Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4 + CD45RB Alta Células T em imunodeficientes Mice

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir inflamação colônica em camundongos por transferência adotiva de células T^{altas CD4+}CD45RB singênicas para receptores deficientes em células T e B. As características clínicas e histopatológicas mimetizam as doenças inflamatórias intestinais humanas. Este método permite o estudo do início da inflamação colônica e da progressão da doença.

Resumo

Existem muitos modelos diferentes de animais disponíveis para estudar a patogênese de doenças humanas inflamatórias intestinais (DII), cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Descrevemos aqui um modelo de colite experimental que é iniciada por transferência adoptiva de células de baço singeneicas CD4 ⁺ CD45RB ^high T em ratinhos deficientes em receptores de células T e B. A população de células T CD4 ^{+ elevada} CD45RB que consiste em grande parte de células efectoras naive é capaz de induzir a inflamação intestinal crónica, assemelhando-se intimamente os aspectos chave da DII humana. Este método pode ser manipulado para estudar os aspectos do aparecimento e progressão da doença. Além disso, ele pode ser utilizado para estudar a função de inata e adaptativa, e as populações de células imunitárias reguladoras, e o papel da exposição ambiental, ou seja, a microbiota, na inflamação intestinal. Neste artigo, ilustram a metodologia para a indução de colite com um protocolo passo-a-passo. Este includes um vídeo de demonstração de aspectos técnicos essenciais necessários para desenvolver com sucesso este modelo murino de colite experimental para fins de pesquisa.

Introdução

As doenças inflamatórias intestinais (DII) A doença de Crohn e a colite ulcerativa resultam de uma interação complexa e incompletamente definida entre as respostas imunes do hospedeiro, a suscetibilidade genética, os fatores ambientais e o conteúdo luminal entérico¹. Estudos recentes de associação de todo o genoma relatam associações entre genes reguladores de células imunes e suscetibilidade à DII^2,3. Os genes intrínsecos das células imunes inatas e adaptativas estão representados nesses estudos, indicando um papel central para essas populações de células na patogênese da DII.

Atualmente, existem mais de 50 modelos an....

Protocolo

NOTA: Certifique-se que todos os protocolos de animais são aprovados por e em conformidade com Institutional Animal Care e do Comitê Use regulamentos (IACUC) e no Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para a Conservação e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos doadores podem ter sexo masculino ou feminino, mas ratos destinatário devem ser do sexo masculino. Se os destinatários do sexo feminino devem ser utilizados, os camundongos doadores têm que ser fêmeas ^5. Manter colónias usando, roupa de cama não estéril normal e água não acidificado, uma vez que estes podem causar impacto na microbiota intestinal, e, portanto, o fenótipo dos rat....

Resultados

Aproximadamente 10 x 10 ^{6 de} células T CD4 ⁺ CD45RB ^high T de baços de 10 adultos C57BL / 6 murganhos dadores são seguramente isolado. Este número variará, dependendo da idade e estirpe do rato dador e a proficiência do investigador. Quando 4 x 10 ⁵ C57BL / 6 células CD4 ⁺ T CD45RB ^alta são transferidos para C57BL / 6 RAG1 ^{- / -} ratinhos receptores, sinais clínicos da doença surgir em torno semana 5 pós-repletion ou antes, se os ratos .......

Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo passo-a-passo induzindo a inflamação do cólon em camundongos por transferência adotiva de células CD4 ⁺ T ⁺ CD45RB em ratos imunodeficientes. Usamos baços C57BL / 6 doadores e RAG1 singeneico ^{- / -} ratinhos receptores, embora outras estirpes (por exemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, não-obesos diabéticos (NOD)) modelos e genéticos da imunodeficiência (por exemplo, SCID, RAG2 ^{- / -)} também pode ser utilizado

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do Reagente/ Equipamento	Número de catálogo da empresa		Comentários/Descrição
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm tubo de fundo redondo	Falcon	352052
15 ml cônico	Corning	430790
26 G x 3/8 Agulha	BD Biosciences	305110
50 ml cônico	Corning
70 μ Filtro de Células	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-mercaptoetanol	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
Mídia			RPMI-1640, 1% Caneta/Estreptococo, 10% FBS, 0,0004% Tubo β-ME
FACS + filtro	BD Falcon	352235
Lâminas de Microscópio de Vidro	Fisherbrand	12550A3
Buffer de Rotulagem FBS	Gemini	100-106
Calor			1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer			0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
Mouse CD4 Conjunto de enriquecimento de linfócitos T - DM	BD Biosciences	558131
Mouse IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
Mouse IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
Pipeta Pasteur	Solução de	Fisherbrand 13-678-20D
, 100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
Placa de Petri	Fisherbrand	875713
Etanol Puro 200 Prova	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
Seringa	BD Biosciences	309597
Trypan azul	Corning Cellgro	25-900-CI
Mídia			RPMI-1640, 1% caneta/estreptococos, 0,0004% β-ME