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Artigo de método

Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

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DOI:

10.3791/52532

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4 de junho de 2015

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1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Provena Covenant Medical Centre, 4Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign

Neste artigo

Resumo

Um protocolo é descrito para extrair células humanas primárias de tumores cirúrgicos de cólon e tecidos normais. As células isoladas são então cultivadas em substratos elásticos macios (hidrogéis de poliacrilamida) funcionalizados por uma proteína de matriz extracelular e incorporados com microesferas fluorescentes. A citometria de tração é realizada para avaliar os estresses contráteis celulares.

Resumo

As células cancerosas responder a matriz de rigidez mecânica de uma forma complexa utilizando um, hierárquica sistema coordenado mecano-química composta de receptores de adesão e as proteínas de membrana associadas a transdução de sinal, a arquitectura do citoesqueleto, motores moleculares e 1, 2. Mecanosensibilidade de células cancerosas in vitro são diferentes investigou principalmente com linhas de células imortalizadas ou murino derivadas de células primárias, não com células cancerosas humanas primárias. Assim, pouco é conhecido sobre o mecanosensibilidade de células de cólon humano primários in vitro. Aqui, um protocolo optimizado é desenvolvido que descreve o isolamento de células de cólon humano primários a partir de amostras de tecidos humanos saudáveis ​​cirúrgicos e cancerosos. Células de cólon isolados são então cultivadas com sucesso em mole (2 kPa rigidez) e rígida (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida e poliestireno rígida (~ 3,6 GPa rigidez) substratos funcionalizados por uma matriz extracelular (fibronectinaneste caso). Microesferas fluorescentes são incorporados em cápsulas gelatinosas perto da superfície da cultura de células e ensaio de tracção é realizado para avaliar tensões contrãcteis celulares usando software de acesso livre e gratuito. Além disso, a microscopia de imunofluorescência em diferentes substratos de rigidez proporciona informação útil sobre a morfologia da célula primária, organização do citoesqueleto e vinculina contendo adesões focais em função da rigidez do substrato.

Introdução

Nos últimos anos tornou-se cada vez mais evidente que as micro-ambiente mecânico, além de factores bioquímicos, desempenha um papel importante na regulação funcionalidades celulares. As células podem detectar e responder à rigidez substrato sobre o qual eles são respeitadas (como em cultura 2D) ou rodeado por (como em cultura 3D) 3-7. Ao fazer isso, as células são capazes de modular a sua diferenciação 3, 4 morfologia, a migração / motilidade 5, propriedades biofísicas 6, crescimento de 7, e outros processos.

As células cancerosas também responder à rigidez matriz 2D e 3D utilizando, uma combinação coordenado hierárquica mecano-químico de receptores de adesão e as proteínas de membrana associadas a transdução de sinal, a arquitectura do citoesqueleto, motores moleculares e 1, 2. Por exemplo, células epiteliais mamarias (MECs) formar parênquima acinar normal quando cultivadas em substratos de 150 Pa, que é semelhante à rigidezde tecido mamário saudável. Curiosamente, eles apresentam as características de um tumor em desenvolvimento, tanto estruturais como de transcrição, quando cultivadas em substratos mais rígidos (> 5000 Pa) que imitam a rigidez do estroma do tumor 8. Além disso, uma outra experiência mostra que a tumorigénese da mama é acompanhado por reticulação do colagénio e de ECM de reforço 9. Experiências recentes mostram que o carcinoma do cólon humano (HCT-8), as células exibem metástases como fenótipo (MLP), quando eles são cultivadas em substratos 2D possuindo rigidez fisiologicamente relevante (20-47 kPa), mas não em muito dura (3,6 GPa) substratos 10- 12 .Estes células aglomerados de células tumorais como primeira forma e, em seguida, dissociar-se um do outro, a partir da periferia. Como este epitelial ao arredondado morfológica (E a ​​transição R) a mudança ocorre, eles proliferam, reduzir célula-célula e célula-ECM adesão, e tornar-se migratório. HCT-8 células cultivadas em substratos de poliestireno muito duros não apresentam estestraços malignos. Assim, foi levantada a hipótese de que HCT-8 células se tornam metastático devido à sua exposição a micro-ambiente adequado. Vale a pena notar que estas experiências são realizadas com linhas celulares de cancro imortalizadas ou murino derivadas de células primárias, não com células cancerosas humanas primárias.

Um estudo recente sugere que o stress de tracção aumentada celular pode ser usada como uma potencial assinatura biofísico de células metastáticas 13 .O estudo envolve a medição de força de tracção para diferentes linhas de células cancerosas humanas em géis de poliacrilamida. Verificou-se que as células de cancro metastático pode exercer esforço de tracção significativamente maior em comparação com as células não metastáticas em todos os casos 13. No entanto, estes resultados contradizem diretamente os achados anteriormente publicados sobre murino derivadas linhas celulares de cancro da mama 14. Além disso, um estudo recente destaca as diferenças notáveis ​​entre as células humanas imortalizadas e primários na sua remodelação do citoesqueleto proprofiling tein e sobrevivência celular a expressão da proteína 15. Por isso, é importante rever muitos dos ensaios de tracção para biofísicas, incluindo células de cancro humano primárias. Isto irá resolver a questão de saber se as células primárias recapitular imortalizada linhas celulares de cancro de tração tendência.

O protocolo aqui descrito está optimizado para o isolamento de células primárias do cólon humanos (ambos saudáveis ​​e cancerosas), e para a sua cultura em substratos macios (hidrogeles de poliacrilamida), bem como em placas de Petri. O protocolo é baseado na digestão e consequente dissociação enzimática da amostra de tecido cirúrgico em suspensão única célula 16. Para nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de cultura isolado do tumor de cólon primário e células normais directamente sobre substratos de hidrogel macias com microesferas fluorescentes incorporadas para citometria de tracção. Substratos gel transparente também permitir a imunocoloração. Este ensaio revelou diferenças na organização F-actina eadesões focais em células de cólon humano primários como mudanças de rigidez do substrato. Esta plataforma de cultura de células abre-se a possibilidade de explorar diferentes propriedades biofísicas das células primárias humanas, tais como a rigidez de tracção e célula como parâmetros para o prognóstico do cancro.

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Protocolo

O protocolo descrito a seguir segue as diretrizes da UIUC comitê de ética em pesquisa humana.

1. Recolha e digestão de amostra de tecido Surgical

  1. Recolha da amostra de tecido do tumor após ressecção do cólon direito (Figura 1A e 1B). Recolha de tecido de um site saudável adjacente também.
  2. Transferir o tecido imediatamente para um frasco de 15 ml contendo 12 ml de solução HBSS. Manter o frasco no gelo dentro de uma caixa de espuma isolante.
  3. Transportar o tecido contendo frasco para uma cultura capa de tecido para posterior processamento dentro de 45 min. Manter o frasco em um bloco de gelo no interior do exaustor.
  4. Verter o tecido fornecido em uma placa de 6 poços contendo 6-7 ml de solução de HBSS, utilizando uma pipeta.
    Nota: A quantidade de tecido por poço não é crítica neste passo de enxaguamento.
  5. Mantenha a placa de 6 bem em um bloco de gelo. Lave o tecido em solução HBSS duas vezes.
  6. Corte o tecido de forma limpa em seções separadas com scis estéreissor. Triture tecido em seções menores não superior a 1-2 mm 3 em tamanho, com uma lâmina de bisturi estéril.
  7. Pesar um frasco rotulado 0,1% de tripsina (contendo 1 mL de 0,1% solução de tripsina) antes de transferir o tecido. Transferir ~ 20 mg de tecido em cada um dos frascos de 0,1% de tripsina com uma pipeta.
  8. Tentar minimizar a transferência de HBSS para dentro do frasco de tripsina para evitar diluição adicional de tripsina.
  9. Pesar os frascos com tripsina após a transferência do tecido; documentar a diferença como a massa de tecido.
  10. Pour ~ 20 mg de tecido e 1 ml de tripsina a cada poço de uma placa de 24 poços.
  11. Colocar a placa de 24 poços num agitador no frigorífico a 4 ° C durante 16-20 horas. Durante este período de espera ou em uma hora mais cedo, preparar substratos em gel de poliacrilamida e funcionalizar-los com proteínas da MEC, conforme descrito na seção 3.

2. A dissociação enzimática do tecido de amostra em suspensão única célula e cultura de células isoladas no ECM funcionalizados Elastic Substrates e pratos de poliestireno rígidos

  1. Após 16-20 horas de incubação em tripsina bem a 4 ° C num agitador, a transferência de tecido de 4 ° C com tripsina a 4 ° C frasco de meio de crescimento completo (contendo 2-3 ml de meio de crescimento completo) utilizando uma pipeta. Garantir a transferência mínima de tripsina em meios de crescimento.
    Nota: formulação de meio de crescimento completo é como se segue: meio RPMI 1640 de base complementado com soro de cavalo a uma concentração final de 10% e penicilina-estreptomicina a 1% da solução total.
  2. Inserir o frasco de tecidos contendo meios de comunicação num banho de água quente a 37 ° C durante 12-15 min.
  3. Transferir o tecido para um frasco de 15 ml contendo solução de HBSS com uma pipeta, agitar suavemente.
  4. Repetir 2.3.
  5. Remover o tecido a partir da solução de HBSS e transferência para 0,1% de solução de colagenase (em HBSS) frasco contendo 1 ml de solução. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C e 5% de CO 2 ambiente numa incubadora de cultura de células humidificada. Durante o período de espera, growt quenteh mídia em um frasco de 15 ml a 37 ° C em banho-maria.
  6. Retire todos os fragmentos de tecido em pipeta minimização colagenase transição. Ejetar apenas os fragmentos de tecido para frascos de meios de cultura pré-aquecido.
  7. Colocar um filtro bem inserção 40 um em cada poço de uma placa de 6 poços. Humedecer o filtro com 1 mL de meio de cultura de células.
  8. Tritura-se o tecido em meio com uma pipeta de vidro de 10 ml várias vezes até que o tecido está completamente dissociado.
  9. Manter a ponta da pipeta tão próximo quanto possível para a base do frasco.
  10. Depositar a solução sobre o filtro para remover os detritos e as partes sem dissociar.
  11. Centrifugar filtrada suspensão de células no meio a 150 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  12. Remover o sobrenadante e ressuspender depois pelete de células com 2 ml de meio de cultura fresco.
  13. Contar as células utilizando um hemocitómetro (se necessário). Semente isolado células primárias na matriz extracelular (ECM) géis funcionalizados e pratos de isopor na concentração desejada.

3. Preparação e funcionalização de diferentes Rigidez poliacrilamida (PA) Géis e poliestireno Substratos

Nota: Para demonstração visual da Seção 3, os telespectadores / leitores são encaminhados para uma recente Journal of Experiments Visualized (Jove), do artigo 17.

  1. Adotando protocolos publicados 18, 19, 12 milímetros ativar 2 tampa de vidro desliza quimicamente para garantir a ligação covalente do hidrogel.
    1. Primeiro, tampa de vidro deleite desliza com 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) para 7 min a RT.
    2. Remover o ATS completamente com DI lavagem com água e tratamento de cobertura desliza com 0,5% de solução de glutaraldeído, durante 30 min (diluído em PBS a partir de solução stock de glutaraldeído a 70%).
  2. Obter duas soluções de gel kPa por mistura de 5% w solução de N '-methylenebisacrylamide (bis) em HEPES 10 mM-solução salina tamponada com solução a 20 / v acrilamida e 0,05% de N,. Use 8% w / v de acrilamida e 0,13Solução de N '-methylenebisacrylamide (bis) em 10 mM de solução salina tamponada com HEPES durante 10 kPa gel de 20% de N,.
    1. Em ambos os casos, usar 1: 200 de persulfato de amónio (10% w / v) e 1: 2000 N, N, N ', N' tetrametiletilenodiamina (TEMED) como o iniciador e o catalisador para o processo de polimerização, respectivamente.
    2. Além disso, adicionar 100 ul grânulos fluorescentes a 2 solução de gel kPa como marcadores fiduciários 21, 22.
  3. Depositar uma gota de 20 ul da solução gel PA pré-polímero no dia 12 mm2 ativado deslizamento tampa de vidro. Coloque outra 12 milímetros 2 regulares lamela de vidro sobre a queda. Certifique-se de que a gota se espalha entre as lamelas, devido à capilaridade. Inverta a sanduíche para 2 géis kPa para assegurar que a maior parte dos grânulos de se aproximar da superfície da cultura de células.
  4. Curar o gel de PA durante 45 min a RT.
  5. Retire o deslizamento tampa superior usando um único razor borda.
    Nota: Durante peeling, destacamento procede de uma pontado sanduíche. O gel permanece aderente à lâmina de vidro activada.
  6. Armazenar os géis em solução de PBS antes da utilização.
  7. Funcionalizar géis PA e vidro com moléculas de ECM, fibronectina humana a uma concentração de 50 ug / ml, após métodos publicados 23.
    1. Resumidamente, incuba substratos com 2 ml de hidrato de hidrazina pura S / N.
    2. Remover hidrato de hidrazina e enxaguar os substratos cuidadosamente com água DI.
    3. Lavar os substratos com ácido acético a 5% durante 30 min.
    4. Remover o ácido acético e os substratos enxaguar abundantemente com água desionizada.
    5. Manter os substratos imersos em água desionizada durante 30 min.
    6. Incubar os substratos com fibronectina oxidada durante 35 minutos a uma concentração de 50 ug / ml.
    7. Lavar os substratos com PBS em agitador a baixa rpm para 10 min.
    8. Incubar todos os substratos a 37 ° C em 2-3 ml de meio de cultura durante 30 min antes do plaqueamento das células.
      Nota: células da placa em um preenchimento escassamented forma (1.000-3.000 células / cm2). Cada deslizamento de vidro cobertas de gel precisa ser contido em uma placa de Petri 35 milímetros. Permitir que as células aderir completamente antes de qualquer microscopia (pelo menos S / N).

4. Microscopia de Força de tracção e de imunofluorescência Microscopia Assays

  1. Traction Microscopia de Força Assay
    1. Quente EDTA de tripsina-/ 10% de solução de 0,25% de SDS a 37 ° C em banho de água durante 10 minutos antes de começar as experiências de tracção.
    2. Remova um gel da incubadora de cultura de células em um tempo e colocar no palco microscópio fluorescente invertida (ampliação 32X).
    3. Encontrar uma única célula no campo de visão. Remover a tampa do prato Petri.
    4. Tomar uma imagem de contraste de fase de células (por exemplo, Figura 3).
    5. Mude o modo de imagem para fluorescência e seleccionar filtro apropriado. Não mova o estágio do microscópio ou amostra durante este tempo.
    6. Pegue uma imagem do displac partículas fluorescentesed por tracção celular (Figura 4C).
    7. Adicionar solução / SDS a 1 ml de tripsina a placa de Petri para separar a célula a partir do gel. Não mova o estágio do microscópio ou amostra durante este tempo. Além disso, tomar uma imagem da célula de controlo para assegurar a remoção completa do gel.
    8. Tomar uma imagem de referência (força nula) dos grânulos após a célula é removida.
    9. Repetir passos 4.1.2-4.1.8 para todos os outros géis.
    10. Faça uma pilha de imagens usando ImageJ das duas imagens adquiridas no passo 4.1.6 e 4.1.8 para cada caso. Para gerar a pilha de imagens, use seguinte seqüência de comandos em ImageJ após a abertura das imagens: Imagem → Pilhas → Imagens de empilhar.
    11. Para obter o campo de deslocamento e tração, utilize plugins ImageJ seguinte métodos publicados 21, 22 Obter códigos e tutoriais detalhados para esses plugins usando o seguinte link:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Alinhe as imagens da pilha usando o plugin 'Matching Template'. Use seguinte seqüência de comandos em ImageJ após a abertura da pilha de imagens gerado na etapa 4.1.10: Plugins → Template Matching → Alinhar Slices em Stack → OK. Salve a pilha de imagens, consequentemente. Use esta nova pilha de imagens nas etapas seguintes.
      2. Obter o campo de deslocamento usando o PIV (velocimetria por imagem de partículas) plugin (Figura 4D). Use seguinte seqüência de comandos depois de abrir a pilha de imagens salvou na etapa 4.1.11.1: Plugins → → iterativo PIV PIV (Basic) → OK → Aceitar este PIV e saída → Ok. Salvar a saída PIV no mesmo diretório na pilha de imagem original. Use isso como entrada na próxima etapa.
      3. Finalmente usar o FTTC (Transformada de Fourier tração citometria) plugin para obter o mapa de tração (Figura 4E). Use seguinte seqüência de comandos: Plugins → FTTC → Inspropriedades do material ert, ou seja, o módulo de Young e proporção de PA gel → OK → de Poisson Selecione o arquivo de saída PIV salvou na etapa 4.1.11.2 → OK. Salvar FTTC resulta no mesmo diretório na pilha de imagem e saída de PIV.
  2. Imunofluorescência Microscopia Assays
    1. Pegue os substratos a serem imunocoradas para a capa laminar e remova o meio de cultura.
    2. Lavar os substratos com PBS e fixar as células com paraformaldeído a 4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente.
    3. Lavar os substratos com PBS durante 3 vezes (5 minutos de cada vez). Por conseguinte, os substratos incubar com 500 uL do sinal potenciador durante 30 minutos e lavar com PBS.
    4. Incubar as células com anticorpo monoclonal anti-vinculina numa diluição de 1: 250 em PBS durante 45 min à temperatura ambiente. Lavar os substratos com PBS durante 3 vezes (5 minutos de cada vez).
    5. Incubar as amostras com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho a uma diluição de 1: 200em PBS à temperatura ambiente durante 30 min. Lavar os substratos com PBS durante 3 vezes (5 minutos de cada vez).
    6. Para visualizar a estrutura F-actina, incubar as células com TRITC-faloidina conjugados com uma concentração de 50 ug / ml durante 45 minutos à TA. Lavar os substratos com PBS durante 3 vezes (5 minutos de cada vez).
    7. Imagem das amostras que usam o microscópio confocal de varredura a laser (Figura 5A - 5D).

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Resultados

O protocolo descrito acima é empregada com sucesso para várias amostras de tecido (n = 12) de quatro pacientes diferentes sob as diretrizes do conselho de revisão institucional. Figura 1A ilustra um tumor colorretal representante logo após a cirurgia a partir do qual são obtidos os cortes de tecido para culturas de células. Uma secção de tecido típico em solução de HBSS após a transferência para a capa laminar para processamento adicional é mostrado na Figura 1B. Um esquema de digestão ...

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Discussão

Estresse tração celular surgiu recentemente como um potencial indicador biofísico de estado metastático 13. No entanto, não há dados tração experimental com células tumorais primárias existe na literatura até o momento. Além disso, a cultura de células do cólon diretamente primário isoladas em diferentes géis de poliacrilamida rigidez não é relatado ainda. Por isso, nós estabelecemos um optimizados de cólon primário condições de cultura de células em géis e poliestireno (Figura 2). Microbeads...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi financiado pela concessão 10-02165 do ECCS da National Science Foundation e pelo Programa de Iniciativa de Inovação Interdisciplinar, concessão 12035 da Universidade de Illinois. M.Y. A. foi financiado na UIUC pela Aliança do Instituto Nacional do Câncer do NIH para Nanotecnologia no Câncer 'Centro de Treinamento em Nanotecnologia do Câncer do Centro-Oeste' Grant R25 CA154015A. A imnunocoloração e a microscopia confocal foram realizadas no Instituto de Biologia Genômica (IGB), UIUC. M.Y.A. reconhece as discussões com B. J. Williams da UIUC sobre os experimentos de isolamento. M.Y.A. agradece a C. Nemeh e Abdul Bhuiya da UIUC pela assistência na preparação do esquema e da lista de materiais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
HBSSLife technologies14175-095
PBSLonza17-516F
TripsinaWorthingtonLS003736
ColágenoWorthingtonLS004176
3- Aminopropiltripoxissilano (ATS) Sigma-Aldrich281778
GlutaraldeídoPolysciences, Inc.01201-5
AcrilamidaSigma-AldrichA4058
N-metilenobisacrilamida (bis)Sigma-AldrichM1533
Solução tampão HEPESSigma-Aldrich83264
Persulfato de amônioBio-Rad161-0700
Biociências BDde fibronectina humana354008
Hidrato de hidrazinaSigma-Aldrich18412
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283
Paraformaldeído Ciências de Microscopia EletrônicaRT15710
Intensificador de SinalLife technologiesI36933
Anticorpo monoclonal anti vinculina Sigma-AldrichV9131
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgGLife technologiesA11001
TRITC conjugados de faloidina Sigma-AldrichP1951
0.1 µ m grânulos fluroscentesLife technologiesF8801
0.25% Tripsina-EDTALife technologies25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slipsCorning2865-12
perigoso

Referências

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