Embora os modelos de infecção por Candida estejam disponíveis para estudar a resistência imunológica do hospedeiro, um modelo para estudar a imunopatologia mediada por células T no contexto da infecção por Candida está ausente. Aqui descrevemos um método para estabelecer a imunopatologia Th17 associada à infecção oral por Candida em camundongos imunodeficientes.
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Artigo de método
Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença da candidíase orofaríngea (OPC) é causada não apenas devido à falta de resistência imunológica do hospedeiro, mas também à ausência de regulação adequada da imunopatologia induzida por infecção. Embora as células Th17 estejam implicadas na defesa antifúngica, seu papel na imunopatologia não é claro. Este estudo apresenta um método para estabelecer a imunopatologia oral Th17 associada à infecção oral por cândida em camundongos imunodeficientes. O método é baseado na reconstituição de camundongos linfopenicos com células Th17 cultivadas in vitro, seguida de infecção oral por Candida albicans (C. albicans). Os resultados mostram que as células Th17 irrestritas resultam em inflamação e patologia e estão associadas a várias leituras mensuráveis, incluindo perda de peso, produção de citocinas pró-inflamatórias, histopatologia da língua e mortalidade, mostrando que este modelo pode ser valioso no estudo da imunopatologia OPC. A transferência adotiva de células reguladoras (Tregs) controla e reduz a resposta inflamatória, mostrando que este modelo pode ser usado para testar novas estratégias para neutralizar a inflamação oral. Este modelo também pode ser aplicável no estudo da imunopatologia oral Th17 em geral no contexto de outras doenças bucais.
Introdução
Infecções orais e inflamação têm sido relacionadas ao câncer e doenças cardiovasculares e têm um impacto dramático na saúde humana geral2,3. Infecções oportunistas e inflamações causadas por C. albicans estão associadas a imunodeficiências primárias (DIP)4,5, distúrbios inflamatórios como periodontite 6,7, síndrome de Sjögren e doença das glândulas salivares8,9, bem como carcinoma epidermóide oral 10-12. C. albicans é um fungo comensal dimórfico que coloniza a boca de 60% dos humanos saudáveis de forma assintomática, mas é o patógeno fúngico mais comum que causa infecções quando a defesa do hospe....
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Protocolo
NOTA: Os experimentos com ratos foram realizados de acordo com o animal institucional comitê de bem-estar (IACUC) orientações.
1. Reconstituição da Rag-1 - / - Os ratos com células I n Vitro Cultivadas Th17 (três dias antes da infecção)
- Para o estabelecimento de células Th17, cultura de células CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- células T ingénuas (3 x 104) de fundo em U em placas de 96 poços, sozinho ou co-cultura eles, juntamente com 3 x 104 células T CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs na presença de solúvel α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ng / ml) de anticorpos e células apresentadoras de antigénio, sob condições Th17 (p....
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Resultados
Neste modelo, tanto os camundongos infectados por Candida e camundongos não infectados em Rag-1 - / - fundo imunodeficientes foram adotivamente transferidos com células Th17 3-5 dias antes da infecção. Um total de 10-12 ratinhos foram utilizadas para as experiências, com dois ratos em cada Sham grupos infectados e 5/4 em cada um dos grupos infectados Candida. Células naive foram derivadas de Thy1.1 ou CD45.1 ratinhos congénicos, de modo que as células Th17 injectados foram rastreados in .......
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Discussão
Este modelo é baseado na indução C. bucal infecção albicans dependente inflamação Th17. Devido à ausência de regs T, a inflamação induzida por células Th17 desprendido e leva a imunopatologia mal resolvidas. In vitro derivados de células T CD4 + naive polarizadas como células Th17 foram utilizados para a transferência adoptiva. 40 - 50% das células CD4 + cultivadas células mostram detectável expressão de IL-17A por volta do dia 3 (células Th17), e por isso foram utilizadas para a in.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Helene Bernstein por nos fornecer acesso ao seu citômetro de fluxo. Também agradecemos à instalação de citometria de fluxo do CFAR pelos serviços de citometria de fluxo. Este projeto foi em parte apoiado pelo financiamento de utilização do núcleo do CTSC e pela concessão da corporação STERIS / Divisão de Hospitais Universitários de Doenças Infecciosas para PP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CAF-2 | Universidade de Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida cultura |
| U-bottom 96 placas de poços | Fisher | 055588 | Usado para cultura de células |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarização de células para condições Th17 |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarização de células para condições Th17 |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarização de células para condições Th17 |
| h-TGF-b | R& D | 240-B | Polarização de células para condições Th17 |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarização de células para condições Th17 |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarização de células para condições Th17 |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Usado para cultura de células - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Usado para cultura de células - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Usado para cultura de células - 1:50 |
| YNB sem aminoácidos)/Peptona/Meio de caldo de dextrose | Bio Básico | S507. TAMANHO | Mediium para crescimento de candida |
| Incubadora Shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Crescimento de incubação para tubos de |
| candida de 15 ml | Bio Basic | BT888-SY | Usado para cultura de células e crescimento de cândida |
| Tubos de 50 ml | Bio Basic | CT 788-YS | Usado para cultura de células e crescimento de cândida |
| Centrífuga de mesa | VWR International LLC | 82017-654 | Para peletização de cândida -900 g |
| Centrífuga | AllegraBeckman Coulter | 392302 | Cultura de células - 480 g |
| Tubos eppendorf de 1,5 ml | Bio Basic | BT620-NS | Preparação da concentração final de candida |
| 2x paraformaldeído | Microscopia eletrônica Sciences | 15710 | Fixação de candida para contagem |
| Hemocitômetro | VWR International LLC | 15170-172 | Contagem de células |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparação de tampões |
| Cetamina/xilazina | Case Western Reserve University - Animal Resource | Center-Obtido | do protocolo aprovado pela ARC para anestesia |
| Pomada lubrificante oftálmica | Pomada | Allergan-Eye | para animais para prevenir o ressecamento |
| Solução salina (0,9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administrado a animais para prevenir a desidratação |
| Bola de algodão de 3 mm de diâmetro | VWR International LLC | BP7603 | Bolas de 3 mm para infecção por candida |
| Almofadas de gel de calor | Case Western Reserve University - Animal Resource | Center-para | manter a temperatura corporal e recuperação rápida |
| Coloração de hematoxilina e eosina | Histoserv - MD-Histologia | de tecidos | |
| 10% formalina | Ciências de Microscopia Eletrônica | JC1111/MC | Histologia de tecidos |
| 70% etanol | VWR International LLC | 97064-490 | Finalidade de esterilização |
| PMA - Phorbol 12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Reestimulação de células |
| Ionomicina | Life Technologies | 124222 1mg | Reestimulação de células |
| Kit de permeabilização de fixação | eBiosciences | E16913-106 | Células de fixação para citometria de fluxo |
| Seringas de tuberculina | BD Biosciences | 309659 | Injeção de camundongos |
| 25 G x 3/8 agulhas | BD Biosciences | 309626 | Injeção de camundongos |
| Rag1 -/- camundongos | Jackson laboratories | Nº de estoque: 002216 | Camundongos receptores |
| CD45.1 camundongos congênicos | Laboratórios Jackson | Nº de estoque:002014 | Células Th17 do doador |
| Camundongos CB17-SCID Jackson | laboratories | Nº de estoque: 001303 | Camundongos receptores |
| Camundongos Balb/c Laboratórios | Jackson | Nº de estoque: 000651 | Células Th17 do doador |
Referências
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J.
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Reimpressões e permissões
