Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.
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Artigo de método
Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estruturas de cripta-vilosidades intestinais denominadas organoides, podem ser mantidas em cultura sustentada tridimensionalmente quando suplementadas com os fatores de crescimento apropriados. Como os organoides são altamente semelhantes ao tecido original em termos de diferenciação de células-tronco homeostáticas, polaridade celular e presença de todos os tipos de células terminalmente diferenciadas conhecidas pelo epitélio intestinal adulto, eles servem como um recurso essencial na pesquisa experimental sobre o epitélio. A possibilidade de expressar transgenes ou RNA interferente usando vetores lentivirais ou retrovirais em organoides aumentou as oportunidades de análise funcional do epitélio intestinal e das células-tronco intestinais, superando os transgênicos tradicionais de camundongos em velocidade e custo. No protocolo de vídeo atual, mostramos como utilizar a transdução de organoides do intestino delgado com vetores lentivirais ilustrados pelo uso de transgenes induzíveis por doxicilina ou RNA de grampo curto induzível por IPTG para superexpressão ou knockdown de genes. Além disso, considerando que a cultura de organoides produz contagens de células minúsculas que podem até ser reduzidas pelo tratamento experimental, explicamos como processar organoides para análise a jusante visando RT-PCR quantitativo, microarray de RNA e imuno-histoquímica. Técnicas que permitem a expressão de transgenes e knock down de genes em organoides intestinais contribuem para o potencial de pesquisa que essas estruturas epiteliais intestinais possuem, estabelecendo a cultura de organoides como um novo padrão em cultura de células.
Introdução
O epitélio intestinal é um dos tecidos corporais mais proliferam rapidamente, o que fez com que ele atrair grande interesse da pesquisa sobre as células cancerosas e tronco. Em 2009, uma técnica foi publicado para gerar culturas de longa duração de pequenas criptas intestinais em matrigel, conservando uma estrutura dimensional 3 1. Estas estruturas, denominado Organóides intestinal, pode ser cultivado usando técnicas convencionais, com áreas meio suplementado com um número de factores de crescimento definidas, incluindo a BMP-inibidor da via de sinalização noggin (nog), o intensificador de via de sinalização Wnt-1 rspondin (RSPO1) e factor de crescimento e....
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Protocolo
1. Preparação de polietilenimina (PEI) como Reagente de Transfecção
- Dissolve-se cerca de 150 mg de PEI em 100 ml de H 2 O.
- Ajuste a solução para pH 7,4 pela adição de HCl até que a solução torna-se clara e mexa até dissolver completamente. Isto pode levar entre 10 e 60 min e adicionar água a uma concentração final de 1 mg / ml.
- Quando clara, filtrar a solução PEI através estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um freezer -80 ° C em alíquotas de 5 ml.
2. Produção de Lentivirus Particles
Dia 1:
- Células HEK293T Dividir a 60% -80% de confluência em 162
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Resultados
Transdução lentiviral organóide
A técnica de transdução organóide utilizando partículas de lentivírus depende manipulação correta de Organóides antes e durante a transdução. Organóides (Figura 3A) foram cultivadas e foram interrompidas em criptas individuais (Figura 3B). Como relatado anteriormente, estes criptas individuais, quando cultivadas na presença do inibidor de GSK3 Chir99021 tornou criptas císticas 9 (Figura 3C).
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Discussão
O protocolo de vídeo actual descreve transdução lentiviral de Organóides de epitélio intestinal primária e análise a jusante destas Organóides RNA utilizando técnicas quantitativas e imuno-histoquímica.
Transdução de lentivírus é freqüentemente realizada em células aderentes ou flutuantes em placas de cultura. Uma vez que a estrutura tridimensional de Organóides torna difícil de penetrar por partículas virais, um número de métodos para aumentar a eficácia são utilizados. O pré-tratamento de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
J. Heijmans é apoiado por um estipendium da Fundação Holandesa do Cancro (KFW). G.R. van den Brink é apoiado por financiamento do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013)/Acordo de subvenção do Conselho Europeu de Investigação número 241344 e por uma subvenção VIDI da Organização Holandesa para a Investigação Científica (GvdB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Polietileno imina | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM meio | Lonza | BE12-614F | |
| Soro fetal de bezerro | Lonza | DE14-801F | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamina | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Avançado DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetilcisteína | Sigma | A9165-1G | |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polybrene | Sigma | 107689 | |
| nicotinamida | Sigma | N0636 | |
| Tripsina | Lonza | BE02-007E | |
| puromicina | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoetanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Sistema Ovation Pico WTA | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldeído | Sigma | 252549-1L | |
| frasco de vidro cônico 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosina Amarelada | VWR | 1.159.350.025 |
Referências
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A.
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Reimpressões e permissões
