Artigo de método

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4 + CD45RB Alta Células T em imunodeficientes Mice

DOI:

10.3791/52533

⸱

21 de abril de 2015

 ,  , 
1Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para induzir inflamação colônica em camundongos por transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB singênicas para receptores deficientes em células T e B. As características clínicas e histopatológicas mimetizam as doenças inflamatórias intestinais humanas. Este método permite o estudo do início da inflamação colônica e da progressão da doença.

Resumo

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Existem muitos modelos diferentes de animais disponíveis para estudar a patogênese de doenças humanas inflamatórias intestinais (DII), cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Descrevemos aqui um modelo de colite experimental que é iniciada por transferência adoptiva de células de baço singeneicas CD4 + CD45RB high T em ratinhos deficientes em receptores de células T e B. A população de células T CD4 + elevada CD45RB que consiste em grande parte de células efectoras naive é capaz de induzir a inflamação intestinal crónica, assemelhando-se intimamente os aspectos chave da DII humana. Este método pode ser manipulado para estudar os aspectos do aparecimento e progressão da doença. Além disso, ele pode ser utilizado para estudar a função de inata e adaptativa, e as populações de células imunitárias reguladoras, e o papel da exposição ambiental, ou seja, a microbiota, na inflamação intestinal. Neste artigo, ilustram a metodologia para a indução de colite com um protocolo passo-a-passo. Este includes um vídeo de demonstração de aspectos técnicos essenciais necessários para desenvolver com sucesso este modelo murino de colite experimental para fins de pesquisa.

Introdução

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As doenças inflamatórias intestinais (DII) A doença de Crohn e a colite ulcerativa resultam de uma interação complexa e incompletamente definida entre as respostas imunes do hospedeiro, a suscetibilidade genética, os fatores ambientais e o conteúdo luminal entérico1. Estudos recentes de associação de todo o genoma relatam associações entre genes reguladores de células imunes e suscetibilidade à DII2,3. Os genes intrínsecos das células imunes inatas e adaptativas estão representados nesses estudos, indicando um papel central para essas populações de células na patogênese da DII.

Atualmente, existem mais de 50 modelos animais de DII humana. Embora nenhum modelo fenocopie perfeitamente a DII humana, muitos são úteis para estudar vários aspectos da doença humana, incluindo o início e a progressão da doença e a resposta à cicatrização de feridas. No método descrito aqui, a inflamação intestinal é iniciada com transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB esplênicas singénicas para camundongos receptores deficientes em células T e B4. A população de células Taltas CD4 + CD45RB contém principalmente células T virgens preparadas para ativação que são capazes de induzir inflamação crônica do intestino delgado e do cólon. Este método permite que o pesquisador modifique as principais variáveis experimentais, incluindo populações de células imunes inatas e adaptativas, para responder a questões biologicamente relevantes relacionadas à patogênese da doença. Além disso, este método fornece início preciso do início da doença e um curso de tempo experimental bem caracterizado. Isso permite o estudo cinético das características clínicas da progressão da doença em camundongos. A inflamação intestinal induzida por este método compartilha muitas características com a DII humana, incluindo inflamação transmural crônica do intestino grosso e delgado, patogênese impulsionada por citocinas como TNF e IL-12 e sintomas sistêmicos, como perda de peso5. Assim, é um sistema modelo ideal para estudar a patogênese da DII humana.

O método aqui descrito em detalhes o protocolo para induzir colite experimental por transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB para camundongos Rag1-/-. Discutimos as principais etapas técnicas, resultados esperados, otimização e solução de problemas. Abordamos os elementos necessários para o desenvolvimento bem-sucedido deste modelo murino de inflamação intestinal para fins de pesquisa.

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Protocolo

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NOTA: Certifique-se que todos os protocolos de animais são aprovados por e em conformidade com Institutional Animal Care e do Comitê Use regulamentos (IACUC) e no Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para a Conservação e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos doadores podem ter sexo masculino ou feminino, mas ratos destinatário devem ser do sexo masculino. Se os destinatários do sexo feminino devem ser utilizados, os camundongos doadores têm que ser fêmeas 5. Manter colónias usando, roupa de cama não estéril normal e água não acidificado, uma vez que estes podem causar impacto na microbiota intestinal, e, portanto, o fenótipo dos ratinhos colite 5,6.

1. Preparação Experimental

  1. Use mídia e buffers geladas. Mantenha as células no gelo durante todo o experimento.
  2. Realizar o experimento na capa de risco biológico estéril usando técnica estéril.

2. Isolamento de células T do baço

  1. Sacrificá camundongo doador / mice em CO 2 câmara seguido por dislocatio cervicaln. Spray de abdômen com etanol 70%.
  2. Faça uma incisão horizontal no abdômen e descascar a pele para expor peritônio. Segure peritônio longe dos órgãos internos com a pinça e fazer uma incisão no peritônio abdominal esquerda para expor e extirpar o baço.
  3. Inserir o baço em 10 ml de Meios completa em uma placa de Petri. Retire e elimine o excesso de tecido do baço.
  4. Use duas lâminas de vidro esterilizados para esmagar e provocar uma separação baço em suspensão de uma única célula. Suspensão de células Filtrar através de um filtro de 70 mm em um tubo de 50 ml e lavar filtro com 5 ml de Meio Completo. Coloque até 5 baços em um tubo de 50 ml cônico.
  5. Centrifugar células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
  6. Suavemente ressuspender as células em 5 ml por baço de um tampão de lise, para lisar as células vermelhas do sangue durante 10 min à temperatura ambiente. Adicionar um volume igual de meio completo (5 ml por baço) para o tubo.
  8. Volte a suspender suavemente as células em 10 ml de Etiquetagem Buffer.
  9. Contagem de células por exclusão de azul de tripano.
    1. Retirar 20 l de suspensão de células e adicionar 180 mL de azul tripano para um tubo de microcentrífuga e misture bem. Após 5 min, adicionar 10 ul de células e contagem em hemocitómetro células não-azul sob o microscópio rotulados. Determinar o número total de células viáveis. Descarte de células / trypan azul mix.
  10. Centrifugar células em 10 ml de Etiquetagem tampão a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.

3. O enriquecimento de células T CD4 +

NOTA: Siga as instruções do fabricante para produtos específicos utilizados nesta seção.

  1. Suavemente ressuspender as células a uma suspensão de uma única célula de 20 x 10 6 células / ml em Etiqueta frioing Buffer.
  2. Adicionar 5 mL por 1 x 10 6 células de anticorpos de enriquecimento de células T CD4 bioestanhados. Incubar as células em gelo durante 15 min.
  3. Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer. Centrifugar células a 450 × g por 7 min. Aspirar cuidadosamente todo o sobrenadante usando sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
  4. Absolutamente vortex partículas magnéticas de estreptavidina conjugada. Adiciona-se 5 ul de partículas por 1 x 10 6 células.
  5. Misture bem, mas com cuidado. Mantenha a mistura a 6-12 ° C durante 30 min.
  6. Adicionar Etiquetagem Tampão a uma concentração de 20-80 x 10 6 células / ml. Transferir-se para 1,0 ml de células marcadas por 12 x 75 mm Tubo de ensaio de fundo redondo (referido como o "tubo-fracção positiva").
  7. Coloque cada tubo fração positivo no ímã para 6-8 min.
  8. Com os tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante do tubo-fração positiva com Pasteur de vidro pipeta para uma nova estéreis tubo de 50 ml (referred como a "fracção enriquecida"). Esta fração enriquecida contém células T CD4 +. Tenha cuidado para não perturbar as células marcadas atraídos pelo ímã.
  9. Suspenda as células deixaram nos tubos-fração positiva no mesmo volume de Etiquetagem tampão como no passo 3,6 por pipetagem cima e para baixo vigorosamente. Coloque tube-fração positiva para trás em ímã para 6-8 min.
  10. Com tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante (fração enriquecida, CD4 +) a partir de tubo-fração positiva com vidro Pasteur pipeta para estéril tubo de 50 ml a partir do passo 3.8, sem perturbar as células unidas a ímã.
  11. Repita os passos 3,9-3,10 para aumentar o rendimento de células CD4 + T obtidas. Continuar protocolo utilizando fracção enriquecida (células CD4 +).

4. Rotulagem e Classificando Cells 7

  1. Centrífuga enriquecido células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou suct vácuoíon no recipiente de resíduos.
  2. Ressuspender as células em 1 ml de Etiquetagem buffer. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9.
  3. Adicionar um volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 6 células / ml; se as células já estão <10 x 10 6, centrifugar a 450 g durante 7 min, elimine o sobrenadante por vazamento off ou de sucção a vácuo em um recipiente de resíduos, e adicionar volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 6 células / ml.
    1. Configure alíquotas separadas de aproximadamente 5-10 × 10 5 células cada para células de controlo não coradas, manchada de isótipo, e single-coradas em tubos de microcentrífuga.
  4. Adicionam-se 5 ug / ml de CD4-FITC e 1 ug / ml a CD45RB-PE para as células. Adicionar manchas de controlo de isotipo e as manchas individuais com a mesma concentração de alíquotas em tubos de microcentrífuga apropriados. Misture bem, mas com cuidado e incubar em gelo protegida da luz durante 30 min.
  5. Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer para células e controles. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
  6. Ressuspender em Labeling Buffer para o volume na etapa 4.5. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
  7. Ressuspender em Labeling Buffer para 10 x 10 6 células / ml. Passa através de células 70 um filtro em tubo FACS. Mantenha no gelo protegido da luz até que esteja pronto para FACS.
  8. Configure e determinar a compensação apropriada no separador de células com células não coradas e controles individuais manchada.
  9. Excluir células não viáveis ​​com forwarder e side-dispersão gating (Figura 1A). Configure gating para células CD45RB + CD4 + e com controles manchada de isótipo. Células portão à população CD4 +.
  10. Ordenar CD4 + células em CD45RB alta e CD45RB populações de baixa usando um histograma simples para as células marcadas com PE em tubos com 2 ml de Meio Completo. O CD45RB alta + CD45RB + células (CD45RB alta), e a população de baixa CD45RB é o mais baixo de 20% das células CD4 + CD45RB + (CD45RB baixo; Figura 1B).

figure-protocol-1
Figura 1: citometria de fluxo representativas parcelas de populações de células T CD4 + CD45RB durante a análise FACS (A - C) com FITC e CD4-PE esplenócitos CD45RB-corados de dadores murganhos C57BL / 6 foram classificadas por FACS em células CD4 + CD45RB high e CD4 +. populações de células T CD45RB baixo. Eventos (A) Doublet foram excluídos do gráfico de dispersão para a frente. (B) Os linfócitos foram fechado na trama dispersão frontal e lateral. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T foram plotados em um PE contra Eventos histograma. As células T CD4 + CD45RB baixas foram consideradas ser a mais baixa de 20% de células + CD45RB. As células T CD4 + CD45RB elevados foram definidos como a mais alta de 40% de células + CD45RB.

  1. Executar uma alíquota de cada população de células sobre a máquina de FACS para avaliar a pureza das populações.
  2. Centrífuga classificadas células a 450 xg por 7 min. Ressuspender em 1 ml de PBS. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9.

5. injeção de células em Destinatários

  1. Ressuspender classificados células a 4 x 10 6 células / ml (alta CD45RB) ou 2 x 10 6 células / ml (CD45RB baixo) em PBS.
  2. Transferir 100 ml de células de alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de PBS pordestinatário a este tubo. Assim, o volume total de injecção por animal é de 200 l, e valor total de células por beneficiário é de 4 x 10 5 CD4 + CD45RB células T naive elevados.
  3. Se o grupo experimental receber células T reguladoras é desejada, transferir 100 ml de células de alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de células de baixa CD45RB por recipiente para o mesmo tubo. O volume total de injecção por animal é de 200 uL; proporção de CD45RB alta: células de baixa CD45RB é 2: 1.
  4. Injectar 100 ul de CD45RB alta ou CD45RB alta CD45RB baixo CD4 + células / intraperitoneal em o lado direito e esquerdo do abdômen (total de 200 ul) de cada destinatário.

6. Monitoramento da progressão da doença em animais receptores

  1. Para avaliar o estado clínico dos animais receptores, atribuir escores clínicos agregados para o seguinte parameters 8 no dia da injecção, decorrida uma semana, e no momento do sacrifício:
    1. Determine desperdiçando medindo a perda de peso: 0 - sem perda de peso; Perda de 0,1-10% do peso corporal inicial - 1; 2 - A perda de mais de 10% do peso corporal inicial (Figura 2A).

figure-protocol-2
Figura 2: sinais patológicos clínicos e brutas de inflamação ocorrem após a transferência de tipo selvagem CD4 + CD45RB células T em alta RAG1 - / - e ratos destinatário NRDKO 11 (a) destinatários NRDKO perderam, em média, 10% do seu peso corporal inicial por 5. semanas após a transferência, enquanto RAG1- / - Os beneficiários não apresentaram sinais clínicos da doença neste momento. Cada ponto representa a média percentual do peso corporal inicial para a coorte ± SEM. **, P <0,005. (B) Alguns ratos desenvolveram inflamação intestinal grave, como demonstrado pela presença de prolapso retal. Esta é uma imagem representativa de prolapso retal em um mouse destinatário NRDKO. (C) Grosseiramente, a partir de dois pontos, tanto RAG1 - / - e ratinhos receptores NRDKO são espessadas e menor do que os dois pontos de RAG1 - / - e ratinhos NRDKO sem transferência adoptiva de células T. Colons de ratos receptores NRDKO mostrar inflamação grave e aumentou o peso dos dois pontos (dados não mostrados). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    1. Determinar a qualidade das fezes dos animais, colocando em recipiente limpo até que ele passoubanquinho: 0 - none; 1 - fezes moles; 2 - fezes aquosas e / ou com sangue.
    2. Determinar a saúde geral do animal através presença dos seguintes sinais da doença: 0 - nenhuma postura arqueada, eriçou pele, ou pele lesões; 1 - qualquer um de presente o seguinte: debruçado postura, eriçou pele, ou lesões de pele.
    3. Determinar a presença de prolapso retal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B).
  2. Sacrificar animais por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical, quando eles perderam 20% do seu peso corporal inicial ou no ponto de tempo desejado, o que ocorrer primeiro. A doença clínica é tipicamente evidente a partir de 5 semanas de pós-repletion.
  3. Avaliar para a gravidade da doença, como descrito anteriormente 5,7.
    1. Atribuir escores clínicos como no passo 6.1 8.
    2. Medir o comprimento do cólon e do peso (Figura 2C).
    3. Realizar análise histológica de inflamação5.
    4. Determine a expressão das citocinas espontânea em intestinais culturas de explantes tecido 9, linfa mesentéricos 10, e / ou soro 11.
      1. Resumidamente, para culturas de explantes 9, remover dois pontos após o sacrifício, aberta longitudinalmente, e limpo, com PBS. Incubar dois pontos, num agitador orbital a 250 rpm, em Meio Completo, durante 30 min à temperatura ambiente.
      2. Picar o tecido em pequenos pedaços e incubados a 37 ° C em Meio Completo, durante 24 h. Recolhe-se o sobrenadante e utilizar para a quantificação de citocinas por 100 mg de tecido por ELISA.
    5. Realizar ex vivo caracterização de fenótipos de células T e / ou função 10.

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Resultados

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Aproximadamente 10 x 10 6 de células T CD4 + CD45RB high T de baços de 10 adultos C57BL / 6 murganhos dadores são seguramente isolado. Este número variará, dependendo da idade e estirpe do rato dador e a proficiência do investigador. Quando 4 x 10 5 C57BL / 6 células CD4 + T CD45RB alta são transferidos para C57BL / 6 RAG1 - / - ratinhos receptores, sinais clínicos da doença surgir em torno semana 5 pós-repletion ou antes, se os ratos ...

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Discussão

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Aqui nós descrevemos um protocolo passo-a-passo induzindo a inflamação do cólon em camundongos por transferência adotiva de células CD4 + T + CD45RB em ratos imunodeficientes. Usamos baços C57BL / 6 doadores e RAG1 singeneico - / - ratinhos receptores, embora outras estirpes (por exemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, não-obesos diabéticos (NOD)) modelos e genéticos da imunodeficiência (por exemplo, SCID, RAG2 - / -) também pode ser utilizado

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Associação Americana de Gastroenterologia (AGA) Research Award Scholars e Doença de Crohn e Colite Foundation of America (CCFA) Desenvolvimento de Carreira Award (a ENS), NIH NIDDK F30 DK089692 (a ECS) e University of North Carolina Centro de Biologia Gastrointestinal e Doença Grant P30 DK34987 (Histologia Core). O Mecanismo UNC Citometria de Fluxo Core é apoiado em parte por uma NCI Centro de Suporte Grant Núcleo (P30CA016086) à Comprehensive Cancer Center UNC Lineberger. Agradecemos Luke B. Borst da North Carolina State University College de Medicina Veterinária por sua ajuda com a análise histopatológica e imuno-histoquímica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do Reagente/ EquipamentoNúmero de catálogo da empresaComentários/Descrição
10x PBSGibco14200075
12 mm x 75 mm tubo de fundo redondoFalcon352052
15 ml cônicoCorning430790
26 G x 3/8 AgulhaBD Biosciences305110
50 ml cônicoCorning
70 μ Filtro de CélulasFisherbrand22363548
BD IMagnetBD Biosciences552311
β-mercaptoetanolThermo Scientific35602
CD4-FITC IgG2beBioscience11-0041
CD45RB-PE IgG2aBD Pharminogen553101
MídiaRPMI-1640, 1% Caneta/Estreptococo, 10% FBS, 0,0004% Tubo β-ME
FACS + filtroBD Falcon352235
Lâminas de Microscópio de VidroFisherbrand12550A3
Buffer de Rotulagem FBSGemini100-106
Calor1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDPBeckman Coulter
Mouse CD4 Conjunto de enriquecimento de linfócitos T - DMBD Biosciences558131
Mouse IgG2a-PEBD Pharminogen553457
Mouse IgG2b-FITCeBioscience11-4732
Pipeta PasteurSolução deFisherbrand 13-678-20D
, 100XCorning Cellgro30-002-CI
[header]
Placa de PetriFisherbrand875713
Etanol Puro 200 ProvaDecon Labs2705-HC
RPMI-1640Gibco11-875-093
SeringaBD Biosciences309597
Trypan azulCorning Cellgro25-900-CI
MídiaRPMI-1640, 1% caneta/estreptococos, 0,0004% β-ME
430828 Completa Inativado por Penicilina-Estreptomicina de lavagem

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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