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Artigo de método

Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice

9.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/52538

⸱

18 de fevereiro de 2015

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

Embora os modelos de infecção por Candida estejam disponíveis para estudar a resistência imunológica do hospedeiro, um modelo para estudar a imunopatologia mediada por células T no contexto da infecção por Candida está ausente. Aqui descrevemos um método para estabelecer a imunopatologia Th17 associada à infecção oral por Candida em camundongos imunodeficientes.

Resumo

A doença da candidíase orofaríngea (OPC) é causada não apenas devido à falta de resistência imunológica do hospedeiro, mas também à ausência de regulação adequada da imunopatologia induzida por infecção. Embora as células Th17 estejam implicadas na defesa antifúngica, seu papel na imunopatologia não é claro. Este estudo apresenta um método para estabelecer a imunopatologia oral Th17 associada à infecção oral por cândida em camundongos imunodeficientes. O método é baseado na reconstituição de camundongos linfopenicos com células Th17 cultivadas in vitro, seguida de infecção oral por Candida albicans (C. albicans). Os resultados mostram que as células Th17 irrestritas resultam em inflamação e patologia e estão associadas a várias leituras mensuráveis, incluindo perda de peso, produção de citocinas pró-inflamatórias, histopatologia da língua e mortalidade, mostrando que este modelo pode ser valioso no estudo da imunopatologia OPC. A transferência adotiva de células reguladoras (Tregs) controla e reduz a resposta inflamatória, mostrando que este modelo pode ser usado para testar novas estratégias para neutralizar a inflamação oral. Este modelo também pode ser aplicável no estudo da imunopatologia oral Th17 em geral no contexto de outras doenças bucais.

Introdução

Infecções orais e inflamação têm sido relacionadas ao câncer e doenças cardiovasculares e têm um impacto dramático na saúde humana geral2,3. Infecções oportunistas e inflamações causadas por C. albicans estão associadas a imunodeficiências primárias (DIP)4,5, distúrbios inflamatórios como periodontite 6,7, síndrome de Sjögren e doença das glândulas salivares8,9, bem como carcinoma epidermóide oral 10-12. C. albicans é um fungo comensal dimórfico que coloniza a boca de 60% dos humanos saudáveis de forma assintomática, mas é o patógeno fúngico mais comum que causa infecções quando a defesa do hospedeiro está enfraquecida13-15. Causa infecções e inflamações recorrentes e crônicas em pacientes com AIDS e DIP, e também em outros indivíduos imunocomprometidos. Como comensal, sua carga de colonização está associada à mudança na diversidade do microbioma oral geral16. Como patógeno, causa várias formas de candidíase orofaríngea, como pseudomembranosa aguda, atrófica aguda, atrófica crônica, hipertrófica/hiperplásica crônica e queilite angular.

A proteção contra C. albicans é determinada não apenas pela resistência imune do hospedeiro, mas também pela capacidade de controlar adequadamente a imunopatologia induzida por Candida. Embora comensais como C. albicans contribuam para a modulação e exacerbação de outras condições inflamatórias orais, os mecanismos pelos quais a disbiose ocorre durante infecções oportunistas não são claros. Além do papel conhecido das células Th17 adaptativas na resposta de memória a C. albicans17, seu papel na iniciação e perpetuação da patologia da inflamação durante infecções crônicas permanece obscuro. Além disso, doenças inflamatórias orais, como síndrome de Sjögren e periodontite, estão associadas à patologia mediada por Th17. Curiosamente, essas doenças também estão fortemente associadas à OPC frequente. No entanto, as interações entre células Th17, imunopatologia oral de OPC e outras doenças inflamatórias orais não são estudadas.

Embora modelos de camundongos de infecção primária e secundária de candidíase oral estejam disponíveis, um modelo de camundongo para estudar a inflamação Th17 associada à infecção por Candida, especialmente no contexto de imunodeficiência, não está disponível. Este estudo apresenta um método para estabelecer a inflamação oral Th17 associada à infecção oral por Candida em camundongos. A infecção por Candida em camundongos é caracterizada por lesões fúngicas, inflamação na língua, diminuição da ingestão de alimentos, perda de peso e, eventualmente, um estado moribundo. A patologia oral se assemelha a lesões crônicas de infecção por cândida, bem como displasia epitelial em modelos de câncer oral em camundongos12,18.

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Protocolo

NOTA: Os experimentos com ratos foram realizados de acordo com o animal institucional comitê de bem-estar (IACUC) orientações.

1. Reconstituição da Rag-1 - / - Os ratos com células I n Vitro Cultivadas Th17 (três dias antes da infecção)

  1. Para o estabelecimento de células Th17, cultura de células CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- células T ingénuas (3 x 104) de fundo em U em placas de 96 poços, sozinho ou co-cultura eles, juntamente com 3 x 104 células T CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs na presença de solúvel α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ng / ml) de anticorpos e células apresentadoras de antigénio, sob condições Th17 (polarizadas usando IL-6 (25 ng / mL), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) e α -IL-4 (2 ng / ml)) durante três a quatro dias.
    NOTA: células ingênuo e regs T foram classificados usando fluorescência de células activadas (FACS) umad procedimentos de isolamento de células magnético e cultivadas como descrito anteriormente 19-22.
  2. No dia 4, depois de re-suspender as células Th17, utilizando a pipeta, recolher-los a partir de culturas, e centrifugar-las em condições estéreis.
    1. Tomar uma pequena alíquota destas células para examinar a sua viabilidade e para fenotipagem. Ressuspender-los em 500 ul de meio RPMI, adicionar iodeto de propídio (200 ng / ml) e avaliar a sua viabilidade imediatamente por citometria de fluxo. Execute fenotipagem por citometria de fluxo avaliação da produção de IL-17A após restimulação (ver secção 6.3).
  3. Centrifugar e lavar o grosso das células em PBS estéril a 480 xg durante 6 minutos a 4 ° C em todas as etapas, a menos que especificado de outra forma.
  4. Use essas células para transferência adotiva em 6-8 semanas de idade CD45.2 RAG1 - / - ratos imunodeficientes.
    1. Ressuspender as células a 1 x 10 7 células / ml de densidade celular utilizando PBS estéril frio.
    2. Injectar 100 ul de células por intraperitoneal injecção, utilizando agulhas 25 G em seringas de 1 ml de tuberculina, de tal modo que um ratinho receber 1 x 10 6 células. Alguns ratos receberão células Th17 PBS ou somente, e outros ratos receberão células Th17 que foram co-cultivados com células Treg.
      Observação: executar todos os passos de forma asséptica.

2. Crescer C. albicans para a infecção (um dia antes da infecção)

  1. Antes da inoculação, dispersar cinco colônias do CAF2-1 C. albicans estirpe laboratorial em 100 ul de suspensão de PBS estéril e adicionar a suspensão ao caldo estéril.
  2. Inocular 5 colônias de C. albicans em 50 ml de base de azoto de levedura (YNB sem aminoácidos) / peptona / meio de caldo de dextrose e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C durante 15-18 horas a 130 rpm.
  3. Monitorar o caldo para a opacidade, uma vez que é uma indicação para o crescimento do fungo.

3. CandidaColheita e Counting Procedimento (No dia da infecção)

  1. Recolha de 10 ml de caldo de Candida em tubos de 15 ml. Para volumes maiores, coletar Candida em tubos de 50 ml.
  2. Centrifugar os blastosporos a 1900 xg durante 5 min à temperatura ambiente em todas as etapas, a menos que especificado de outra forma. Agregar as blastosporos por centrifugação, seguida pela remoção do sobrenadante.
  3. Se houver mais do que um tubo, reunir os blastosporos Candida a partir de múltiplos tubos, adicionando PBS estéril para os peletes e ressuspender-los em 10 ml de PBS para contagem.
  4. Tomar 20 ul de blastosporos em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 20 uL de paraformaldeído a 2X e incubar à temperatura ambiente durante 15-20 min. Contagem blastosporos fixos usando o hemocitômetro sob o microscópio.
    NOTA: O paraformaldeído é cancerígeno. Abrir a solução não diluída apenas na hotte.
  5. No entretanto, repetir a lavagem dos blastosporos pelo menos duas vezes, por centrifugação them em PBS, e peletização blastosporos. Manter os peletes em tubos de 15 ml à temperatura ambiente, na capa ABSL1, prontos para a infecção.
  6. Deixar alguns PBS estéril à temperatura ambiente durante ressuspensão dos blastosporos para a infecção.
  7. Após a contagem, adicionar PBS estéril para o sedimento blastosporo para ajustar o número de células de levedura blastosporo a 2 x10 8 de levedura células / ml. Esta é a suspensão blastosporo que será utilizado para infectar os ratinhos.
    Observação: executar todos os passos de forma asséptica.

4. Ratos Infection (3-5 dias após a transferência celular)

NOTA: O procedimento básico infecção é realizada como descrito anteriormente 19,23-25.

  1. Pesar o Rag-1 - / - ratos que receberam PBS ou as células três dias antes.
  2. Calcula-se a dose de agentes anestésicos, utilizando o seu peso corporal. Anestesiar os ratos por administração de cetamina / xilazina mistura (16,1 mg / ml e 1,6 mg / ml), utilizando agulhas 25 G em seringas de 1 ml de tuberculina, por intrinjeção aperitoneal.
    1. Administrar 50 ul por 10 gramas de peso corporal. (Ou seja, 0,8 mg de cetamina e 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal ou 80 mg de cetamina e de xilazina 8 mg por kg de peso corporal, respectivamente). Observar o desenvolvimento de resposta toe pitada a cada 15 minutos após a anestesia.
      NOTA: Esta dosagem irá induzir 60-90 min da anestesia, o que é suficiente para o procedimento de infecção.
    2. Aplicar a pomada lubrificante oftálmico aos olhos dos ratinhos para evitar que as córneas de secar. Como o lubrificante ocular pode secar, repita lubrificação oftálmica a cada 45 min.
  3. Injectar 1 mL de solução salina (NaCl a 0,9%) por via subcutânea no lado de trás do membro anterior, para ajudar a re-hidratação dos ratos durante a anestesia.
  4. Obter uma nova gaiola, limpo. Siga o procedimento de uma infecção do mouse em um momento, colocando cada rato na gaiola nova, uma vez infectado. Realize a infecção PBS / sham em primeiro lugar, e depois prosseguir para as gro infecção por Candidaups.
  5. Pegue o rato anestesiado e abra a boca para revelar a base da língua.
    1. Coloque uma bola de algodão 3 mm de diâmetro saturado com 50 ul de PBS ou blastosporo suspensão, sublingualmente na cavidade oral durante 90 min. Virar os ratos a cada 15 minutos frente e de trás para evitar congestão pulmonar, garantindo que as bolas de algodão não se movem.
  6. Configurar um temporizador para cada rato para garantir 90 min de Sham ou Candida inoculação na cavidade oral.
  7. Mantê-los em uma gaiola sob a lâmpada de calor (4 metros de distância), e cada mouse sobre almofadas de gel de calor.
  8. Certifique-se de que a língua é retirado dentro e longe dos dentes, para evitar dentes dilacerante da língua.
  9. No final de 90 minutos, retire a bola de algodão da boca do mouse. Preste atenção para qualquer rato que pode recuperar da anestesia mais cedo do que 75 minutos. Em tal caso, anestesiar-los novamente com cetamina (40 mg / kg) apenas.

5. Publicar Procedure Monitoramento (durante a anestesia 90 min)

  1. Use almofadas de gel de calor durante a anestesia 90 min.
    1. Para manter a temperatura do corpo e para evitar sufocamento, não permitem que os ratos se recuperar no mouse cama sabugo de milho regular.
  2. Após a recuperação da anestesia, administrar um adicional de 1 ml de NaCl a 0,9% esterilizado subcutaneamente em dois locais no dorso.
  3. Mantenha-se cinco PBS (sham) camundongos inoculados por gaiola. Casa apenas 1-2 camundongos infectados por gaiola.
  4. Preencha o cartão de procedimento com as iniciais todos os dias após o procedimento para anotar as mudanças no peso corporal, higiene hábitos e saúde em geral.

6. Avaliação da Inflamação

6.1) A perda de peso

  1. Pesar os ratinhos todos os dias durante a infecção, começando no dia anterior ao processo de infecção.
    NOTA: Normalmente, os ratos imunodeficientes injetados com células Th17 e sem regs T sucumbir a 20-30% De perda de peso devido ao aumento da carga fúngica 19 e exacerbado inflamação.

6.2) pontuação Histologia da língua

  1. Sacrifício dos ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por deslocação cervical.
  2. Abra as mandíbulas e dissecar a língua com tesouras e pinças. Use uma pinça rombo para manter a língua, e usando a tesoura chegar à parte de trás da boca para entalhar a extremidade traseira da língua.
  3. Para hematoxilina immunocytochemical e eosina (H & E) a coloração dos tecidos da língua, lavar os tecidos língua com PBS gelado. Adicionar 5 ml de formol a 10% por 2-3 línguas e corrigi-los O / N em tubos de 15 ml.
    1. No dia seguinte, remover a formalina e mergulhar os tecidos em 5 ml de etanol a 70% para evitar a hiper-fixação. Enviá-los para o serviço comercial para continuar com parafina, corte e coloração de cortes de parafina.
      NOTA: serviço histologia comercial é usado para executar estes passos.
  4. Uma vez que as lâminas estão de volta a partir do serviço histologia comercial, grau de inflamação, observando as secções de tecido sob um microscópio de luz.
    1. Pontuação de 0 a 5, sendo 0 sem inflamação, e 5 sendo o mais grave inflamação. Pontuação da inflamação usando Tabela 1.

6.3) A produção de citocinas pelas células Th17

NOTA: A produção excessiva de TNF-α é uma das leituras de imunopatologia excessiva. Quando os ratos são transferidos adoptivamente com células Th17 só, faz com que a imunopatologia que está associado com a produção excessiva de TNF-α em células Th17.

  1. Coletar uma suspensão de células individuais do baço, linfonodos cervicais, linfonodos axilares, e língua, utilizando métodos previamente descritos 19,26.
  2. Reestimular as células com miristato acetato de forbol (PMA) (50 ng / ml) e ionomicina (500 ng / ml) durante 4 h com Brefeldina A (10 ug / ml) adicionada no last 2 h. Lavam-se as células com PBS e corrigi-los utilizando um kit de fixação / permeabilização comercial de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Realização da coloração de citocinas celular intra utilizando o anti-TNF-α conjugado com fluorocromo, anti-IL-17A e anticorpos ROR-γt como anteriormente descrito 19.
  4. Resumidamente, ressuspender as células em tampão de permeabilização 1X com o cocktail de anticorpos anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpos ROR-γt, cada anticorpo a 2-3 ug / ml de concentração final.
  5. Incubam-se as células durante 1 h à TA.
  6. Após a incubação, lavar as células com tampão de permeabilização 1X.
  7. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS com 0,5% de albumina de soro bovino para análise de citometria de fluxo.

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Resultados

Neste modelo, tanto os camundongos infectados por Candida e camundongos não infectados em Rag-1 - / - fundo imunodeficientes foram adotivamente transferidos com células Th17 3-5 dias antes da infecção. Um total de 10-12 ratinhos foram utilizadas para as experiências, com dois ratos em cada Sham grupos infectados e 5/4 em cada um dos grupos infectados Candida. Células naive foram derivadas de Thy1.1 ou CD45.1 ratinhos congénicos, de modo que as células Th17 injectados foram rastreados in ...

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Discussão

Este modelo é baseado na indução C. bucal infecção albicans dependente inflamação Th17. Devido à ausência de regs T, a inflamação induzida por células Th17 desprendido e leva a imunopatologia mal resolvidas. In vitro derivados de células T CD4 + naive polarizadas como células Th17 foram utilizados para a transferência adoptiva. 40 - 50% das células CD4 + cultivadas células mostram detectável expressão de IL-17A por volta do dia 3 (células Th17), e por isso foram utilizadas para a in...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos à Dra. Helene Bernstein por nos fornecer acesso ao seu citômetro de fluxo. Também agradecemos à instalação de citometria de fluxo do CFAR pelos serviços de citometria de fluxo. Este projeto foi em parte apoiado pelo financiamento de utilização do núcleo do CTSC e pela concessão da corporação STERIS / Divisão de Hospitais Universitários de Doenças Infecciosas para PP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CAF-2Universidade de Pittsburgh (Sarah Gaffen)-Candida cultura
U-bottom 96 placas de poços Fisher055588Usado para cultura de células
a-CD3 eBiosciences16-0031-85Polarização de células para condições Th17
a-CD28 eBiosciences16-0281-85Polarização de células para condições Th17
m-IL-6Bio BasicRC232Polarização de células para condições Th17
h-TGF-b R& D240-BPolarização de células para condições Th17
a-IFN-g eBiosciences16-7311-85Polarização de células para condições Th17
a-IL-4 eBiosciences16-7041-85Polarização de células para condições Th17
α-IL17A ef660eBiosciences50-7177-82Usado para cultura de células - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7eBiosciences25-7423-41Usado para cultura de células - 1:100
α-RORgt PE eBiosciences12-6981-82Usado para cultura de células - 1:50
YNB sem aminoácidos)/Peptona/Meio de caldo de dextrose Bio BásicoS507. TAMANHOMediium para crescimento de candida
Incubadora Shaker New Brunswick ScientificInnova 4300Crescimento de incubação para tubos de
candida de 15 mlBio BasicBT888-SYUsado para cultura de células e crescimento de cândida
Tubos de 50 mlBio BasicCT 788-YSUsado para cultura de células e crescimento de cândida
Centrífuga de mesaVWR International LLC82017-654Para peletização de cândida -900 g
CentrífugaAllegraBeckman Coulter392302Cultura de células - 480 g
Tubos eppendorf de 1,5 mlBio BasicBT620-NSPreparação da concentração final de candida
2x paraformaldeídoMicroscopia eletrônica Sciences15710Fixação de candida para contagem
HemocitômetroVWR International LLC15170-172Contagem de células
PBS - Phosphate Buffered SalineBio BasicPD8117Preparação de tampões
Cetamina/xilazina Case Western Reserve University - Animal ResourceCenter-Obtidodo protocolo aprovado pela ARC para anestesia
Pomada lubrificante oftálmica PomadaAllergan-Eyepara animais para prevenir o ressecamento
Solução salina (0,9% NaCl)G Biosciences786-561Administrado a animais para prevenir a desidratação
Bola de algodão de 3 mm de diâmetro VWR International LLCBP7603Bolas de 3 mm para infecção por candida
Almofadas de gel de calorCase Western Reserve University - Animal ResourceCenter-paramanter a temperatura corporal e recuperação rápida
Coloração de hematoxilina e eosinaHistoserv - MD-Histologiade tecidos
10% formalina Ciências de Microscopia EletrônicaJC1111/MCHistologia de tecidos
70% etanol VWR International LLC97064-490Finalidade de esterilização
PMA - Phorbol 12-miristato 13-acetatoSigma-AldrichP1585-1MGReestimulação de células
IonomicinaLife Technologies124222 1mgReestimulação de células
Kit de permeabilização de fixaçãoeBiosciencesE16913-106Células de fixação para citometria de fluxo
Seringas de tuberculinaBD Biosciences309659Injeção de camundongos
25 G x 3/8 agulhasBD Biosciences309626Injeção de camundongos
Rag1 -/- camundongosJackson laboratoriesNº de estoque: 002216Camundongos receptores
CD45.1 camundongos congênicosLaboratórios JacksonNº de estoque:002014 Células Th17 do doador
Camundongos CB17-SCID JacksonlaboratoriesNº de estoque: 001303Camundongos receptores
Camundongos Balb/c LaboratóriosJacksonNº de estoque: 000651Células Th17 do doador

Referências

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