A edição de genes mediada por TALEN no locus AAVS1 de porto seguro permite a adição de transgenes de alta eficiência em iPSCs humanas. Este protocolo descreve os procedimentos para preparar iPSCs para TALEN e entrega de vetor de doador, transfectar iPSCs e selecionar e isolar clones de iPSC para obter a integração direcionada de um gene GFP para gerar linhagens repórter.
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Artigo de método
Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor
Neste artigo
Resumo
Resumo
A adição de transgene direcionada pode fornecer expressão gênica persistente enquanto contorna o silenciamento de genes e a mutagênese insercional causada pela integração aleatória mediada por vetores virais. Este protocolo descreve uma plataforma de adição direcionada a transgenes universal e eficiente em iPSCs humanas com base na utilização de TALENs de código aberto validados e um doador semelhante a uma armadilha de genes para entregar transgenes em um locus de porto seguro. É importante ressaltar que a edição gênica eficaz é limitada pela eficiência de entrega dos vetores de edição de genes. Portanto, este protocolo se concentra primeiro na preparação de iPSCs para transfecção para alcançar alta eficiência de entrega nuclear. Quando as iPSCs são dissociadas em células únicas usando um reagente de dissociação de células suaves e transfectadas usando um programa otimizado, >50% das células podem ser induzidas a absorver os grandes vetores de edição de genes. Como o locus AAVS1 está localizado no íntron de um gene ativo (PPP1R12C), um gene resistente à puromicina (PAC) ligado ao aceitador de splicing (SA) foi usado para selecionar iPSCs direcionados, excluindo células somente de integração aleatória e não transfectadas. Essa estratégia aumenta muito a chance de obter clones direcionados e também pode ser usada em outros experimentos de direcionamento de genes ativos. Duas semanas após a seleção da puromicina na dose ajustada para a linha específica de iPSC, os clones estão prontos para serem colhidos por dissecação manual de colônias grandes e isoladas em pedaços menores que são transferidos para meio fresco em um poço menor para maior expansão e triagem genética e funcional. Pode-se seguir este protocolo para obter prontamente várias linhas de iPSC repórter GFP que são úteis para imagens in vivo e in vitro e isolamento celular.
Introdução
A capacidade de reprogramar células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas semelhantes a células-tronco embrionárias (iPSCs) foi descoberto pela primeira vez por Takahashi et al., Em 2007 1. Fibroblastos dérmicos humanos transduzidas com retrovírus expressando quatro fatores de transcrição (The Yamanaka assim apelidado fatores OCT3 / 4, Sox2, foram mostradas c-Myc, e KLF4) ser altamente semelhante às células estaminais embrionárias humanas (hESCs) com base na morfologia, a proliferação, a expressão do gene, e estado epigenética; crucialmente, iPSCs também são capazes de se diferenciarem em células de todas as três camadas germ....
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Protocolo
1. Preparação da Membrana Basal Matrix e Revestimento de Plasticware
- Colocar a membrana basal estoque matriz congelada de -20 ° C em gelo e descongelar durante a noite a 4 ° C.
- Após o descongelamento, pipeta 2 mg alíquotas de matriz da membrana basal em tubos Eppendorf de pré-refrigerados. Armazenar estes a -20 ° C até ser necessário.
- Para preparar placas revestidas com matriz da membrana basal, descongelar uma alíquota sobre o gelo até o último pedaço de gelo nas desaparece tubo eppendorf (geralmente dentro de ~ 2 horas).
- Após a descongelação, adicionar matriz da membrana basal para 12 ml de frio (4 ° C) DMEM / F12 para fazer....
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Resultados
A visualização do protocolo é fornecido na Figura 2, com períodos em que iPSCs são cultivados em meio diferente destaque por qualquer verde para E8 ou azul para NutriStem. É importante para transfectar apenas iPSCs de alta qualidade; examinar placas de cultura em toda a manutenção de rotina e verificar que as culturas IPSC conter colônias principalmente distintos portadores de uma morfologia de paralelepípedos-like (Figura 3A); células diferenciadas não deve ocupar mais do que 10% da cu.......
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Discussão
Os passos mais críticos para a geração bem sucedida de AAVS1 porto seguro alvejado iPSCs humanos são: (1) a entrega eficiente TALEN e doadores plasmídeos em iPSCs por transfecção; (2) optimização de dissociação iPSCs em células individuais antes da transfecção e chapeamento densidade após transfecção; (3) a optimização da dose e do tempo de selecção de droga com base no crescimento da linha iPSC; (4) cuidadosamente dissecar e escolhendo colônias direcionados e transferindo a nova placa / poço. Em comparação com métodos .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Fundo Comum do NIH e pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Artrite, Doenças Musculoesqueléticas e de Pele.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz de membrana basal com fator de crescimento reduzido (TFG) Matrigel, *sem LDEV, 10 ml | Corning | 354230 | Armazene a -20 °C. |
| DMEM / F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Loja em 4 ° C. |
| Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente Costar | Well Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Armazene o meio basal a 4 °C. Armazene o suplemento a -20 °C. |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris | 1254 | Armazenar em temperatura ambiente. Uma vez dissolvido em H2O, conservar a -20 °C. |
| Cloreto de Sódio | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR - Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Armazene em nitrogênio líquido. |
| DMEM, glicose alta, piruvato | Life Technologies | 11995-040 | Armazenar a 4 °C. |
| Soro bovino fetal definido, origem americana | HyClone | SH30070.03 | Armazenar a -20 °C. Descongelar a 4 °C; C durante a noite e alíquota. Armazene alíquotas em -20 ° C até que seja necessário. |
| Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Armazenar a 4 °C. |
| Unidade de núcleo 4D-Nucleofector | Lonza | AAF-1001B | parte do sistema de eletroporação |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | parte do sistema de eletroporação |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Ao chegar, remova a solução de célula primária e suplemente e armazene a 4 °C. |
| Reagente de Dissociação Celular Accutase StemPro | Technologies | A1110501 | Armazenar a -20 °C. Descongele durante a noite a 4° C e aqueça uma alíquota em um 37 ° C banho-maria antes de usar. |
| NutriStem XF/FF Meio de Cultura | Stemgent | 01-0005 | Armazene a -20 °C. Descongele durante a noite a 4 ° C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 e 52638 | |
| [header] | |||
| AAVS1-CAG-EGFP Doador de recombinação homóloga | Addgene | 22212 | |
| Dicloridrato de puromicina | Life Technologies | A11138-03 | Armazenar a -20 >C. Preparar alíquotas de trabalho de 1 mg/ml em ddH2O. |
| Pipetas de vidro borossilicato descartáveis Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (refrigerado), 120 V 60 Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × rotor de balde oscilante de 750 ml | azul de 75003607 | Trypan | |
| da Thermo Scientific, 0,4% | Life Technologies | 15250-061 |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotec....
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Reimpressões e permissões
