gravação) ou sofreram alteração de forma e estão migrando sobre a superfície CE (Figura 1Ei).
    3. A neutrófilos transmigrou é fase escura e abaixo da camada CE (Figura 1Eii).
  6. Calcular a percentagem de células aderentes que estão rolando, estacionário e transmigrou. Alternativamente, o comportamento de neutrófilos podem ser expressos como números de células totais que apresentam os diferentes comportamentos, aplicando a mesma fórmula usada para calcular a aderência total (conforme descrito nos passos 10,6-10,7).
    1. Mark vanguarda da neutrófilo rolamento. Marcar o bordo de ataque da mesma célula no final da sequência de 10 seg. Desenhar uma linha de apostaween os dois pontos e medir a distância que a célula tenha percorrido.
    2. Dividir esse valor, a duração de gravação, em que a célula é de rolamento (isto é, 10 seg). Tente e seleccionar os neutrófilos que se encontram no campo de todo o intervalo de 10 seg.
  7. Para calcular a velocidade de neutrófilos migram sobre a superfície (em forma brilhante fase alterada) ou por baixo do endotélio (dark fase) usar a 5 min de gravação (Recurso Video 2).
    1. Desenhar um esboço de células que migraram no início da sequência e controlar os seus movimentos ao longo da sequência. Anote as posições X e Y do centróide a cada intervalo de 1 min para cada célula. Subtrair os valores de X e a posição Y a partir da primeira imagem da sequência a partir dos valores na segunda imagem. Isto é baseado no teorema de Pitágoras.
    2. Subtrair os valores de a segunda imagem a partir da terceira imagem. Faça isso para todas as imagens na seqüência. Praça tele valores X e Y e adicioná-los juntos.
    3. Raiz quadrada o valor resultante. Calcula-se a velocidade para cada célula através da média das velocidades calculadas em cada intervalo de minutos. Pista 10 migraram neutrófilos e calcular a velocidade média.

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Resultados

Inicialmente, analisamos o efeito de estimular CE com TNF sobre o recrutamento de neutrófilos de fluxo, utilizando o modelo microlâmina Ibidi (Seção 7-9). Na ausência de TNF, pouco se qualquer neutrófilos aderida à monocamada endotelial (Figura 2A). Isto era esperado, como não tratada / descansando CE não expressam as moléculas necessárias adesão (selectinas) ou quimiocinas para apoiar obrigatório 25,26. Em contraste, a estimulação de citoquinas-aumentou significativamente a ...

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Discussão

Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes por endotélio inflamado. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Nós já observado um aumento dependente da dose da adesão de neutrófilos e a transmigração através estimuladas por TNFa CE 9,29. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar os...

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Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os cordões umbilicais foram coletados com a ajuda do Birmingham Women's Health Care NHS Trust. O HMM foi apoiado por uma bolsa de desenvolvimento de carreira da Arthritis Research UK (19899) e Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Colagenase Tipo IaSigmaC2674Diluir em 10 ml de PBS para obter uma concentração final de 10 mg/ml. Armazenar a -20 &graus; C em alíquotas de 1 ml.
SigmaD8662de Dulbeccocom cloreto de cálcio e magnésio. Mantenha estéril e armazene em RT.
1X Médio M199Gibco31150-022Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Sulfato de gentamicinaSigmaG1397Conservar a 4 graus C. Adicionar ao frasco M199 de 500 ml.
Fator de crescimento epidérmico humanoSigmaE9644Armazenar a -20 ° C em 10 e micro; l alíquotas.
O soro fetal de bezerro (FCS)SigmaF9665FCS deve ser testado em lote para garantir o crescimento e a viabilidade da CE isolada. Inativar o calor a 56 ° C. Armazenar em alíquotas de 10 ml a -20 ° C.
Anfotericina BGibco15290-026Potente e torna-se tóxico dentro de uma semana, portanto, o meio HUVEC completo e fresco deve ser preparado todas as semanas. Armazene a -20 > C em alíquotas de 1 ml.
HidrocortisonaSigmaH0135O estoque está em etanol. Armazene a -20 > C em 10 e micro; l alíquotas.
Colagenase Tipo IISigmaC6885Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 100 mg/ml. Armazenar a -20 &graus; C em 100 µ l alíquotas.
HialuronidaseSigmaH3631Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 20.000 U/ml. Armazenar a -20 &graus; C em 100 µ l alíquotas.
100 µ filtro de células m para tubo de 50 ml de centifugeSuprimentos de laboratório científico (SLS)352360Outros filtros de células disponíveis comercialmente (por exemplo, Greiner bio-one) também podem ser usados.
DMEM baixo teor de glicoseBioseraLM-D1102/500Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar.
Mistura de penicilina/estreptomicinaSigmaP4333Armazene a -20 ° C em alíquotas de 1 ml.
Balão de cultura de tecidos de 25 ccSLS353109
Balão de cultura de tecidos de 75 ccSLS353136
Frasco de células estaminais mesenquimais da medula ósseaLonzaPT-2501Armazenar em azoto líquido à chegada. As celas estão na passagem 2 na chegada, mas são designadas como passagem 0. Passe para a passagem 3 e armazene em nitrogênio líquido para uso posterior.
Meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (MSCGM)LonzaPT-3001Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar. Para coloração Cell Tracker Green, use meio sem FCS.
Solução EDTA (0,02%)SigmaE8008Armazenar a 4 °C. Quente em 37 °C; C banho-maria antes de usar.
Solução de tripsinaSigmaT4424Armazenar em -20 ° C em alíquotas de 2 ml. Descongele no RT e use imediatamente.
CryovialsGreiner bio-one2019-02Mantenha no gelo antes de adicionar antes de adicionar suspensão celular.
Recipiente de congelamento Mr. FrostyNalgene5100-0001Loja na RT. Ao adicionar criogeniais com células armazenadas a -80 ° C por 24 horas antes de transferir as células para nitrogênio líquido.
Ibidi u-Slide VI (0,4), tratado com T/C, estérilIbidiIB-80606Os modelos alternativos incluem capilares de vidro, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), placas BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) e câmaras de fluxo de placas paralelas GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Rastreador de células corante verdeLife technologiesC2925Loja em 5 µ l alíquotas a -20 ° C. Diluir em 5 ml pré-aquecido (a 37 ° C; C) MSCGM.
Câmaras de contagem de célulasNexcelomSD-100Alternativamente, um hemocitômetro pode ser usado.
Nexcelomcontador da pilha do T4 do celômetro autoT4-203-0238
; (TNF&alfa;)R& D Systems210-TA-100Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 100.000 U/ml. Armazenar a -80 &graus; C em 10 e micro; l alíquotas.
6 poços, 0,4 e micro; m Filtros PET TranswellSLS353090
K2-EDTA em tubos de 10mlSarstedtArmazenar na RT.
Histopaque 1119Sigma11191Armazene a 4 graus C. Aqueça para RT antes de usar.
Histopaque 1077Sigma10771Armazene a 4 graus C. Aqueça para RT antes de usar.
Tubo de fundo redondo de 10 mlAppleton WoodsSC211 142 AS
7,5% BSA Fração V soluçãoLife technologies15260-037Armazenar a 4 graus C.
Seringas de Plastipak de 20 mlBD falcon300613
Seringas de Plastipak de 5 mlBD falcon302187
Seringas de Plastipak de 2 mlBD falcon300185
fita cirúrgica hipoalergênica 3M 9 m x 2,5 cmMicropore1530-1Use para prender a torneira da seringa na parede da câmara de perspex.
Tubo de borracha de silicone, diâmetro interno/diâmetro externo (ID/OD) de 1/3 mm (tubo fino)Fisher ScientificFB68854Corte o tubo de silicone no tamanho apropriado. Todos os tubos que levam diretamente à microválvula eletrônica devem ser finos.
Tubo de borracha de silicone ID/OD de 2/4 mm (tubo grosso)Fisher ScientificFB68855
Portex Blue Line ManômetroSmiths200/495/200Tubulação que leva à bomba de seringa.
Torneira de 3 viasBOC Ohmeda AB
Glass Seringa de 50 ml para bombaPopper Micromate550962Deve ser preparado antes do uso, removendo quaisquer bolhas de ar.
Lamínula de vidroRaymond A Lamb26 x 76 mm lamínulas feitas sob encomenda. Número do lote 2440980.
Junta de parafilmeAmerican National Can CompanyCorte um pedaço de parafilme de 26 x 76 mm usando um gabarito de alumínio e corte uma ranhura de 20 x 4 mm usando um bisturi 10a. A espessura da junta é de aproximadamente 133 μm.
Duas placas paralelas de perspexLaboratório de Tecnologia AplicadaCâmara especialmente projetada composta por placas paralelas unidas por 8 parafusos. A placa inferior tem uma ranhura de visualização cortada no meio e um recesso raso fresado para permitir espaço para a lamínula, filtro e gaxeta. A placa superior de perspex possui um orifício de entrada e saída posicionado sobre o canal de fluxo.
Microválvula eletrônica de 3 vias com espaço morto mínimoLee Products Ltd.LFYA1226032HConectado eletronicamente a uma fonte de alimentação de 12 volts DC.
Bomba de seringa para perfusão/retirada (PHD2000)Harvard Apparatus70-2001Ajuste o diâmetro para 29 mm e a taxa de recarga (fluxo).
Conector em forma de LLabhutLE876Para conectar às portas de entrada e saída no canal microslide Ibidi.
Câmara de vídeoQimaging01-QIC-F-M-12-CLigada a um computador que permite a gravação de vídeos digitais.
Image-Pro Plus 7.0Media Cybernetics41N70000-61592Para análise de dados. Marque manualmente as células que exibem os diferentes comportamentos. Células de rastreamento para análise de velocidades de rolamento e migração.
Consulte as fichas técnicas do produto para obter detalhes sobre os perigos do uso dos reagentes descritos aqui.
PBS Fator &alpha da necrose tumoral de do auto tubulação Wolfson

Referências

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