Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Summary

Existem muitos métodos diferentes para a medição de vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometria de fluxo (FCM). Vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Dois protocolos de VE de medição são apresentadas, usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão.

Abstract

Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores.

Introduction

Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado ....

Protocol

NOTA: Os seguintes protocolos foram realizados em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todas as amostras de sujeitos humanos foram testados no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional (IRB) protocolo -aprovado e com o consentimento informado dos sujeitos.

1. MÉTODO A: Método de Detecção Pessoa

1.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs

1. Extrair o sangue do dador / paciente em duas 10 ml de tubos de vidro contendo 1,5 mL de solução ACD-A ou outro anticoagulante adequado e processo imediatamente (dentro de 30 min-ma....

Results

A Figura 1 apresenta o esquema de tratamento global para o isolamento e detecção de veículos eléctricos, utilizando quer o método baseado em grânulo ou método de detecção individual. Detecção individual de EVs usando FCM funciona bem para a análise de EVs maiores, mas a maioria dos cytometers não são capazes de detectar individualmente partículas tão pequenas como exossomos. Uma abordagem baseada em grânulo permite VE pequenas para serem detectados, no entanto, existem desvantagens associadas com a util.......

Discussion

Dois diferentes protocolos para o isolamento, tratamento e análise de VE foram apresentados, utilizando quer uma individual de detecção ou de aproximação baseadas em esferas. Selecionando o método mais adequado para usar nem sempre é fácil e requer uma compreensão da amostra a ser testada, bem como as subpopulações de interesse individuais. Além disso, a sensibilidade do citómetro usado para a aquisição deve ser considerado quando se escolhe o método mais adequado. Muitas vezes não há melhor protocolo único de usar, em .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citômetro de fluxo de bancada LSR II	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm azul, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violeta, e 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm vermelho)
Software FACS Diva	BD Biosciences		PC versão 6.0
Software FlowJo	Treestar US		Mac versão 9.6.1 ou PC versão 7.6.5
Sphero Rainbow partículas fluorescentes	BD Biosciences 556298		usado para ajustar todas as tensões de canal para manter a consistência da intensidade da fluorescência
Partículas fluorescentes Ultra Rainbow	Spherotech	URFP-10-5	usado além dos grânulos SSC Megamix-Plus para garantir a consistência do gating EV de lote para lote
Os grânulos Megmix-Plus SSC	Biocytex	7803	usado para ajustar as tensões FSC e SSC para manter a consistência entre as execuções. Também pode ser usado para monitorar a taxa de fluxo e ajustar a discagem da taxa de fluxo, a fim de garantir que a mesma taxa de fluxo seja usada em todas as execuções
Kit de contas anti-mouse AbC	Life Technologies	A-10344	usado para controles de compensação e contas AbC negativas usadas para o método baseado em contas
Nonidet P-40 Alternativa (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	SC-281108	Usado no método de detecção individual apenas para lisar amostras após a leitura inicial para uso como controles negativos. O estoque pode ser diluído para 1:10 em PBS e armazenado na geladeira por até 1 mês.
Tubos BD TruCOUNT A	BD Biosciences	340334	usada sempre que concentrações absolutas de EV são necessárias
Ultrafree-MC, GV 0.22 µ m Unidades de Filtro Centrífugo	Millipore	UFC30GVNB	usado para lavagem pós-mancha Evs e/ou EVs fracionados com base no tamanho
Tubos de sangue total de vidro Vacutainer ACD-A	BD Biosciences	364606
Tubos Facs 12x75 poliestireno	BD Biosciences	352058
50 ml Reservatórios embalados individualmente	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak - 10 µ l	Rainin	GP-L10S
Green-Pak -200 µ l	Rainin	GP-L250S
Green -Pak - 1.000 µ l	Pontas Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 pré-esterilizadas	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Canais LTS  Ajustável  Espaçador	Rainin	LA8-300XLS
	E& K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Mídia (sem Hepes)	Instalação de Cultura de Células UCSF	CCFAE001	mídia usada para método de detecção baseado em esferas
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µ m filtrado	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µ l
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µ l
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µ l
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µ l
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µ l
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µ l
PAINEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µ l
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µ l
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µ l
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µ l
PAINEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µ l
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µ l
CD66b PE	Biolegend	305106	2 e micro; l
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µ l
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolenda	400230