Aqui, apresentamos um protocolo para injetar agentes de contraste de microbolhas de ultra-som de estar, isoladas de fim de gestação de embriões palco murino. Este método permite o estudo de parâmetros de perfusão e de marcadores moleculares vasculares dentro do embrião usando de alta freqüência ultra-sonografia com contraste.
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Artigo de método
Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem com contraste de ultrassom pode transmitir informações quantitativas essenciais sobre a vascularização e perfusão tecidual e, em aplicações direcionadas, facilitar a detecção e medição de biomarcadores vasculares em nível molecular. Dentro do embrião de camundongo, essa técnica não invasiva pode ser usada para descobrir mecanismos básicos subjacentes ao desenvolvimento vascular no sistema circulatório inicial do camundongo e em modelos genéticos de doenças cardiovasculares. O embrião de camundongo também se apresenta como um excelente modelo para estudar a adesão de microbolhas a alvos angiogênicos (incluindo o receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) ou αvβ3) e para avaliar a natureza quantitativa do ultrassom molecular. Portanto, desenvolvemos um método para introduzir agentes de contraste de ultrassom na vasculatura de embriões vivos e isolados. Isso permite liberdade em termos de controle e posicionamento da injeção, reprodutibilidade do plano de imagem sem obstrução e movimento e análise e quantificação simplificadas da imagem. Embriões murinos em estágio gestacional tardio (dia embrionário (E)16.6 e E17.5) foram isolados do útero, suavemente exteriorizados do saco vitelino e agentes de contraste de microbolhas foram injetados em veias acessíveis na superfície coriônica do disco placentário. A imagem de ultrassom de contraste não linear foi então empregada para coletar uma série de parâmetros básicos de perfusão (aumento de pico, taxa de lavagem e tempo para o pico) e quantificar a ligação de microbolhas direcionada em um modelo de camundongo endoglin. Mostramos a circulação bem-sucedida de microbolhas dentro de embriões vivos e a utilidade dessa abordagem na caracterização da vasculatura embrionária e do comportamento das microbolhas.
Introdução
Ultra-sonografia com contraste faz uso de agentes de contraste de microbolhas para visualizar e caracterizar o ambiente vascular. Estes agentes permitir a avaliação não invasiva da microcirculação, vascularização e função cardiovascular. Além disso, a modificação da superfície da bolha pode resultar em microbolhas de ligação orientada para biomarcadores endoteliais, como demonstrado em aplicações pré-clínicos de angiogénese, a aterosclerose e a inflamação 1,2 fazendo imagiologia de ultra-sons molecular de eventos vasculares possíveis. Com aumento de contraste de ultra-sons pode, portanto, ser usadas para identificar os ambientes complexos e diversos que in....
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Protocolo
NOTA: Os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê do Animal Care Research Institute Sunnybrook (Toronto, Ontário, Canadá). Os procedimentos para o tratamento humano dos animais devem ser observados em todos os momentos. Supõe-se que o investigador é treinado no funcionamento básico de um sistema de ultra-sonografia. Este protocolo funciona melhor com duas pessoas.
1. Modelos Animais
- Companheiro CD-1 macho e fêmea Mus musculus obter embriões tipo selvagem para estudos de perfusão.
- Para os estudos de imagem molecular, gerar Eng +/- camundongos por recombinação homóloga uti....
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Resultados
A injecção de agentes de contraste de ultra-som em embriões de ratinho ex útero é dependente do isolamento de embriões vivos, nas fases finais-gestacionais do útero e manutenção da viabilidade ao longo do curso da injecção e imagiologia de ultra-sons correspondente. Uma vez que o embrião foi exteriorizado e posicionado, como mostrado na Figura 1, a injecção do agente de contraste cuidado na vasculatura embrionária é possível. Uma imagem de ultra-som típico de modo B de um embrião de rato E17.5 .......
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Discussão
Agentes de contraste de ultra-som foram injetadas em embriões em estágio final de gestação do mouse e imagens de contraste não-lineares foram adquiridos para medir parâmetros de perfusão e direcionados microbolhas vinculativo. Imagiologia bem sucedida de microbolhas no seio da vasculatura embrionária era dependente de uma série de factores, a primeira sendo a viabilidade do embrião. Todos os equipamentos e aparelhos foram preparados com antecedência, a fim de minimizar o tempo necessário para o isolamento de embriões a .......
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Divulgações
F.S. Foster reconhece seu papel como consultor da VisualSonics Inc.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Terry Fox do Instituto Nacional do Câncer do Canadá.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Anticorpos (biotinilado, eBioscience) — A escolha do anticorpo depende do experimento | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | Esta combinação de anticorpo/microbolhas é frequentemente necessária como controle experimental |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| Rato biotinilado MJ 7/18 anticorpo para endoglina | de camundongo Em hibridoma | Anticorpos externos também podem ser apropriados: nós usamos eBioscience (13-1051-85) no passado | |
| Água | |||
| Meio embrionário | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | lote # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 ml, 1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 ml, 10.000 unidades Pen., 10.000 &# 956; g Etanol estreptocócico |
| , 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldeído | Sigma | 76240 | 4% |
| Solução salina tamponada com fosfato [1x] | Sigma | D8537 | 1x, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio |
| Camundongo prenhe, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| Cloreto de sódio a 0,9% (solução salina) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Agente de contraste de ultrassom, micromarcador pronto e não direcionado; | VisualSonics Inc. | ||
| Gel de ultrassom (Aquasonic 100, incolor) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Placas de cultura de células (4) : 100 x 20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Placas de Cultura de Células (12) : 60 x 15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrífuga | Sorvall Legend RT | ||
| Tubos cónicos, 50 ml BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluente | Beckman Coulter | Isoton II Diluente, 8448011 | |
| Tesoura de dissecção (Wagner) | Ferramentas de ciências plásticas | Wagner 14068-12 | |
| Fórceps (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm) | Ferramentas de ciências fiais | 11200-33 | |
| Fórceps, lasca | VWR | 25601-134 | |
| Copo de vidro, 2 L (Copo de Grifo) | VWR | 89000-216 | |
| Capilares de vidro, 1 x 90 mm GD-1 com filamento | Narishige | GD-1 | |
| Extrator de agulha de vidro | Narishige | PN-30 | |
| Luvas | Ansell | 4002 | |
| Sonda de anatomia bruta | Ferramentas de Fine Science | 10088-15 | |
| Placa quente | VWR | 89090-994 | |
| Balde de gelo | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imagem Plataforma | VisualSonics Inc. | de Trilho Integrado | |
| Fonte de luz, fibra óptica | Fisher Scientific | 12-562-36 | Idealmente tem braços ajustáveis |
| Luers (12), polipropileno fêmea farpado ¼-28 Rosca UNF | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Sistema de micro-ultrassom, alta frequência | VisualSonics Inc. | Agulhas Vevo2100 | |
| , calibre 21 (1") | VWR | 305165 | |
| Analisador de tamanho de partículas | Beckman Coulter Multisizer | 3 relha Contador | |
| Colher perfurada (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pinos (6), minúcia anodizada preta 0,15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipetadores [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1.000 μ l] | Eppendorf | Research Plus 3120000038 ajustável; 3120000054; | |
| Pontas de pipetador [2-200 μ l, 50-1.000 μ l] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; | |
| Tesoura | |||
| Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone | Dow Corning | ||
| Tubing, Laboratório Tygon 1/32" x 3/32" | VWR | 63010-007 | |
| Aplicador de madeira em bastão (cotonete, cabeça de algodão) | VWR | CA89031-270 | |
| Microscópio cirúrgico Ampliação de 5-8X | Fisher Scientific | Steromaster | |
| , 1 ml Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Seringas (10), 30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| Bomba de infusão de seringas | Bio-lince | Termômetro NE-1000 | |
| , -20-110 ° C | VWR | 89095-598 | |
| Temporizador | VWR | 33501-418 | |
| Tubos, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Suportes para tubos (3) | VWR | 82024-462 | |
| Transdutor de ultrassom, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tübingen, inclinado para cima | Ferramentas de Belas Ciências | 15005-08 | |
Referências
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
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Reimpressões e permissões
