Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

Resumo

Um protocolo é descrito para extrair células humanas primárias de tumores cirúrgicos de cólon e tecidos normais. As células isoladas são então cultivadas em substratos elásticos macios (hidrogéis de poliacrilamida) funcionalizados por uma proteína de matriz extracelular e incorporados com microesferas fluorescentes. A citometria de tração é realizada para avaliar os estresses contráteis celulares.

Resumo

As células cancerosas responder a matriz de rigidez mecânica de uma forma complexa utilizando um, hierárquica sistema coordenado mecano-química composta de receptores de adesão e as proteínas de membrana associadas a transdução de sinal, a arquitectura do citoesqueleto, motores moleculares e ^{1, 2.} Mecanosensibilidade de células cancerosas in vitro são diferentes investigou principalmente com linhas de células imortalizadas ou murino derivadas de células primárias, não com células cancerosas humanas primárias. Assim, pouco é conhecido sobre o mecanosensibilidade de células de cólon humano primários in vitro. Aqui, um protocolo optimizado é desenvolvido que descreve o isolamento de células de cólon humano primários a partir de amostras de tecidos humanos saudáveis ​​cirúrgicos e cancerosos. Células de cólon isolados são então cultivadas com sucesso em mole (2 kPa rigidez) e rígida (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida e poliestireno rígida (~ 3,6 GPa rigidez) substratos funcionalizados por uma matriz extracelular (fibronectinaneste caso). Microesferas fluorescentes são incorporados em cápsulas gelatinosas perto da superfície da cultura de células e ensaio de tracção é realizado para avaliar tensões contrãcteis celulares usando software de acesso livre e gratuito. Além disso, a microscopia de imunofluorescência em diferentes substratos de rigidez proporciona informação útil sobre a morfologia da célula primária, organização do citoesqueleto e vinculina contendo adesões focais em função da rigidez do substrato.

Introdução

Nos últimos anos tornou-se cada vez mais evidente que as micro-ambiente mecânico, além de factores bioquímicos, desempenha um papel importante na regulação funcionalidades celulares. As células podem detectar e responder à rigidez substrato sobre o qual eles são respeitadas (como em cultura 2D) ou rodeado por (como em cultura 3D) ^3-7. Ao fazer isso, as células são capazes de modular a sua diferenciação ^{3, 4} morfologia, a migração / motilidade ^5, propriedades biofísicas ^6, crescimento de ^7, e outros processos.

As células cancerosas também responder à rigidez matriz 2D e 3D utilizando, ....

Protocolo

O protocolo descrito a seguir segue as diretrizes da UIUC comitê de ética em pesquisa humana.

1. Recolha e digestão de amostra de tecido Surgical

1. Recolha da amostra de tecido do tumor após ressecção do cólon direito (Figura 1A e 1B). Recolha de tecido de um site saudável adjacente também.
2. Transferir o tecido imediatamente para um frasco de 15 ml contendo 12 ml de solução HBSS. Manter o frasco no gelo dentro de uma caixa de espuma isolante.
3. Transportar o tecido contendo frasco para uma cultura capa de tecido para posterior processamento dentro de 45 min. Manter o frasco em um bloco de gelo no int....

Resultados

O protocolo descrito acima é empregada com sucesso para várias amostras de tecido (n = 12) de quatro pacientes diferentes sob as diretrizes do conselho de revisão institucional. Figura 1A ilustra um tumor colorretal representante logo após a cirurgia a partir do qual são obtidos os cortes de tecido para culturas de células. Uma secção de tecido típico em solução de HBSS após a transferência para a capa laminar para processamento adicional é mostrado na Figura 1B. Um esquema de digestão .......

Discussão

Estresse tração celular surgiu recentemente como um potencial indicador biofísico de estado metastático ^13. No entanto, não há dados tração experimental com células tumorais primárias existe na literatura até o momento. Além disso, a cultura de células do cólon diretamente primário isoladas em diferentes géis de poliacrilamida rigidez não é relatado ainda. Por isso, nós estabelecemos um optimizados de cólon primário condições de cultura de células em géis e poliestireno (Figura 2). Microbeads.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
HBSS	Life technologies	14175-095
PBS	Lonza	17-516F
Tripsina	Worthington	LS003736
Colágeno	Worthington	LS004176
3- Aminopropiltripoxissilano (ATS)	Sigma-Aldrich	281778
Glutaraldeído	Polysciences, Inc.	01201-5
Acrilamida	Sigma-Aldrich	A4058
N-metilenobisacrilamida (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
Solução tampão HEPES	Sigma-Aldrich	83264
Persulfato de amônio	Bio-Rad	161-0700
Biociências BD	de fibronectina humana	354008
Hidrato de hidrazina	Sigma-Aldrich	18412
Ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283
Paraformaldeído	Ciências de Microscopia Eletrônica	RT15710
Intensificador de Sinal	Life technologies	I36933
Anticorpo monoclonal anti vinculina	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG	Life technologies	A11001
TRITC conjugados de faloidina	Sigma-Aldrich	P1951
0.1 µ m grânulos fluroscentes	Life technologies	F8801
0.25% Tripsina-EDTA	Life technologies	25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips	Corning	2865-12

perigoso