Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Resumo

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

Resumo

As células estromais regular o recrutamento de leucócitos circulantes durante a inflamação através de cross-talk com células endoteliais vizinhas. Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes de fluxo pelas células endoteliais inflamadas. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar o papel das células estromais, neste caso as células estaminais mesenquimais (MSC), em regular o recrutamento de leucócitos.

Células endoteliais primárias foram cultivadas isoladamente ou em conjunto com MSC humana em contacto directo em microslides Ibidi ou em lados opostos de um filtro Transwell durante 24 h. As culturas foram estimuladas com factor de necrose tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas e incorporadas num ensaio de adesão com base em fluxo. Um bolus de neutrófilos foi perfundidoao longo do endotélio, durante 4 min. A captura de fluir neutrófilos e suas interações com o endotélio foi visualizado por microscopia de contraste de fase.

Em ambos os modelos, a estimulação de citoquinas-endotelial aumento do recrutamento de neutrófilos fluindo de uma maneira dependente da dose. A análise do comportamento dos neutrófilos recrutados mostraram um decréscimo dependente da dose no rolamento e um aumento dependente da dose na transmigração através do endotélio. Em co-cultura, MSC suprimida adesão de neutrófilos ao endotélio estimulada-TNF.

Os nossos modelos baseados na aderência de fluxo de imitar as fases iniciais do recrutamento de leucócitos da circulação. Além de leucócitos, que pode ser usado para examinar o recrutamento de outros tipos de células, tais como células tumorais circulantes ou MSC administrados terapeuticamente. Os nossos modelos de multi-camadas de co-cultura MSC demonstraram que comunicam com endotélio para modificar a sua resposta a citocinas pró-inflamatórias, Altering o recrutamento de neutrófilos. Mais pesquisas utilizando esses modelos é necessário para entender completamente como células estromais de diferentes tecidos e condições (doenças inflamatórias ou câncer) influenciam o recrutamento de leucócitos durante a inflamação.

Introdução

A inflamação é uma resposta protectora contra a infecção microbiana ou lesão do tecido que requer regulação apertada de entrada e saída de leucócitos a partir do tecido inflamado para permitir a resolução ^{de 1,2.} Conversa cruzada entre as células endoteliais (CE) que os navios de linha de sangue, leucócitos circulantes e células do estroma do tecido residente é essencial para coordenar este processo ^3. No entanto, o recrutamento descontrolada de leucócitos e sua desobstrução ineficaz de apoiar o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas ^4. A nossa compreensão atual de recrutamento de leucócitos na saúde e na doença é incomplet....

Protocolo

1. Isolamento e cultura de células endoteliais humanas primárias e Células-Tronco Mesenquimais

1. Células isolamento e cultivo de humanos umbilical endoteliais veia (HUVEC):
   1. Coloque cordão umbilical num tabuleiro com toalhas de papel e pulverizar com etanol a 70%. Coloque em uma capa de cultura de tecidos. Identificar a veia e canular em ambas as extremidades. Coloque uma braçadeira em torno do fim canulada para prendê-lo.
   2. Lave a sangue venoso com PBS usando uma seringa. Encha a seringa com ar e passar através da veia para remover e descartar o PBS residual.
   3. Descongelar 10 mg / ml de colagenase de tipo Ia e dilua 1:10 em PBS (com ....

Resultados

Inicialmente, analisamos o efeito de estimular CE com TNF sobre o recrutamento de neutrófilos de fluxo, utilizando o modelo microlâmina Ibidi (Seção 7-9). Na ausência de TNF, pouco se qualquer neutrófilos aderida à monocamada endotelial (Figura 2A). Isto era esperado, como não tratada / descansando CE não expressam as moléculas necessárias adesão (selectinas) ou quimiocinas para apoiar obrigatório ^25,26. Em contraste, a estimulação de citoquinas-aumentou significativamente a .......

Discussão

Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes por endotélio inflamado. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Nós já observado um aumento dependente da dose da adesão de neutrófilos e a transmigração através estimuladas por TNFa CE ^9,29. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar os.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase Tipo Ia	Sigma	C2674	Diluir em 10 ml de PBS para obter uma concentração final de 10 mg/ml. Armazenar a -20 &graus; C em alíquotas de 1 ml.
Sigma	D8662	de Dulbecco	com cloreto de cálcio e magnésio. Mantenha estéril e armazene em RT.
1X Médio M199	Gibco	31150-022	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Sulfato de gentamicina	Sigma	G1397	Conservar a 4 graus C. Adicionar ao frasco M199 de 500 ml.
Fator de crescimento epidérmico humano	Sigma	E9644	Armazenar a -20 ° C em 10 e micro; l alíquotas.
O soro fetal de bezerro (FCS)	Sigma	F9665	FCS deve ser testado em lote para garantir o crescimento e a viabilidade da CE isolada. Inativar o calor a 56 ° C. Armazenar em alíquotas de 10 ml a -20 ° C.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Potente e torna-se tóxico dentro de uma semana, portanto, o meio HUVEC completo e fresco deve ser preparado todas as semanas. Armazene a -20 > C em alíquotas de 1 ml.
Hidrocortisona	Sigma	H0135	O estoque está em etanol. Armazene a -20 > C em 10 e micro; l alíquotas.
Colagenase Tipo II	Sigma	C6885	Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 100 mg/ml. Armazenar a -20 &graus; C em 100 µ l alíquotas.
Hialuronidase	Sigma	H3631	Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 20.000 U/ml. Armazenar a -20 &graus; C em 100 µ l alíquotas.
100 µ filtro de células m para tubo de 50 ml de centifuge	Suprimentos de laboratório científico (SLS)	352360	Outros filtros de células disponíveis comercialmente (por exemplo, Greiner bio-one) também podem ser usados.
DMEM baixo teor de glicose	Biosera	LM-D1102/500	Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar.
Mistura de penicilina/estreptomicina	Sigma	P4333	Armazene a -20 ° C em alíquotas de 1 ml.
Balão de cultura de tecidos de 25 cc	SLS	353109
Balão de cultura de tecidos de 75 cc	SLS	353136
Frasco de células estaminais mesenquimais da medula óssea	Lonza	PT-2501	Armazenar em azoto líquido à chegada. As celas estão na passagem 2 na chegada, mas são designadas como passagem 0. Passe para a passagem 3 e armazene em nitrogênio líquido para uso posterior.
Meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar. Para coloração Cell Tracker Green, use meio sem FCS.
Solução EDTA (0,02%)	Sigma	E8008	Armazenar a 4 °C. Quente em 37 °C; C banho-maria antes de usar.
Solução de tripsina	Sigma	T4424	Armazenar em -20 ° C em alíquotas de 2 ml. Descongele no RT e use imediatamente.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Mantenha no gelo antes de adicionar antes de adicionar suspensão celular.
Recipiente de congelamento Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001	Loja na RT. Ao adicionar criogeniais com células armazenadas a -80 ° C por 24 horas antes de transferir as células para nitrogênio líquido.
Ibidi u-Slide VI (0,4), tratado com T/C, estéril	Ibidi	IB-80606	Os modelos alternativos incluem capilares de vidro, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), placas BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) e câmaras de fluxo de placas paralelas GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Rastreador de células corante verde	Life technologies	C2925	Loja em 5 µ l alíquotas a -20 ° C. Diluir em 5 ml pré-aquecido (a 37 ° C; C) MSCGM.
Câmaras de contagem de células	Nexcelom	SD-100	Alternativamente, um hemocitômetro pode ser usado.
Nexcelom	contador da pilha do T4 do celômetro auto	T4-203-0238
; (TNF&alfa;)	R& D Systems	210-TA-100	Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 100.000 U/ml. Armazenar a -80 &graus; C em 10 e micro; l alíquotas.
6 poços, 0,4 e micro; m Filtros PET Transwell	SLS	353090
K2-EDTA em tubos de 10ml	Sarstedt		Armazenar na RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Armazene a 4 graus C. Aqueça para RT antes de usar.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Armazene a 4 graus C. Aqueça para RT antes de usar.
Tubo de fundo redondo de 10 ml	Appleton Woods	SC211 142 AS
7,5% BSA Fração V solução	Life technologies	15260-037	Armazenar a 4 graus C.
Seringas de Plastipak de 20 ml	BD falcon	300613
Seringas de Plastipak de 5 ml	BD falcon	302187
Seringas de Plastipak de 2 ml	BD falcon	300185
fita cirúrgica hipoalergênica 3M 9 m x 2,5 cm	Micropore	1530-1	Use para prender a torneira da seringa na parede da câmara de perspex.
Tubo de borracha de silicone, diâmetro interno/diâmetro externo (ID/OD) de 1/3 mm (tubo fino)	Fisher Scientific	FB68854	Corte o tubo de silicone no tamanho apropriado. Todos os tubos que levam diretamente à microválvula eletrônica devem ser finos.
Tubo de borracha de silicone ID/OD de 2/4 mm (tubo grosso)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manômetro	Smiths	200/495/200	Tubulação que leva à bomba de seringa.
Torneira de 3 vias	BOC Ohmeda AB
Glass Seringa de 50 ml para bomba	Popper Micromate	550962	Deve ser preparado antes do uso, removendo quaisquer bolhas de ar.
Lamínula de vidro	Raymond A Lamb		26 x 76 mm lamínulas feitas sob encomenda. Número do lote 2440980.
Junta de parafilme	American National Can Company		Corte um pedaço de parafilme de 26 x 76 mm usando um gabarito de alumínio e corte uma ranhura de 20 x 4 mm usando um bisturi 10a. A espessura da junta é de aproximadamente 133 μm.
Duas placas paralelas de perspex	Laboratório de Tecnologia Aplicada		Câmara especialmente projetada composta por placas paralelas unidas por 8 parafusos. A placa inferior tem uma ranhura de visualização cortada no meio e um recesso raso fresado para permitir espaço para a lamínula, filtro e gaxeta. A placa superior de perspex possui um orifício de entrada e saída posicionado sobre o canal de fluxo.
Microválvula eletrônica de 3 vias com espaço morto mínimo	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Conectado eletronicamente a uma fonte de alimentação de 12 volts DC.
Bomba de seringa para perfusão/retirada (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Ajuste o diâmetro para 29 mm e a taxa de recarga (fluxo).
Conector em forma de L	Labhut	LE876	Para conectar às portas de entrada e saída no canal microslide Ibidi.
Câmara de vídeo	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Ligada a um computador que permite a gravação de vídeos digitais.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	Para análise de dados. Marque manualmente as células que exibem os diferentes comportamentos. Células de rastreamento para análise de velocidades de rolamento e migração.
Consulte as fichas técnicas do produto para obter detalhes sobre os perigos do uso dos reagentes descritos aqui.

PBS Fator &alpha da necrose tumoral de do auto tubulação Wolfson