Artigo de método

Manipulação e

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DOI:

10.3791/52496

⸱

9 de fevereiro de 2015

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

Neste artigo

Resumo

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Resumo

Os ovos de anfíbios têm sido amplamente utilizados para estudar o desenvolvimento embrionário. O desenvolvimento embrionário inicial é impulsionado por fatores armazenados pela mãe acumulados durante a oogênese. Para estudar os papéis de tais fatores maternos no desenvolvimento embrionário inicial, é desejável manipular suas funções desde o início do desenvolvimento embrionário. As formas convencionais de interferência gênica são alcançadas pela injeção de oligonucleotídeos antisense (oligos) ou mRNA em óvulos fertilizados, permitindo a sub ou superexpressão de proteínas específicas, respectivamente. No entanto, esses métodos normalmente requerem mais de várias horas até que a expressão da proteína seja afetada e, portanto, a interferência das funções do gene não é eficaz durante os estágios embrionários iniciais. Aqui, apresentamos um sistema experimental no qual os níveis de expressão de proteínas maternas podem ser alterados antes da fertilização. Os oócitos de Xenopus laevis obtidos de ovários são desfoliculados por incubação com enzimas. Oligos antisense ou mRNAs são injetados em oócitos desfoliculados no estágio de vesícula germinativa (GV). Esses oócitos são amadurecidos in vitro em óvulos no estágio de metáfase II (MII), seguido por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Desta forma, até 10% dos embriões ICSI podem atingir o estágio de girino nadador, permitindo assim testes funcionais de knockdown ou superexpressão de genes específicos. Essa abordagem pode ser uma maneira útil de estudar os papéis dos fatores armazenados maternalmente no desenvolvimento embrionário inicial.

Introdução

Xenopus laevis é um amplamente utilizado, poderoso organismo modelo para estudar o desenvolvimento 1. Isso ocorre porque os ovos de Xenopus são extraordinariamente grande (cerca de 1,2-1,4 mm, em comparação com congéneres de mamíferos sendo cerca de 0,1 mm) e abundante. Os ovos contêm componentes maternalmente sintetizados e armazenados, que são o suficiente para conduzir o desenvolvimento embrionário até meados de transição blastula (MBT, que ocorre na fase de 8-8,5 com células 4,000-8,000). MBT é acompanhada de ativação do genoma zygotic, que então produz produtos de genes embrionários que direcionam o desenvolvimento.

Numerosos estudos teve como objetivo identificar fatores maternos importantes para o desenvolvimento. Muitos estudos baseiam-se na injecção de oligonucleótidos anti-sentido (oligos), incluindo oligonucleótidos de morfolino em embriões fertilizados, caso em que a degradação de proteínas maternas podem ser observados na fase de gástrula 2-4. Alternativamente, os ARNm são injectados para fertilizados inbryos perturbar funções de genes ou para traçar destino de proteínas sobre-expressos. No entanto, a injecção nos embriões em estágio de uma célula normalmente não afeta os níveis de proteínas maternos expressão nas fases embrionárias muito cedo antes MBT.

Heasman e Wylie estabelecido o método de transferência de acolhimento para superar esse problema 5. No método, os oócitos desfoliculados manualmente são injectados com oligonucleótidos anti-sentido e transferidos para fêmeas hospedeiras 6. As proteínas são reprimidos antes da fertilização, de modo que os papéis de proteínas downregulated no desenvolvimento embrionário precoce pode ser examinado. Este método de depleção materna levou à identificação de vários papéis de desenvolvimento únicas de proteínas maternas, como revisado em 7.

Neste relatório, detalhamos o nosso método desenvolvido recentemente, em que a depleção materna ou sobre-expressão de mRNA antes da fertilização é conseguido sem defolliculation manual e transferência de acolhimento8. Defolliculation manual requer muito tempo e transferência de acolhimento muitas vezes precisa de técnicas hábeis e a licença específica para a cirurgia animal, dificultando, assim, o uso frequente de método de depleção materna. Defolliculation e transferência de acolhimento são substituídos por defolliculation enzimática 9,10 e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) 11-13, respectivamente. ICSI a ovos foi originalmente usado para produzir rãs transgênicos 12. Esperma e embrionárias núcleos também foram transplantadas para in vitro de oócitos de anfíbios amadureceu 11,14,15. Aqui, vamos mostrar o nosso método passo-a-passo para injetar esperma para oócitos maturados in vitro que foram pré-injectados com oligos anti-sentido ou mRNA.

Protocolo

NOTA: Todas as experiências com rãs foi realizada seguindo requisitos do UK Home Office.

1. Preparação de oócitos de Xenopus laevis

  1. Cerca de uma semana antes da coleta de oócitos, injetar rãs do sexo feminino com 150 U de Pregnant Mare Serum gonadotrofina (PMSG) para a pré-priming usando uma seringa estéril ml com uma agulha 27 G. A injecção é feita por via subcutânea em saco linfático dorsal.
    NOTA: É ideal para usar sapos que não põem ovos por um longo tempo (pelo menos mais da metade anos) ou que nunca colocaram ovos antes.
  2. Loja rãs pré-condicionadas em um tanque de água fixada em 18 ° C em luz ambiente controlada (07:00-19:00: on, 19:00-07:00: off).
  3. No dia da recolha de oócitos, preparar 1 L de 1x Solução de modificação (MBS) de Barth de estoque 10x MBS por diluição com água bidestilada (ddH2O), e adicionar penicilina e estreptomicina na concentração final de 10 ug / mlcada (MBS + PS). Estoque 10x MBS consiste de NaCl 880 mM, KCl 10 mM, NaHCO3 24, 8,2 mM de MgSO 4 .7H 2 O, 3,3 mM de Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, mM CaCl 2 .6H 2 O, 100 4,1 mM de HEPES, pH 7,5.
  4. Anestesiar uma rã pré-condicionadas por injecção subcutânea de 120 mg (em 400 uL) de tricaina metanossulfonato (MS222). Mantenha o sapo injetado em um pequeno tanque com água.
  5. Após 10 minutos, verifique o sapo anestesiado por entregá-lo com sucesso desde sapos anestesiados não respondem a isso. Se a anestesia é incompleta, adicione gelo para dentro do tanque e esperar por mais 10 min.
  6. Pegue o sapo do pequeno tanque e coloque em decúbito dorsal em uma úmida limpe.
  7. Utilizando uma pinça e uma tesoura pequena cirurgia, comprimir a pele e fazer uma pequena incisão (2 cm) na parte inferior do abdômen, lateral à linha média. Faça outra incisão no outro lado.
  8. Depois de cortar a pele, levante o wi camada muscularth fórceps e fazer a incisão na camada muscular.
  9. Observe o ovário após a camada muscular é cortado e puxe o ovário a partir das incisões com a pinça.
  10. Transferência extraída ovário para um tubo de 50 ml com solução de MBS.
    NOTA: Tente recolher o máximo possível de ovário ambos incisões.
  11. Abater o sapo fêmea por sangria, seguido de congelamento para posterior destinação adequada.
  12. Lavar o ovário extraída várias vezes com MBS + PS até que o sangue é removido por lavagem. Em seguida, transfira o ovário para um prato de 9 centímetros de Petri contendo MBS + PS
    NOTA: Verifique a qualidade dos ovócitos sob um microscópio de dissecação neste momento. Se oócitos são aparentemente má qualidade, tal como oócitos com pigmentação irregular na metade animal (Figura 1A), não processam mais e, em vez de obter um novo ovário. Idealmente, os oócitos deve ter hemisférios animais igualmente pigmentadas e ser aproximadamente do mesmo tamanho.
  13. Provoque o ovário em pedaços pequenos(1-2 cm 2) e recolher 5 ml de oócitos em um novo tubo de 50 ml.
  14. Enxaguar 5 ml de ovário rasgada algumas vezes com MBS + PS e adicionar MBS + PS a 15 ml.
  15. Adicionar 7 unidades da enzima para defolliculation à suspensão dos ovários (ver lista de materiais).
    NOTA: Reconstituir enzima liofilizado com 10 ml de ddH2O (28 unidades / ml). Coloque o frasco durante 30 minutos no gelo com agitação suave ocasional. Aliquota de 250 uL e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
  16. Incubar a peça ovário com a enzima durante 1 hora com agitação suave num agitador (velocidade de 15 rev / min, equivalente a aproximadamente 0.014 x g).
    NOTA: Para a remoção quase completa das células foliculares, 2 h a 2 h 15 min de incubação com a enzima é normalmente necessário. Longer incubação é necessário para oócito transferência nuclear experimento 16.
  17. Após 1 hora de incubação, pegar um pequeno número de oócitos tratados (10-20 ovócitos) e transferir para um 6 centímetros de Petri contendo MBS + PS Verifique a extent de defolliculation sob um microscópio de dissecação. Se oócitos são separados um do outro e pelo menos parcialmente desfoliculados (Figura 1B), prosseguir imediatamente para a reacção seguinte paragem (passo 18). Se os oócitos ainda estão fortemente rodeado por células foliculares, incubar durante mais 15 minutos adicionais no máximo.
  18. Adicionar uma abundância de MBS + PS para parar a reacção e desprezar o sobrenadante. Repetir a lavagem de 10 vezes.
    NOTA: Adicionar MBS + PS vertendo para a parede de um tubo de 50 ml, mas não directamente para os oócitos. Após suspensão em MBS + PS, os oócitos imaturos pequenas tendem a flutuar no topo do tampão de lavagem e descartar esses pequenos oócitos flutuam.
  19. Após as lavagens, transfira para um prato de 9 centímetros de Petri contendo MBS + PS
    NOTA: A partir deste passo em diante, manter oócitos a 16-18 ° C tanto quanto possível. Isto pode ser feito, mantendo o prato contendo oócitos em uma fase de temperatura controlada.
  20. Selecione estágio VI oócitos segundo a classificação de Dumontpara utilizações subsequentes e transferência para uma nova placa de Petri 9 centímetros contendo MBS + PS transferência de oócitos pode ser feito por meio de uma pipeta de vidro com um tamanho de pontas adequada (maior do que o tamanho do oócito).
    NOTA: oócitos de boa qualidade deve ter um hemisfério animais uniformemente pigmentada com claro contraste entre o hemisfério animal e do hemisfério vegetal, e ser aproximadamente igual tamanho (Figura 1C). Fase VI oócitos representam ovócitos que podem responder a progesterona totalmente crescidas (diâmetro dos ovócitos é de cerca de 1,2-1,4 mm).

2. Injecção de oligonucleótidos anti-sentido ou mRNA em oócitos

NOTA: Todas as etapas desta seção deve ser feita a 16-18 ° C em um palco microscópio equipado com circulação de água com temperatura controlada ou em uma caixa de plástico cheio de gelo.

  1. Transferir 200-300 oócitos seleccionados para uma nova placa de Petri 9 centímetros preenchido com MBS + PS, na qual será realizada a microinjecção.
    NOTA: Em each condição, 200-300 oócitos são normalmente utilizados. No total, cerca de 1000 oócitos são utilizadas numa experiência.
  2. Para a preparação de injecção de oligos anti-sentido ou mRNA, ejetar o êmbolo de metal de um microinjector.
  3. Encha um capilar de vidro com óleo mineral utilizando seringa e inserir o capilar de vidro cheia de óleo para o êmbolo de metal de microinjector.
    NOTA: Uma capilar de vidro é puxado por micropipeta extrator. Estas agulhas são mantidas numa caixa sem danificar dicas.
  4. Cortar a extremidade da agulha através de pequenas tesouras cirúrgicas sob um microscópio apontando como ponta de pequeno diâmetro para injecção quanto possível.
    NOTA: A ponta da agulha pode ser afiado, usando uma forja ou micropipeta micro beveler. Para o bisel da agulha com um ângulo de 25 ° melhora a capacidade de atravessar a parede do oócito.
  5. Colocar uma pequena tira de Parafilm sobre a plataforma de um microscópio de dissecação e dispensar uma gota de 3 mL da solução de oligo anti-sentido ou mRNA.
  6. Mova a tip da agulha de injecção dentro da pequena gota de solução e encher a agulha com a solução a ser injectada.
    NOTA: Se a ponta da agulha de injecção é muito pequeno, as bolhas de ar deve aparecer na ponta do êmbolo de metal. Em seguida, faça uma dica maior sobre a agulha de injeção até que isso não acontece.
  7. Marque a agulha de injecção aproximadamente 0,5 mm da ponta. Esta marca é utilizada como um indicador de profundidade de injecção.
  8. Inserir a ponta da agulha dentro de um óvulo ao longo do limite equatorial apontando para o ponto central do oócito (debaixo da vesícula germinal), mantendo suavemente o lado oposto do oócito ao ponto de injecção com uma pinça para impedir o movimento indesejável durante a injecção de oócitos .
    NOTA: Encontre a área livre de células foliculares (Figura 1B) e inserir a agulha do que ponto uma vez que mesmo uma agulha fina não pode muitas vezes penetrar uma camada de células foliculares.
  9. Ejetar 4,6 ng / 4.6 nl ou 9,2 ng / 9.2 nl de antisoligos ense, ou um volume adequado de mRNA (250 pg para 13,8 ng) usando a chave de pé. Detalhes da preparação de anti-sentido são descritos em oligo 7.
  10. Transferir os oócitos injectados em um prato de 6 centímetros de Petri cheia de MBS + PS suplementado com BSA a 0,1% (meio de incubação dos oócitos e esterilizar a solução através de um filtro de poro de 0,45 um).
  11. Incubar os oócitos em 16 ° C ou 18 ° C durante 1-2 dias.
    NOTA: Injected oócitos podem ser submetidas a maturação in vitro de várias horas após a injecção, no caso em que a injecção de oligonucleótidos anti-sentido de 4,6 ng é preferível. A regra geral é que quanto mais curto for o período de incubação é, melhor o desenvolvimento embrionário subsequente.

3. maturação in vitro (MIV) de oócitos

  1. Na noite da maturação do oócito experimento, buscar solução estoque de progesterona (30 mM em etanol) de -80 ° C freezer e dissolver precipitados na TEM quartoratura com vortex ocasional.
    NOTA: O estoque de progesterona é normalmente deixada à temperatura ambiente durante 30 min a 1 h.
  2. Adiciona-se 5 ul de estoque a progesterona em 50 ml de MBS + PS (meio de maturação; a concentração final de progesterona a 3 uM) e agitar no agitador durante 30 minutos para distribuir a progesterona na solução de forma igual.
  3. Prepara-agarose revestidas seis centímetros em pratos para tratamento de maturação in vitro.
    1. Adicionar 1 g de agarose com 50 ml de 1x MBS sem magnésio e cálcio.
    2. Dissolve-agarose por aquecimento em um forno de microondas.
    3. Pour um pequeno volume de solução de agarose a seis centímetros pratos para cobrir o fundo de pratos.
    4. Espere pelo menos 30 minutos até que a solidificação.
    NOTA: revestimento de agarose impede a aderência de oócitos para pratos. Uma vez em oócitos maturados in vitro estão firmemente ligados aos pratos, é mais provável que os oócitos vai ser activado por estímulos que recebe durante o descolamento do dishes.
  4. Despeje 5-8 ml de meio de maturação a agarose revestido pratos e transferir 200-300 oócitos em cada seis centímetros pratos.
    NOTA: Tentar transferir oócitos com uma quantidade mínima de meio de incubação oócito.
  5. Incubar durante 16 horas a 16 ° C.
    NOTA: Por exemplo, iniciar o tratamento em 05:00 e terminar às 9 horas da manhã do dia seguinte.

4. Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI)

  1. Preparação de massa de esperma congelado
    NOTA: A preparação segue o esperma deve ser feito antes de iniciar a maturação do oócito experiência, e os estoques de esperma congeladas são mantidas a -80 ° C durante a ICSI.
    1. Recolha os testículos de um sapo macho seguindo os passos 1,4-1,11, exceto para puxar gordura e testamos a partir das incisões com a pinça e remoção de testículos da gordura.
    2. Lavar testículos em 1x de modificação de Ringer de Marc (MMR, NaCl 100 mM, KCl 2 mM, 1 mM MgSO4, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de HEPES, pH 7,4).
    3. Retirar uma gordurad vasos sanguíneos por rolar os testículos lavadas em um lenço de papel limpo e, em seguida, removendo restantes vasos sanguíneos usando uma pinça.
    4. Colocar cada testículo de um prato de Petri contendo 3,5 centímetros 1 ml de 1x MMR.
    5. Cortar longitudinalmente com uma tesoura fina, e rasgar em pedaços pequenos com uma pinça até sem grandes peças permanecem.
    6. Pipeta-se para baixo e usando 1 ml de ponta de plástico, cuja extremidade é cortada, e a carga de 1 ml de solução de testículo esmagada para um homogeneizador de vidro.
    7. Homogeneizá-los por 2-3 derrames e, em seguida, verter a solução sobre um filtro de poro de 50 um ligado ao topo de um tubo de centrífuga de 15 ml. Permitir que a solução para passar pelo filtro.
    8. Repita o passo 4.1.7 pela ressuspensão do testículo corte restante em 1 ml de 1x MMR. Finalmente, lava-se a um homogeneizador de duas vezes com 1x MMR e passá-lo através do filtro.
    9. Repita os passos 4.1.5 a 4.1.8 para o outro testículo e piscina dois testículos em um tubo de 15 ml de centrífuga.
    10. Gire as células a 800 xg a 46; C durante 20 min.
    11. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 2 ml de 1x MMR. Em seguida, transferir para um tubo novo.
      NOTA: Certifique-se de que não há células do sangue visíveis estão presentes.
    12. Preparar um gradiente de passo de um tubo de centrífuga de ultra-claro 14 ml. Camada inferior: 4 ml de 30% iodixanol. Segunda camada inferior: 1 ml de 20% iodixanol. Camada inferior Terceiro: 5 ml de 12% iodixanol. Camada Top: testis células em 2 ml de 1x MMR. Overlay os gradientes muito suavemente com uma ponta de pipeta 1 ml (sobrepor-se lentamente para não perturbar a fase de fundo).
      NOTA: Apenas uma camada de 30% iodixanol também deve trabalhar para isolar apenas esperma.
    13. Rotação no rotor SW40 usando ultracentrífuga a 10.000 xg a 4 ° C por 15 min (de desaceleração, sem uma pausa).
    14. Remova cuidadosamente o tubo do ultracentrífuga. Confirma uma interface entre cada camada do gradiente e o sedimento no fundo.
    15. Recolher a fracção de esperma a partir do sedimento.
    16. Ressuspender o pel espermadeixe em 1x MMR para lavagem iodixanol. Centrifugação a 800 xg a 4 ° C durante 20 min.
      NOTA: Se um lote de esperma ainda permanecer na suspensão após a centrifugação, re-centrifugação do sobrenadante a 3220 xg, a 4 ° C durante 20 minutos e recolher o esperma sedimentadas.
    17. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de esperma de 1x tampão de Preparação Nuclear (NPB; sacarose 250 mM, espermidina 0,5 mM de tri-hidrocloreto, 0,2 mM de espermina tetracloridrato, EDTA 1 mM, HEPES 15 mM, pH 7,7) 13. Em seguida, transferir para um tubo Eppendorf.
    18. Adicionar 50 ul de 10 mg / ml solução em digitonina 1x NPB (Ressuspender digitonina pó em DMSO a 50 mg / mL e congelar em alíquotas a -80 ° C. Antes do uso, dilui-se a 50 mg / ml de aliquota de 10 mg / ml com 1x NPB. não utilizado 10 mg / ml de digitonina podem ser congeladas e armazenadas a -20 ° C e re-usada) a 1 ml de solução de esperma.
    19. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
    20. Verifique a taxa de permeabilização por coloração DAPI (0,3 ug / ml DAPI como uma final de concentração). Se menos de 95% das células são permeabilizadas, incubar um pouco mais de tempo.
      NOTA: se muitas vezes, as células do esperma são incubadas ao mesmo tempo (em especial quando o esperma são recolhidos a partir de testes múltiplos), é difícil para permeabilizar, caso em que pode ser necessário adicionar uma pequena quantidade adicional de Digitonina; por exemplo, se 20% dos espermatozóides não são permeabilizadas, é adicionado um adicional de 20 l Digitonin.
    21. Pare permeabilização pela adição de 10% de BSA a 3% de concentração final.
    22. Rodar as células a 4 ° C.
      NOTA: Tente o mínimo da velocidade de centrifugação possível, começando com 100 g durante 5 min. Se não for suficiente, aumentar a velocidade e / ou tempo.
    23. Lavam-se as células com 0,3% de BSA em 1x NPB e centrifugar à mesma velocidade que o passo 4.1.22. Entretanto, preparar o tampão de armazenamento de esperma (SSB; 2 mL de 2x NPB, 120 ul de BSA a 10%, 1,2 ml de glicerol autoclavado, 680 ul de H2O).
    24. Adicionar 500 ul de SSB para o espermasedimentar. Pipeta várias vezes para cima e para baixo para voltar a suspender com uma ponta de corte a fim de não danificar as células.
    25. Deixa-se equilibrar durante a noite a 4 ° C.
    26. Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de corte.
    27. Diluir um par de microlitros 10 vezes em 1x MMR ou em 1x PBS para contar as células usando hemocitômetro.
    28. Congelar como alíquotas de esperma em 30.000 / uL (ou superior) directamente a -80 ° C e armazenar a -80 ° C em alíquotas de uma única utilização.
  2. ICSI para maturados in vitro de oócitos
    NOTA: Todos os processos que envolvem ovócitos deve ser feita a 16-18 ° C.
    1. Prepare uma pipeta de vidro para a transferência de oócitos maturados.
      NOTA: A pipeta de vidro tem que ser grande o suficiente para acomodar ovócitos sem apertar.
    2. Dezasseis horas depois de se mudar para a forma oócitos contendo progesterona, transferência oócitos maturados em uma placa revestida de agarose-6 centímetros preenchido com MBS + PS para a lavagem.
      NOTA: É importante, moócitos atured tem que ser tratado com muito cuidado. Tratamento áspero de ovócitos podem induzir a ativação espontânea antes da injeção de esperma.
    3. Contagem de oócitos maturados, confirmando o aparecimento de manchas brancas, o que implica a quebra da vesícula germinal (Figura 2). Se a velocidade de maturação é inferior a 80%, é improvável obter o número suficiente de embriões sobreviventes para análises posteriores.
      NOTA: as células do folículo restantes são descascadas após a maturação do oócito (Figura 2).
    4. Oócitos de transferência de lavagem MBS para um novo disco de 6 cm revestidas com agarose cheia com o fluido de injecção (500 ml Prepara: 30 g de Ficoll (6%), 20 ml de 10x MMR e 500 ul de estoque de PS 1.000X).
    5. Incubar, pelo menos, durante 30 min antes de iniciar a ICSI.
    6. Configure o microinjector conforme descrito nas etapas 2,2-2,4.
      NOTA: O tamanho da ponta da agulha de injecção é mantida tão pequena quanto possível, seguindo o procedimento descrito no passo 2.6. O diâmetroda agulha é de 20-40 | im. Biselar a ponta de agulha, como descrito no passo 2.4 possam permitir a injecção eficiente.
    7. Fetch a alíquota de esperma e dilui-se a suspensão de espermatozóides em tampão de diluição de esperma (SDB; sacarose 250 mM, KCl 75 mM, espermidina a 0,5 mM, espermina 0,2 mM, 200 uM de HEPES pH 7,5).
      NOTA: A diluição pode ser variada dependendo do tamanho da agulha e assim por diante. Diluir 120 vezes do esperma 30.000 / estoque ul como uma tentativa inicial e ajustar ainda mais, se necessário.
    8. Colocar uma pequena tira de Parafilm sobre a plataforma de um microscópio de dissecação. Misturar a solução de injecção de esperma por pipetagem e dispensar uma gota poucos ul da solução de esperma.
    9. Sugam a suspensão de esperma diluído para dentro da agulha, injectar 4,6 nl em 10 gotas sucessivas contendo 0,3 ug / ml de DAPI numa lâmina de microscópio, e rapidamente contar o número de esperma entregue por injecção num microscópio fluorescente.
      NOTA: Aponte 1-2 espermatozóides por injeção. Se necessário, diluir a solução de injecção de esperma maise verificar o número de espermatozóides por injeção novamente até alcançar uma concentração desejada.
    10. Ejetar a solução para injecção de teste e preencha uma nova solução de injeção de esperma com uma concentração adequada.
    11. Injectar 4,6 nl de solução de esperma para 100 oócitos maturados.
      NOTA: É importante para injectar continuamente a solução. Em primeiro lugar determinar o tempo necessário para ejectar 4,6 nl (normalmente 1-2 segundos). Repetir o processo que se segue; injetar em um ovócito, aguarde alguns segundos, retirar uma agulha e mock-injeção em solução injectável, aguarde alguns segundos, injetar em um ovócito. Esta injecção contínua também impede o bloqueio da ponta da agulha. Alternativamente, o método que utiliza uma bomba 13 pode ser usado.
    12. Depois de cerca de 100 injeções, ejetar a solução esperma restante e voltar a encher a solução de espermatozóides (usar a mesma solução de esperma, mas pipeta cima e para baixo antes de dispensar).
      NOTA: Se a agulha não sugue solução esperma bem, a ponta de corte a necessidadele. Se isso não melhorar a situação, preparar uma nova agulha.
    13. Repetir o processo de injecção até que todos os oócitos são injectados.
      NOTA: Se a qualidade do ovócito é bom e a injeção é bem-sucedida, a contração de oócitos injectados é visto dentro de 20 min de tempo de injeção.
    14. Mova os pratos injetados a 16 ° C ou 18   ° C incubadora.
    15. 4-5 horas após a injecção, verifique a taxa de clivagem de embriões de ICSI.
      NOTA: sulcos Decote desses embriões pode não ser tão claro quanto as de embriões fecundados normais. Alguns embriões também mostram clivagens anormais, que podem ser causados ​​por injecção múltipla esperma.
    16. Transferir clivado incluindo embriões embriões anormalmente clivados para meio de incubação (500 ml: Preparar 20 g de Ficoll (4%), 5 ml de 10x MMR e 500 ul de estoque de PS 1.000X).
    17. Incubar embriões ou em 16   ° C ou 18 ° C incubadora durante a noite.
    18. Na manhã seguinte, a transferência de EmbryOS para 0,1x MMR e contar sobreviver embriões.
    19. Em média, cerca de 10% dos oócitos injectados com esperma pode desenvolver para a fase de natação girino (Figura 3A).

Resultados

O desenvolvimento embrionário de embriões utilizando ICSI em oócitos maturados in vitro foi analisado (Figura 3A). As taxas de maturação dos oócitos GV para o palco MII são variáveis ​​e depende muito da qualidade do oócito. Em boas experiências, quase 100% dos oócitos GV responder a progesterona e mostrar sinais de maturação do oócito, finalmente se tornando ovos na fase MII. Todos os oócitos foram submetidos a ICSI e cerca de 25% dos ovos injectados clivados (Figura 3A, n = 13 para o controlo scrambled oócitos injectados com oligo e n = 7 para não oócitos injectados com oligo). Cerca de 60% ou 80% dos embriões clivados, produzidos a partir de oócitos injectados com oligo de controlo ou oócitos não injectados, respectivamente, atingiram o estádio de blástula / gástrula. Entre os embriões de blástula / gástrula, cerca de metade dos embriões injectados com amostras em oligo foram de boa qualidade (quase nenhum sinal de clivagem anormal e apoptose), enquanto que 82% dos embriões de blástula / gástrula foram de boa qualidade em namostras em injectados (Figura 3A). Por fim, 41% e 11% dos embriões injectados clivados em amostras de oligo-atingiu a resposta muscular e as fases natação girino, respectivamente, enquanto 60% e 29% dos embriões clivados em amostras não injectados fez (Figura 3A). Estes embriões são ICSI a mistura de embriões normais e anormais (Figura 3B). Alguns deles sofrem metamorfose e desenvolver a amadurecer rãs 8. Estes resultados sugerem que a injecção de oligonucleótidos anti-sentido em oócitos GV, seguido por IVM e ICSI, permite o desenvolvimento embrionário inicial eficiente. Embora a injeção de si oligos antisense diminui o desenvolvimento embrionário, que ainda são capazes de obter embriões suficientes para muitos fins experimentais, como verificar as taxas de desenvolvimento, RT-PCR, Western Blot e assim por diante.

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Figo ure 1: Os exemplos típicos de oócitos de Xenopus laevis de boa qualidade ou má qualidade de experimentos in vitro de maturação. (A) Um exemplo de oócitos de má qualidade. Por exemplo, os oócitos que mostram pigmentação irregular não são utilizadas para as experiências subsequentes. Cada oócito de Xenopus laevis é de cerca de 1,2-1,4 mm de diâmetro. (B) Um oócito parcialmente desfoliculados. A metade direita do oócito é coberta por células foliculares, os quais podem ser distinguidas pela presença de vasos sanguíneos. Uma seta mostra uma área livre de células do folículo e em que a agulha de injeção é injetado. (C) Um exemplo de oócitos de boa qualidade, que são do mesmo tamanho e mostram hemisférios animais uniformemente pigmentadas com claro contraste entre o hemisfério animal e do hemisfério vegetal.

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Figura 2:. Oócitos de Xenopus laevis, antes e após a maturação Após a maturação do oócito, claras manchas brancas aparecem no topo da hemisférios animais e células foliculares são descascadas. Cada laevis oócito Xenopus é de aproximadamente 1 mm de diâmetro.

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Figura 3: Desenvolvimento de embriões de ICSI, produzidos a partir de oócitos maturados in vitro. (A) O desenvolvimento de embriões de ICSI para cada fase é resumido. Os oócitos foram injectados com oligonucleótidos anti-sentido de controlo scrambled (controlo) de injecção de oligo ou sem injecção (não injectável), seguido por IVM e ICSI. O número correspondente de embriões em cada fase é mostrado acima das barras. A média ± SEM é mostrado. N = 4-13 experiências independentes / f diferenteemales. (B) Exemplos de sobrevivência de embriões de ICSI. Estes embriões nos estágios tailbud foram produzidos de uma experiência, em que cerca de 200 oócitos foram usadas como um material de partida.

Discussão

Nós aqui detalhe um novo método para esgotar fatores maternos ou overexpress fatores exógenos antes da fertilização. Este sistema requer dois micro-injecções, mas em vez disso ignora a cirurgia de sapos, utilizado no método de transferência 7,17 hospedeiro. É ideal para remover a etapa cirurgia sapo em termos de cuidados com os animais. Além disso, não temos de levar em conta a qualidade de rãs do sexo feminino de acolhimento para os experimentos de transferência, o que significa que podemos nos livrar de um fator biológico que afeta o sucesso dos experimentos. Portanto, neste sistema a qualidade dos oócitos obtidos a partir de rãs PMSG-condicionadas é um importante fator biológico que é a chave para as experiências bem-sucedidas. A qualidade dos oócitos pode ser julgado após a coleta de ovário ou após defolliculation. Se qualquer anormalidade for observada nestas fases, é ideal para coletar outro ovário de uma nova rã. Outro ponto em que você pode verificar a qualidade do ovócito é após a maturação do oócito. Se menos do que 80% de progesteronaoócitos tratados-e mostrar sinais de maturação, você pode não ser capaz de obter o número suficiente de embriões para análises posteriores. O uso de defolliculation enzimática em vez de defolliculation manual é também uma outra vantagem de se utilizar este sistema para reduzir o trabalho necessário para defolliculation. No entanto, ainda é possível que defolliculation manual pode dar um desenvolvimento melhor do que o tratamento enzimático.

Como mostrado na Figura 3, quase 10% dos oócitos maturados in vitro podem alcançar o estágio natação girino. Estes dados são recolhidos a partir de 13 experimentos independentes, incluindo os relatados em 8 e novos experimentos de injeção. Método de transferência anfitrião precisa 75-150 ovócitos em cada tratamento para a obtenção de dados significativos uma vez que 30-60% dos oócitos transferidos podem chegar à fase neurula 17. O nosso método começa normalmente com 200-300 oócitos em cada grupo experimental, uma vez que aproximadamente 40-60% dos embriões clivados pode chegar afase resposta muscular. Estes dados sugerem que ambos os métodos de desenvolvimento suporta uma taxa razoável. Temos até agora obtido 10 sapos vivos de oócitos com injeção de controle oligo antisense com injecção de mRNA e controle utilizando esta técnica, indicando que esta abordagem apoia o desenvolvimento por meio de metamorfose.

Nosso método de manipulação de oócitos-ICSI é uma oportunidade para testar o papel dos fatores maternos durante o desenvolvimento embrionário muito cedo, logo após a fertilização. Além disso, a sobre-expressão de factores de modificação da cromatina antes da fertilização pode tornar possível a remodelação da cromatina materna antes da fertilização para a compreensão estados cromatina materna necessário para o desenvolvimento. Esta estratégia também pode funcionar bem com sistemas de edição gene atuais, como a transcrição ativador-like efetoras nuclease (TALEN) 18,19 e CRISPR / CAS9 20,21 uma vez que estes podem ser expressas, mesmo antes da fertilização. Portanto, a nossa nova abordagem tem uma potentiAl de ser utilizado para muitas aplicações no futuro.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos aos membros do laboratório Gurdon pela discussão útil. K.M. é pesquisador do Wolfson College e é apoiado pela Herchel Smith Postdoctoral Fellowship e pela Great Britain Sasakawa Foundation. O laboratório Gurdon é apoiado por doações do Wellcome Trust (RG69899) e MRC para JBG

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gonadotrofina Sérica de Égua Grávida (PMSG) MSD Saúde AnimalVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu pó e solvente para solução injetável
Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS222)SigmaA5040Para anestesia
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001Para desfoliculação de oócitos. Armazenar em -20  °C.
Nanoject DrummondDrummond Scientific Company3-000-205/206Para microinjeção
capilar de vidro Laboratórios Alpha7" Drummond #3-000-203-G/XLPara Microinjeção
Micropipeta Extrator Instrumento SUTTERModelo D-97Para microinjeção
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500Para maturação in vitro e
tubo de centrífuga ultra-claro ICSI 14 ml Beckman Coulter United Kingdom Ltd344060Para purificação de esperma
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)SigmaD1556Para purificação de esperma
DigitoninSigma D141Reagente de permeabilização celular
ShakerHybaid HB-SHK-1Para desfoliculação de oócitos
Microscópio de dissecação (microscópio de zoom estéreo)ZEISSSemi SV6Para coleta de oócitos e microinjeção
50 μ filtro de poros mCellTrics04-0042-2317Para purificação de esperma
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100XPPara purificação de esperma
Tubo de centrífuga de 50 mlCellstar Greiner Bio-One227261 ou 210261Coleta de oócitos e reação de desfoliculação
Tubo de centrífuga de 15 mlFALCON352097Para purificação de esperma
90 mm Petri prato Thermo Scientific101VR20/C
, 60  x  PratoFALCON353004
de Fácil Manuseio de 15 mm, 35  x  FALCON351008
Prato de Cultura de Células de Fácil Manuseio de Cultura de Células de 15 mm

Referências

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