Este protocolo descreve como as células progenitoras neurais podem ser diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, a fim de produzir uma população de células neurais robusta e replicativa, que pode ser usada para identificar as vias de desenvolvimento que contribuem para a patogênese da doença em muitos distúrbios neurológicos.
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Artigo de método
Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudos post-mortem de doenças neurológicas não são ideais para identificar as causas subjacentes do início da doença, pois muitas doenças incluem um longo período de progressão da doença antes do início dos sintomas. Como os fibroblastos de pacientes e controles saudáveis podem ser reprogramados com eficiência em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e, posteriormente, diferenciados em células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios para o estudo dessas doenças, agora é possível recapitular os eventos de desenvolvimento que ocorreram antes do início dos sintomas nos pacientes. Apresentamos um método para diferenciar eficientemente hiPSCs em NPCs, que além de serem capazes de se diferenciar ainda mais em neurônios funcionais, também podem ser passados, congelados-descongelados ou transferidos para crescer como neuroesferas, permitindo uma triagem genética rápida para identificar os fatores moleculares que afetam os fenótipos celulares, incluindo replicação, migração, estresse oxidativo e / ou apoptose. Os NPCs hiPSC derivados de pacientes são uma plataforma única, ideal para o teste empírico das consequências celulares ou moleculares da manipulação da expressão gênica.
Introdução
Estudos de neurônios diferenciadas in vitro a partir de humanos células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) por nós 1 e outros 2,3 de expressão de genes indicam que os neurônios hiPSC assemelhar fetal em vez de adulto tecido cerebral. Actualmente, os modelos baseados em hiPSC pode ser mais adequado para o estudo da predisposição para, em vez de funções tardias da doença, neurológica. Nós já relataram que uma fracção significativa do gene assinatura de esquizofrenia neurónios derivados de hiPSC é conservado em células derivadas de esquizofrenia hiPSC progenitoras neurais (NPCs), indicando que NPCs pode ser um tipo de células útil....
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Protocolo
1. hiPSC Diferenciação de células progenitoras neurais
- Crescer e expandir hiPSCs em células estaminais embrionárias humanas (HES) mídia (Tabela 1) co-cultivadas em um fibroblastos de rato embrionárias (MEF) camada alimentadora até grandes (mas subconfluentes) colônias estão prontos para a diferenciação neural através de um organismo embryoid (EB) intermediário (Figura 2). Condições de rotina cultura hiPSC estão bem descritos em outros lugares 16,17; resumidamente, hiPSCs crescer em meios de HES em uma camada de alimentação MEF até à confluência, em seguida passagem por via enzimática com colagenase (1 mg / ml em....
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Resultados
Rosetas neurais podem ser identificadas morfologicamente, utilizando um microscópio de campo claro, pela sua aparência característica como aglomerados redondos de células neuroepiteliais com polaridade APICO-basal (Figura 1). Embora NPCs são tipicamente cultivadas a uma densidade celular muito alta, imediatamente após a passagem em, ligeiramente soma em forma piramidal, e estrutura de neurites bipolar é visível (Figura 1D). NPCs validados expressam nestina e SOX2 na maioria das células,.......
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Discussão
Nós descrevemos métodos pelos quais a diferenciar hiPSCs em NPCs, um tipo de célula neural em que uma fração significativa da assinatura gene de neurônios hiPSC derivados é conservada e que pode servir como um proxy para as vias de desenvolvimento potencialmente contribuem para a patogênese da doença 8, 11. Além disso, como já detalhado, NPCs são uma população neural robustamente replicativo e facilmente transduzidas, que acreditamos que pode ser adequado para estudos moleculares e bioquímicos da predisposiçã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Kristen Brennand é uma investigadora da Fundação de Células-Tronco de Nova York - Robertson. O Laboratório Brennand é apoiado por uma Bolsa de Jovens Investigadores do Cérebro e Comportamento, pela concessão R01 MH101454 do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e pela Fundação de Células-Tronco de Nova York.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | para mídia HES |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | para mídia neural |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Precisa ser testado em lote |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Precisa ser testado em lote |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Precisa ser testado em lote |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Ressuspensão em PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Ressuspensão em PBS + 0,1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Ressuspensão em PBS + 0,1% BSA |
| Dibutiril cíclico-AMP | Sigma | #D0627 | Ressuspensão em PBS + 0,1% BSA |
| L-ácido ascórbico | Sigma | #A0278 | Ressuspensão em H20 |
| Reagente de Seleção de Roseta Neural STEMdiff | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Colagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poli-L-Ornitina | Sigma | P3655 | |
| Laminina, Rato Natural 1 mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Ressuspender no gelo em DMEM frio a 10 mg/ml, use 1 mg por duas placas equivalentes de 6 poços |
| Tratamento para cultura de tecidos Placas de 6 poços | Corning | 3506 | |
| Ultra baixa fixação Placas de 6 poços | Corning | 3471 | |
| anti-Sox2 para cabras | Santa Cruz | sc&stímido; 17320 | uso a 1:200 |
| camundongo anti-humano Nestin | Millipore | MAB5326 | uso a 1:200 |
| coelho anti-β III-tubulina | Covance | PRB 435P | use em 1:500 |
| mouse anti-β III-tubulina | Covance | MMS Uso de 435P | em camundongo |
| anti-MAP2AB | Uso de Sigma | M1406 | em centrífuga de placas 1:200 |
| Beckman | Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (com suporte de placa SX4750) |
Referências
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneuron....
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Reimpressões e permissões
