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Artigo de método

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

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DOI:

10.3791/52520

⸱

4 de março de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para injetar agentes de contraste de microbolhas de ultra-som de estar, isoladas de fim de gestação de embriões palco murino. Este método permite o estudo de parâmetros de perfusão e de marcadores moleculares vasculares dentro do embrião usando de alta freqüência ultra-sonografia com contraste.

Resumo

A imagem com contraste de ultrassom pode transmitir informações quantitativas essenciais sobre a vascularização e perfusão tecidual e, em aplicações direcionadas, facilitar a detecção e medição de biomarcadores vasculares em nível molecular. Dentro do embrião de camundongo, essa técnica não invasiva pode ser usada para descobrir mecanismos básicos subjacentes ao desenvolvimento vascular no sistema circulatório inicial do camundongo e em modelos genéticos de doenças cardiovasculares. O embrião de camundongo também se apresenta como um excelente modelo para estudar a adesão de microbolhas a alvos angiogênicos (incluindo o receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) ou αvβ3) e para avaliar a natureza quantitativa do ultrassom molecular. Portanto, desenvolvemos um método para introduzir agentes de contraste de ultrassom na vasculatura de embriões vivos e isolados. Isso permite liberdade em termos de controle e posicionamento da injeção, reprodutibilidade do plano de imagem sem obstrução e movimento e análise e quantificação simplificadas da imagem. Embriões murinos em estágio gestacional tardio (dia embrionário (E)16.6 e E17.5) foram isolados do útero, suavemente exteriorizados do saco vitelino e agentes de contraste de microbolhas foram injetados em veias acessíveis na superfície coriônica do disco placentário. A imagem de ultrassom de contraste não linear foi então empregada para coletar uma série de parâmetros básicos de perfusão (aumento de pico, taxa de lavagem e tempo para o pico) e quantificar a ligação de microbolhas direcionada em um modelo de camundongo endoglin. Mostramos a circulação bem-sucedida de microbolhas dentro de embriões vivos e a utilidade dessa abordagem na caracterização da vasculatura embrionária e do comportamento das microbolhas.

Introdução

Ultra-sonografia com contraste faz uso de agentes de contraste de microbolhas para visualizar e caracterizar o ambiente vascular. Estes agentes permitir a avaliação não invasiva da microcirculação, vascularização e função cardiovascular. Além disso, a modificação da superfície da bolha pode resultar em microbolhas de ligação orientada para biomarcadores endoteliais, como demonstrado em aplicações pré-clínicos de angiogénese, a aterosclerose e a inflamação 1,2 fazendo imagiologia de ultra-sons molecular de eventos vasculares possíveis. Com aumento de contraste de ultra-sons pode, portanto, ser usadas para identificar os ambientes complexos e diversos que influenciam estados vasculares saudáveis ​​e doentes 3-5.

No número últimos anos, o interesse pelo utilitário de imagem de microbolhas se estendeu para o modelo do rato embrião versátil. Como um modelo de desenvolvimento de mamíferos, introdução de microbolhas para a vasculatura embrionária aumenta fisiológicoestudo do sistema circulatório em desenvolvimento (por exemplo, o fluxo de sangue, o débito cardíaco) e nos casos de transgénicos e modelos de ratos mutantes alvo de doença cardíaca 6,7, pode produzir insights sobre como os fatores genéticos que alteram a função cardiovascular. De fato, análises 2D quantitativa e qualitativa da vasculatura cerebral embrionária já foram atingidos 8. Além disso, o embrião de rato apresenta-se como um excelente modelo para examinar a ligação de microbolhas orientadas para marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. 9, por exemplo, introduziram microbolhas avidina em embrião ventrículos cardíacas para avaliação alvejado obrigatório em embriões transgênicos BIOTAG-Bira e examinar a anatomia vascular. A geração de modelos de heterozigotos e homozigotos do mouse pode ser também ser utilizado como um substituto para estudos de modelos tumor com o objetivo de definir a natureza quantitativa de ultra-som molecular - uma referência importante na tradução dessa técnica para a clínica.

Microbubbles são mais frequentemente introduzidas para a circulação embrionária através de injeções intra-cardíaco em embriões únicos expostos através de uma laparotomia 8-10. Em injeções útero, no entanto, enfrentam uma série de desafios. Estes incluem orientação injeção, a necessidade de combater o movimento na mãe e embrião exteriorizada, a manutenção da viabilidade hemodinâmico na mãe e embriões exteriorizados, abordando os efeitos a longo prazo da anestesia e complicações devido ao sangramento 11. Portanto, o objetivo da investigação foi desenvolver uma técnica para a injeção de microbolhas em isolado de vida em estágio final de embriões 12. Esta opção oferece mais liberdade em termos de controle de injeção e posicionamento, reprodutibilidade do plano de imagem, sem obstrução, e análise de imagem simplificada e quantificação.

No presente estudo, descrevemos um novo procedimento para a injeção de microbolhas em que vivem embriões murinos for o objectivo de estudar o comportamento cinético de microbolhas e de estudar a ligação a marcadores de superfície endoteliais endógenas microbolhas alvejado. Ultra-sonografia específico contraste não-linear é usado para medir de uma série de parâmetros de perfusão básicas, incluindo intensificação de pico (PE), lave-in taxa e tempo de pico (TTP) em embriões E17.5 isoladas. Nós também demonstrar a validade do modelo de embrião para avaliar a natureza quantitativa de ultra-som molecular em uma perda endoglin embrionário de rato modelo função transgênica, onde endoglin é um alvo clinicamente relevante devido à sua elevada expressão em células endoteliais vasculares em locais de angiogênese ativo 13 . A adesão de (MB E), segmentada por endoglin isótipo rato IgG 2 controle (MB C) e não segmentados (MB U) microbolhas é avaliada em endoglin heterozigotos (Eng +/-) e endoglin homozigoto (Eng + / +) expressando embriões. Análise do bindi alvejadong revela que o ultrassom molecular é capaz de diferenciar entre os genótipos endoglina e relacionando densidade do receptor de ultra-som para níveis moleculares quantificáveis.

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Protocolo

NOTA: Os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê do Animal Care Research Institute Sunnybrook (Toronto, Ontário, Canadá). Os procedimentos para o tratamento humano dos animais devem ser observados em todos os momentos. Supõe-se que o investigador é treinado no funcionamento básico de um sistema de ultra-sonografia. Este protocolo funciona melhor com duas pessoas.

1. Modelos Animais

  1. Companheiro CD-1 macho e fêmea Mus musculus obter embriões tipo selvagem para estudos de perfusão.
  2. Para os estudos de imagem molecular, gerar Eng +/- camundongos por recombinação homóloga utilizando células-tronco embrionárias de 129 origem / Ola como descrito por Bourdeau et al. 14.
    1. Camundongos Retrocruzamento B6- Eng +/-, gentilmente adquiridos a partir Dr. Michelle Letarte, para o CD-1 de fundo. Uso Eng +/- CD-1 embriões retrocruzadas, bem como a sua Eng + / + co ninhadantrols. Companheiro os ratos para produzir embriões encenadas.

2. Experimental Preparação

  1. Iniciado o acasalamento dos ratos e verifique as fichas diariamente. Dia embrionário 0,5 é definida como o meio-dia do dia de um tampão vaginal é observada.
  2. Prepare meios embrião pela adição de 50 ml de soro bovino fetal, 5 ml de HEPES 1 M e 5 ml de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de penicilina, 10.000 ug de estreptomicina) a 500 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose (4500 mg / L). Enrole a garrafa em tiras e manter refrigerado a 4 ° C.
  3. Centrifugar gel de ultra-som claro em 50 ml em tubos cónicos de 140 xg durante 20 min. Desenhe gel-se em 30 ml seringas. Preencha adicionais (marcadas) 30 ml seringas com tampão fosfato salino (PBS) e reserve. Uma ninhada de embriões normalmente exigirá entre 2-3 seringas de gel de ultra-som e 4 seringas de PBS.
  4. Puxe cerca de 30 agulhas de vidro e gentilmente apertar a uma tira de plasticinaem um 100 x 20 mm de cultura de células prato. Isto assegura que as agulhas são separadas e seguro durante o manuseamento. Utilizando um extrator de vidro, use as seguintes configurações em 1 x 90 mm capilares de vidro com filamento: Aquecedor 77, Sub 55 ímã, ímã Principal 70.
  5. Preparar 10-12 placas de dissecção (o suficiente para assegurar que cada embrião dentro de uma ninhada irá receber a sua própria antena), usando uma proporção de 1: 8 do volume do agente de cura à base. Verter 40 ml de base de dentro de um tubo cónico de 50 ml. Adicionar 5-6 ml agente de cura e mexa com vara de madeira.
    1. Despeje em 60 x 15 mm pratos de cultura, enchendo cada um para cerca de metade. Deixe repousar O / N para definir.
  6. Anexar luers femininos para 400 mm de comprimento pedaços de cloreto de polivinila (PVC) tubo (diâmetro interno: 0,79 mm). A tubulação deve chegar a partir da bomba de seringa para o ultra-som estágio confortavelmente.

3. Experimental Set-up

  1. Arrume a plataforma de imagem sob o microscópio cirúrgico com um motor 3D e matriz linear 21 MHtransdutor z.
    1. Orientar a plataforma de modo a que o carril de montagem é do lado esquerdo, com a fase posicionada directamente por baixo do microscópio.
    2. Anexe o motor 3D à rótula do braço que se estende da plataforma. Parafuso do pós liberação rápida da braçadeira transdutor na liberação rápida montagem do motor, de frente para a frente, e posicionar a cabeça de transdutor na braçadeira, a fixação da trava.
    3. Fixar o conector do transdutor na porta activa no painel frontal do carrinho. Ligue o equipamento.
  2. Iniciado o transdutor de ultra-som de 21 MHz, selecionando a opção 'cardiologia' para estudos de imagem molecular, e "geral" para estudos de perfusão. Deslocar todos os sliders tempo-ganho em compensação para a posição central exata. Para 'Modo de Contraste ", defina os seguintes parâmetros: frequência: 18 MHz, potência de transmissão: 4%, (0,39 MPa), Contraste Ganho: 30 dB, Focos: 6 e 10 mm, Contraste Mode: Nonlinear, tempo de rajada: 100% a 0,1sec, Feixe width: Ampla.
  3. Alíquota de 40 ml de meio de embrião de cada um em quatro tubos de 50 ml cônico. Coloque no gelo.
  4. Aquecer 1 L de água num copo de 2 L sobre uma placa quente. Manter a 45 ° C. Adicionar uma seringa de gel de ultra-som e PBS para o copo para pré-aquecer. Manter esta temperatura por monitorização com um termómetro em todos os momentos.
  5. Separe 10-12 seringas de 1 ml e 10-12 agulhas 21 G para a injecção de microbolhas.

4. Procedimento Cirúrgico

NOTA: Tenha um assistente preparar as bolhas (Fase 5), enquanto o cirurgião inicia o procedimento cirúrgico. O protocolo descrito aqui foi adaptado a partir Whiteley et al 15.

  1. Recolha E16.5 ou E17.5 embriões de rato fêmea grávida seguintes luxação cervical.
    NOTA: Os efeitos da anestesia sobre embriões ainda não foram estudados em detalhe 16. Métodos adicionais, incluindo a decapitação, pode ser apropriado opções para o sacrifício dos camundongos grávidas.
    1. Cortar abrir o abdômen para revelar o útero e embriões. Cuidadosamente e remover rapidamente o útero por corte as pontas dos cornos uterinos (cortando os vasos do ovário e uterino) e rompendo a vagina e bexiga.
    2. Usando fórceps lasca, transferir o útero para um tubo de 40 ml de meio de embrião gelada, tão rapidamente quanto possível, sem danificar os embriões. Descarte a carcaça mouse.
  2. Mudar para microscópio e palco. Deposite o útero em um 100 x 20 mm de cultura de células prato. Transferir o útero para nova placa cheia com 50 ml de meio fresco embrião.
  3. Usando esterilizado (70% de pulverização etanol) uma pinça fina, suavemente rasgar e puxar para fora as membranas externas do útero a partir de uma extremidade. Expor a decídua placentária, parietal saco vitelino e membrana de Reichert para separar e remover do saco vitelino visceral subjacente.
  4. Dissecar os embriões, um por um, mantendo a y visceralsacos olk intactas e manipulação da placenta o mais suavemente possível 17. Tome cuidado para evitar a ruptura do saco vitelino como os embriões saem imediatamente.
    1. Utilizar a colher perfurada para mover os embriões para um outro prato mantidas em gelo com meios frescos embrião. Mantenha os embriões refrigerados até que seja necessário. Troque a mídia no prato embrião cada 1-1,5 horas. Com estas condições embriões são viáveis ​​por até 4 horas após a dissecação.

5. Preparação de microbolhas

NOTA: Execute imagem molecular com ultra-som usando as duas microbolhas direcionados e não direcionados. A única experiência pode exigir até 3 frascos separados de microbolhas: microbolhas i) de anticorpos direcionados microbolhas, ii) anticorpo controle isótipo direcionadas e iii) microbolhas não segmentados. O agente de contraste vem como um pó seco por congelação e deve ser reconstituído com solução salina antes da injecção. Existem 2 x 10 ~ 9 microbolhas em cada microb untargetedubble frasco e 8,8 x 10 ~ 8 microbolhas nos frascos prontos alvo. As microbolhas são estáveis ​​por até 3 horas após a reconstituição.

  1. Reconstituição do alvo Pronto Frascos
    NOTA: Os exemplos de alvo preparativos prontos: endoglina microbolhas específicas (MB E, com rato biotinilado MJ 18/07 anticorpo para rato endoglin; em casa facilidade hibridoma); vascular receptor do fator de crescimento endotelial 2 (VEGFR2) microbolhas direcionados (MB V, com anti-rato CD309 biotina); isótipo rato de anticorpos IgG de controlo 2 microbolhas direcionados (MB C, biotina rato isótipo IgG 2 controle visando rato IgG2a).
    1. Dilui-se a solução de anticorpo (20 ug) em 1 ml (volume final) de uma solução salina. Mantenha no gelo.
    2. Encher a seringa com 1 ml de solução salina, a remoção de todas as bolhas de ar. Anexando uma agulha G 21, injectar a solução lentamente para dentro do frasco de microbolhas.
    3. Retire lentamente o êmbolo, a remoção de 1 ml de ar, e retirar a agulha. Suavementeagitar. Deixe repousar 5 min no gelo.
      NOTA: microbolhas de ultra-som pode ser destruído em ambientes de alta pressão.
    4. Após o tempo decorrido, preencher uma nova seringa com a diluição de anticorpo e adicionar ao frasco apropriado. Agite suavemente. Deixe a mistura (agora 2 mL) repousar durante 10 min. Mantenha no gelo. Assumindo conjugação superfície completa, o número médio de ligando ligado para as microbolhas é de aproximadamente 18 7600 ligantes / mm 2.
  2. Reconstituição de untargeted Frascos
    1. Encher a seringa com 1 ml de solução salina, a remoção de todas as bolhas de ar. Anexando uma agulha G 21, injectar a solução lentamente para dentro do frasco de microbolhas.
    2. Retire lentamente o êmbolo, a remoção de 1 ml de ar, e retirar a agulha. Agite suavemente. Deixe repousar 5 min. Adicionar 1 ml de uma solução salina adicional, tal como descrito acima. Agite suavemente e deixe descansar por 10 min no gelo.
  3. Coulter Counting
    1. Agite suavemente o frasco de microbolhas desejado e desenhar ~50 ul da solução numa seringa de 1 ml com a agulha 21 G. Injectar as microbolhas num vazio 2 ml tubo de microcentrífuga.
    2. Pipetar uma amostra de 10 ul de solução de estoque de microbolhas em 10 ml de diluente.
    3. Após mistura suave, avaliar as distribuições de concentração e tamanho da população de microbolhas usando contagem Coulter (veja a lista de materiais). Contagem de um mínimo de três medições de 50 ul (por frasco de amostra), utilizando uma abertura de 30 um.
  4. Microbubbles se preparando para Injeção
    NOTA: O assistente executa este passo quando 'Injecção de microbolhas em Embriões' (passo 6) é iniciada. Cada embrião é injectado uma vez, com o tipo de microbolha escolhida para cada injecção para ser seleccionado aleatoriamente pelo assistente de modo a que todos os tipos de microbolhas estão uniformemente distribuídas em todo o processo, mas dada em uma ordem aleatória. Verifique se o cirurgião é cego para o tipo de bolha que está sendo injetado.
    1. Determine the volume de solução de estoque de bolhas necessárias para produzir uma concentração final de 1 x 10 8 MB ​​/ ml num volume de 400 ul (calcular o volume usando as concentrações banco medidos em 5.3.3). Alíquota o volume correspondente de solução salina para um tubo de microcentrifugadora vazio.
    2. Agitar suavemente o frasco para injectáveis ​​de microbolhas seleccionado e desenhar um volume em excesso (~ 50 ul maior do que a calculada acima) da solução numa seringa de 1 ml com a agulha 21 G. Injectar as microbolhas para um tubo de microcentrífuga vazio.
    3. Pipete o volume necessário de uma solução de estoque de microbolhas e adicionar à alíquota de solução salina. Misturar agitando suavemente com a ponta da pipeta.
    4. Aspirar a solução de microbolhas diluído em uma seringa limpa utilizando a agulha de 21 G. Retirar a agulha, eliminar todas as bolhas de ar da seringa e anexar o luer e tubos. Lentamente empurre a solução para o fim da tomada de tubulação certeza de não gerar bolhas de ar.
    5. Insira o Syringe numa bomba de infusão de seringa definido para dispensar as microbolhas a uma taxa de 20 ul / min para um volume total de 20 ul. Coloque uma agulha de vidro puxado para a extremidade da tubagem. Mova a bomba perto do palco injeção.

6. Injecção de microbolhas em Embriões

  1. Aleatoriamente selecionar e remover (com colher perfurada) um embrião a partir do prato media gelada. Colocar no prato de dissecação localizada na fase de ultra-sons sob a estereoscópio e remover o saco vitelino e da membrana amniótica, com a pinça fina, cortar / rasgar a partir do lado que aparece menos vascularizado (o lado antimesometrial). Isso é mais facilmente alcançado por perfuração uma área adjacente à região da cabeça.
    1. Cortar o suficiente para remover o embrião dentro, mas não mais. Estabilizar os pratos de dissecação usando pequenos pedaços de plasticina.
  2. Manobrar suavemente o saco de todo o embrião. Posição do embrião no seu lado, e com a placentavasos umbilicais na frente. Usando os pinos de insetos, fechar o saco vitelino (4 pinos recomendado) e bordas da placenta como necessário para fixar no lugar. Evite grandes vasos.
  3. Lavar o embrião com pré-aquecido a 45 ° C até que o embrião PBS revives. Identifique a veia umbilical e sua rede vascular associada. Posicionar o prato de modo a que a injecção pode ser efectuada de forma confortável.
    NOTA: Depois de aquecida, o sangue no embrião começará a fluir, visivelmente bombeamento na artéria umbilical. Quando o fluxo começa em primeiro lugar, as veias será um vermelho brilhante, com o sangue em ambos os vasos rapidamente aparecendo idênticos. Os ramos resultantes da veia umbilical geralmente sobrepor os da artéria umbilical na superfície da placenta.
  4. Uma vez que o embrião tem reavivado, cobri-lo (mas não a placenta) com gel US pré-aquecido, tendo a certeza de remover delicadamente as bolhas de ar (usando a pinça fina) de todo o embrião. Encha o prato com pré-aquecido PBS.
    NOTA: Fique de olho no nível de solutiem nas seringas PBS e gel e adicionar seringas de backup para o copo de aquecimento, conforme necessário.
  5. Montar a agulha de vidro sobre uma grande bola de plasticina na borda do prato de dissecação e inserir a agulha no final de PBS. Escolhendo uma veia na superfície coriônica do disco placentário, na medida do ramo principal como razoável, aparar a ponta com o tamanho com uma tesoura. A injeção é mais fácil se a ponta é cortada com uma ligeira inclinação. Remova todas as bordas recortadas do vidro usando a ponta da tesoura primavera.
  6. Usando a bomba da seringa, injectar-se lentamente a solução de microbolhas a 20 ul / min para dentro da agulha de vidro até que todo o ar é expelido a partir da ponta da agulha e as microbolhas pode ser visto a fluir livremente para dentro do PBS. Pare a bomba e redefinir para um volume de injeção de 20 l. Não permitir a entrada de ar do sistema vascular do embrião durante a injeção.
  7. Insira a ponta da agulha de vidro suavemente em uma das veias na placenta e garantir que ele é imóvel. Rebater o stereoscope cabeça ea posição do transdutor acima do embrião. Iniciado imagem.

7. Ultrasound Molecular Imaging

NOTA: Utilizando as condições de imagem não-lineares contraste definidos anteriormente, posicione o transdutor para que o embrião está situado igualmente entre os focos em 6 e 10 mm. Uma vez posicionado, iniciar a injecção de bolus das microbolhas. Quando a injecção estiver concluída, iniciar o temporizador.

  1. Perfusão Imagem
    1. Certifique-se que o número máximo de quadros para o modo de contraste não-linear é selecionado pressionando o botão "gestão estudo" e clicar na aba "Preferências", na parte superior do navegador do estudo. Marque a caixa apropriada na janela "Preferências".
    2. Ajuste as configurações de imagem, iniciando imagem não-linear. Pressione o botão 'modo de contraste' no painel de controle. Limitar o ganho 2D, ajustando o "ganho & #8217; discar para 30 dB, reduzir o poder de 4% utilizando o 'poder' dial, diminuir a frequência de 1 Hz usando o 'frequência' marcar e definir a largura de feixe (canto inferior esquerdo) para ampla usando a esfera / mouse.
      NOTA: Todos os controles estão localizados no painel de controle do sistema de ultra-som.
    3. Capture a todo lavagem-in e dissipação do bolo de microbolhas gravando um loop cine 20 minutos a uma taxa de quadros de 1 Hz. Imprensa varredura / freeze para iniciar a aquisição de dados.
    4. Uma vez que a sequência completa das imagens foi capturado, pressione o botão 'loja cine' localizado no painel de controle para salvar a seqüência de imagens no buffer do sistema. O sistema cria um loop de cine-carimbada data de os dados do modelo de contraste não-lineares adquiridos.
  2. Targeted microbolhas de imagem
    1. Em "Preferências", defina o tempo de rajada para 0,1 seg. Defina os parâmetros de imagem apropriados usando os controles descrita acima (7.1.2.).
    2. Iniciado imagiologia de contraste não-linear, pressionando o botão "modo de contraste 'no painel de controle. Certifique-se de que o embrião é adequadamente situado sob o transdutor e que o fluxo de agente de contraste de microbolhas por meio do embrião é visível na imagem modo de contraste não-linear.
    3. Para avaliar obrigatório durante os estudos de imagem molecular embrionárias microbolhas alvejado, permitir que as microbolhas a circular sem ser perturbado por 3 min e 40 seg após o término da injeção. Desta vez é o de permitir a retenção das microbolhas circulantes. Prima 'varredura / freeze' para deter imagem durante este tempo.
    4. Às 3 min e 40 seg, imagiologia currículo para confirmar que o embrião é ainda visível, é adequadamente cobertas com PBS, e que as microbolhas continuam a circular. Prima 'varredura / freeze' para iniciar imagem.
    5. Adquirir a sequência de interrupção / reabastecimento em 3 min e 50 seg após a injecção através da gravação de um "pré-destrucseqüência resposta acústica ção 'at 29 Hz. Prima 'varredura / freeze' para iniciar a aquisição de dados. Às 4 min após a injeção 18,19, iniciar uma explosão acústica de alta freqüência de 0,1 seg. Pressione o botão 'explosão' para implementar uma explosão.
    6. Continue a gravar quadros para o restante da sequência (até a linha de buffer está cheio) e salvar o loop cine pressionando 'loja de cine ".
    7. Recolha um loop cine adicional de microbolhas de circulação. Esta sequência de imagens subseqüente 'pós-destruição "é assumido para conter sinais de bolha só circulam que reabastecido o feixe. Prima 'varredura / freeze' para iniciar imaging e 'loja de cine' para coletar as imagens.
    8. Rotular os laços cine após imaginando cada embrião. Pressione "gestão estudo ', realce o arquivo usando a esfera eo' selecionar ', pressione o botão' label imagem" eo nome de forma adequada.

8. Manuseamento de embriões após a injeção

  1. Imagiologia pós, mover o transdutor, desprender o embrião e a eutanásia (via decapitação, deslocamento cervical, asfixia com dióxido de carbono, ou de anestesia seguida de congelamento ou de fixação rápida) como desejado.
  2. Para cada injeção subseqüente embrião uma dissecção prato, agulha, seringa e tubulação segmento fresco deve ser utilizado, com a preparação do próximo lote de injeção de microbolhas solução a ter lugar durante a dissecção e avivamento.
  3. Guardar as amostras de tecido (por exemplo, cauda, ​​cerebrais) para análises adicionais (por exemplo, a genotipagem determinado por análise de PCR de DNA de cauda isolado, coloração lacZ, ou medidas semi-quantitativas de expressão biomarcador utilizando Western blots 21).

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Resultados

A injecção de agentes de contraste de ultra-som em embriões de ratinho ex útero é dependente do isolamento de embriões vivos, nas fases finais-gestacionais do útero e manutenção da viabilidade ao longo do curso da injecção e imagiologia de ultra-sons correspondente. Uma vez que o embrião foi exteriorizado e posicionado, como mostrado na Figura 1, a injecção do agente de contraste cuidado na vasculatura embrionária é possível. Uma imagem de ultra-som típico de modo B de um embrião de rato E17.5 ...

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Discussão

Agentes de contraste de ultra-som foram injetadas em embriões em estágio final de gestação do mouse e imagens de contraste não-lineares foram adquiridos para medir parâmetros de perfusão e direcionados microbolhas vinculativo. Imagiologia bem sucedida de microbolhas no seio da vasculatura embrionária era dependente de uma série de factores, a primeira sendo a viabilidade do embrião. Todos os equipamentos e aparelhos foram preparados com antecedência, a fim de minimizar o tempo necessário para o isolamento de embriões a ...

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Divulgações

F.S. Foster reconhece seu papel como consultor da VisualSonics Inc.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Terry Fox do Instituto Nacional do Câncer do Canadá.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
Anticorpos (biotinilado, eBioscience) — A escolha do anticorpo depende do experimento
  • rat isotipo IgG2 controle
eBioscience13-4321-85Esta combinação de anticorpo/microbolhas é frequentemente necessária como controle experimental 
  • biotina anti-camundongo CD309< / li>< / ul>
eBioscience13-5821-85
Rato biotinilado MJ 7/18 anticorpo para endoglinade camundongo Em hibridomaAnticorpos externos também podem ser apropriados: nós  usamos eBioscience (13-1051-85) no passado
Água
Meio embrionário
  • 500 ml Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio com glicose alta
SigmaD5796
  • 50 ml Soro Fetal Bovino
ATCC30-2020lote # 7592456
  • Hepes< / li>< / ul>
Gibco156305 ml, 1 M
  • Penicilina-estreptomicina< / li>< / ul>
Gibco15140-1225 ml, 10.000 unidades Pen., 10.000 &# 956; g Etanol estreptocócico
, 70%
Ice
ParaformaldeídoSigma762404%
Solução salina tamponada com fosfato [1x] SigmaD85371x, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio
Camundongo prenhe, CD-1Charles River Laboratories Inc. 
Cloreto de sódio a 0,9% (solução salina)Hospira0409-7984-11
Agente de contraste de ultrassom, micromarcador pronto e não direcionado; VisualSonics Inc.
Gel de ultrassom (Aquasonic 100, incolor)CSP Medical133-1009
Equipment
Placas de cultura de células (4) :  100  x  20  mmFisher Scientific08-772-22
Placas de Cultura de Células (12) : 60  x  15  mmSigmaD8054
CentrífugaSorvall Legend RT 
Tubos cónicos, 50 ml BD FalconVWR21008-938
DiluenteBeckman CoulterIsoton II Diluente, 8448011
Tesoura de dissecção (Wagner)Ferramentas de ciências plásticasWagner 14068-12
Fórceps (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)Ferramentas de ciências fiais11200-33
Fórceps, lascaVWR25601-134
Copo de vidro, 2 L (Copo de Grifo)VWR89000-216
Capilares de vidro, 1 x 90  mm GD-1 com filamentoNarishigeGD-1
Extrator de agulha de vidroNarishigePN-30
LuvasAnsell4002
Sonda de anatomia brutaFerramentas de Fine Science10088-15
Placa quenteVWR89090-994
Balde de geloCole ParmerRK 06274-01
Imagem PlataformaVisualSonics Inc.de Trilho Integrado
Fonte de luz, fibra ópticaFisher Scientific12-562-36Idealmente tem braços ajustáveis
Luers (12), polipropileno fêmea farpado ¼-28 Rosca UNFCole Parmer45500-30
Sistema de micro-ultrassom, alta frequênciaVisualSonics Inc.Agulhas Vevo2100
, calibre 21 (1")VWR305165
Analisador de tamanho de partículasBeckman Coulter Multisizer3 relha Contador
Colher perfurada (Moria)Fine Science ToolsMC 17 10373-17
Pinos (6), minúcia anodizada preta 0,15 mmFine Science Tools26002-15
Pipetadores [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1.000 μ l]EppendorfResearch Plus  3120000038 ajustável;             3120000054;            
Pontas de pipetador [2-200  μ l, 50-1.000  μ l]EppendorfepT.I.P.S.                                    22491334;                        
Tesoura
Sylgard 184 Kit de Elastômero de SiliconeDow Corning
Tubing, Laboratório Tygon 1/32" x 3/32"VWR63010-007
Aplicador de madeira em bastão (cotonete, cabeça de algodão)VWRCA89031-270
Microscópio cirúrgico Ampliação de 5-8XFisher ScientificSteromaster
, 1 ml NormjectFisher14-817-25
Seringas (10), 30 mlVWRCA64000-041
Bomba de infusão de seringas Bio-lince Termômetro NE-1000
, -20-110  ° CVWR89095-598
TemporizadorVWR33501-418
Tubos, EppendorfVWR20170-577
Suportes para tubos (3)VWR82024-462
Transdutor de ultrassom, 20 MHzVisualSonics Inc.MS250
Vannas-Tübingen, inclinado para cimaFerramentas de Belas Ciências15005-08
interno destiladaSistema 3120000062022491351 Seringas

Referências

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