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Artigo de método

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

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DOI:

10.3791/52539

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28 de maio de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Resumo

Gene segmentação é uma abordagem crítica para a caracterização de funções de genes na pesquisa biomédica moderna. No entanto, a eficiência do direccionamento de genes em células humanas tem sido baixa, o que impede a geração de linhas celulares humanas, a uma taxa desejada. Os últimos dois anos têm testemunhado uma rápida progressão na melhoria da eficiência de manipulação genética por ferramentas de edição de genoma, tais como o sistema / Cas (associada à CRISPR) CRISPR (cluster regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete). Este manuscrito descreve um protocolo para a geração humana induzida em células estaminais pluripotentes (hiPSC) repórteres específicos de linhagem utilizando o sistema CRISPR / Cas assistida recombinação homóloga. Os procedimentos para a obtenção de componentes necessários para a tomada de linhas de linhagem repórter neurais utilizando o sistema CRISPR / Cas, com foco na construção de segmentação vetores e RNAs única guia, são descritos. Este protocolo pode ser estendido para estabelecimento plataforma e correcção mutação em hiPSCs.

Introdução

O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), juntamente com outras ferramentas de edição do genoma, revolucionou a manipulação do genoma humano nos últimos anos1-7. Os principais componentes do sistema CRISPR/Cas9 são RNA guia único (sgRNA) e Cas9. Cas9 é uma endonuclease de DNA tipo II guiada por RNA. Possui dois domínios de nuclease, HNH e RuvC, que são responsáveis por fazer quebras de fita dupla (DSBs) de DNA em uma região genômica específica próxima a um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) 7-10. Um sgRNA tem uma função combinada de crRNA e tracrRNA, duas moléculas de RNA de imunidade adaptativa identificadas em bactérias (como Streptococcus pyogenes) e archaea para lutar contra a invasão de DNA de fontes exógenas9-11. Quando adequadamente projetado e co-introduzido em células de mamíferos, o sgRNA reconhece a sequência PAM, pares de bases com a fita complementar do DNA alvo e guia e transativa Cas9 para clivar em ambas as fitas de DNA imediatamente a montante do PAM7. Posteriormente, ocorrerá recombinação dirigida homóloga (HDR, na presença de um vetor de direcionamento) ou junção de extremidade não homóloga (NHEJ) para reparar os DSBs. Transgenes como cDNAs, repórter ou fragmentos resistentes a antibióticos podem ser integrados e linhas transgênicas ou knockin feitas.

Embora o sistema CRISPR/Cas9 seja altamente eficiente e relativamente específico, atividades indesejadas fora do alvo foram relatadas12-15. Para minimizar eventos fora do alvo, as nickases Cas9 (Cas9n) também foram projetadas9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A ou Cas9 H840A) é uma enzima Cas9 com mutações em um dos dois domínios de nuclease, que provoca apenas um corte em uma fita de DNA. Para obter clivagem em ambas as fitas, dois sgRNAs são projetados para guiar um par de nickases, que cortam separadamente em loci próximos das duas fitas de DNA diferentes. A estratégia de "corte duplo" requer um design mais rigoroso do que a plataforma Cas9 convencional e oferece alta eficiência e alta especificidade para experimentos de edição de genes.

Este manuscrito descreve um protocolo para gerar repórter de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) específicas da linhagem usando recombinação homóloga assistida pelo sistema CRISPR/Cas. São descritas as etapas para obter os componentes necessários para fazer linhas repórter de linhagem neural usando a edição de genoma mediada pelo sistema CRISPR/Cas, com foco na construção de vetores de direcionamento e sgRNAs. Este protocolo foi repetido com sucesso em várias linhagens de hiPSC, incluindo aquelas derivadas de indivíduos saudáveis e de pacientes com doenças do SNC. Os genes direcionados em nosso laboratório incluem OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 e SOD1. A eficiência de direcionamento da recombinação homóloga mediada pelo sistema CRISPR/Cas em hiPSCs varia de 20 a 40%, o que é consistente com relatórios anteriores1,18,19. Em comparação com uma eficiência típica de 1-2% em experimentos convencionais de direcionamento de genes, a eficiência de direcionamento é significativamente melhorada.

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Protocolo

1. Design e construção vetorial para vetores de segmentação

  1. Uma vez que o marcador específico da linhagem é determinado, localize a sequência genômica do gene e projete os braços de homologia de acordo. O comprimento do braço de homologia 5' é ~1 kb e do braço de homologia 3' é ~1,5 kb (Figura 1).
  2. Marque o repórter sequencialmente a jusante da sequência genômica logo antes do códon de parada, por subclonagem, para que a expressão endógena não seja alterada ou interrompida. Vincule o repórter, ou(s) repórter(es) duplo, com sequências de peptídeos 2A autoclivados (F2A, E2A ou T2A) 20,21 ou local de entrada do ribossomo interno (IRES).
    Nota: Os repórteres podem incluir proteínas fluorescentes, como GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, luciferase ou de resistência a antibióticos, uma combinação de proteína fluorescente e de resistência a antibióticos. Um exemplo é mostrado na Figura 1 para a construção do vetor de direcionamento para o gene ALDH1L1 humano, marcado por EGFP e de resistência à neomicina.
  3. Adicione uma de seleção positiva a jusante do repórter. A seleção positiva é um resistente a antibióticos floxed que será excisado das iPSCs alvo após a seleção e isolamento dos clones positivos.
  4. Inclua um de seleção negativa fora do braço de homologia de 3 '. Os comuns de seleção negativa são timidina quinase, TK e toxina diftérica A (DTA) 22.
  5. Obtenha um clone de BAC humano contendo a sequência do marcador de linhagem e verifique o clone por amplificação por PCR. Construa o vetor de direcionamento em pKD46 contendo-DH5α usando recombinador para puxar para baixo o local de direcionamento 23. Aplique gateway multisite, estratégias Golden gate23,24 quando necessário.

2. Design e construção vetorial de sgRNAs para o sistema CRISPR/Cas9.

  1. Determine o marcador específico da linhagem que será direcionado para fazer o repórter. Copie a sequência de cDNA do banco de dados do NCBI. Vá para a pesquisa BLAT humana para obter o alinhamento do DNA genômico.
  2. Clique na guia "navegador" para visualizar a montagem do gene. Na guia "Visualizar", clique em "DNA" para obter a sequência completa de DNA genômico no formato FASTA.
  3. Localize o códon de parada dentro da sequência de DNA, onde a sequência 2A e o repórter serão marcados.
  4. Procure o motivo adjacente do protoespaçador (PAM, ou seja, NGG) dentro da vinicidade (~ 100 bp flanqueando a área) do códon de parada. Escaneie ambas as fitas para localizar a sequência NGG apropriada. Considere a especificidade das sequências upstream para evitar possíveis eventos fora do alvo. Use ferramentas de software livre, como BLAST e CasOT (consulte a Etapa 5 para obter detalhes).
  5. Copie a sequência de 20 bases imediatamente a montante do NGG e cole-a na ferramenta de web design ZiFit para projetar oligos com saliências compatíveis com o vetor de expressão de gRNA humano (com promotor U6) MLM3636.
  6. Sintetize oligos diretos e reversos 7.
  7. Para fazer sgRNA de fita dupla, desnature ambos os oligos a 70 ° C por 15 min e esfrie gradualmente até RT. Para uma reação de 50 μl, adicione 22,5 μl de oligos direto e reverso (a concentração de estoque é de 0,1 mM), respectivamente, e 5 μl de tampão de recozimento (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
  8. Misturar e ligar os oligos obtidos no passo 2.7 com o vector de expressão de gRNA humano digerido por BsmBI (com promotor U6) MLM3636. Para uma reação de 20 μl, adicione 1 μl de oligos da Etapa 2.7, 100 ng de MLM3636 e 1 μl (400 U) de T4 ligase. Incubar em RT O/N.
  9. Transforme as células competentes DH5α com o produto de ligação por choque térmico a 42 ° C por 30 segundos. Cultive as bactérias em uma placa de ampicilina de ágar LB (100 μg / ml) a 37 ° C O / N. Escolha 3 ~ 5 colônias para miniprep de plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Sequencie o DNA do plasmídeo para confirmar usando fornecedores comerciais. Maxiprep o plasmídeo correto de acordo com o protocolo do fabricante.
  10. Avalie o sgRNA pelo ensaio de endonuclease 1 T7 (T7E1) (consulte a Etapa 4 para obter detalhes). O hiPSC transfecto com o plasmídeo e o sgRNA será expresso sob o promotor U6 embutido no backbone MLM3636 (consulte a etapa 6 para obter detalhes).

3. Projeto e construção de Cas9n Double Nickase sgRNA

  1. Obtenha o vetor de dupla nickase Cas9n D10A pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
  2. Projete um par de oligos diretos e reversos para cada locus de direcionamento. Copie a sequência de 20 bases imediatamente a montante do NGG, conforme descrito na Etapa 2, e cole-a na ferramenta de web design ZiFit
  3. Para obter oligos com saliências compatíveis com pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), remova a primeira e a última base dos oligos diretos e reversos mostrados pela ferramenta de design ZiFit.
  4. Sintetizar oligos para frente e para trás7. Nomeie esses oligos como f(n)-F, f(n)-R para PAMs em um lado do local alvo, r(n)-F, r(n)-R para PAMs no outro lado do local alvo. Destes, n é o número para designar diferentes PAMs, f e r minúsculos representam a localização dos PAMs na fita sentido (f) ou antisentido (r), F e R representam oligos diretos e reversos.
    1. Teste vários pares (por exemplo, r5 e f2) usando o ensaio T7E1 (detalhado na Etapa 4) para identificar o par otimizado de sgRNAs a ser usado para Cas9n.
  5. Para fazer sgRNA de fita dupla, desnature ambos os oligos a 70 ° C por 15 min e esfrie gradualmente até RT. Para uma reação de 50 μl, adicione 22,5 μl de oligos direto e reverso (a concentração de estoque é de 0,1 mM), respectivamente, e 5 μl de tampão de recozimento (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
  6. Misturar e ligar os oligos obtidos no passo 3.5 com pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n digerido por BbsI (D10A). Para uma reação de 20 μl, adicione 1 μl de sgRNA da Etapa 3.5, 100 ng de Cas9n (D10A), 1 μl (400 U) de T4 ligase. Incubar em RT O/N.
  7. Transforme as células competentes DH5α com o produto de ligação por choque térmico a 42 ° C por 30 segundos. Cultive as bactérias em placa de ampicilina de ágar LB (100 μg / ml) a 37 ° C O / N. Escolha 3 ~ 5 colônias para minipreparação de plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Sequencie o DNA do plasmídeo para confirmar usando fornecedores comerciais. Maxiprep o plasmídeo correto de acordo com o protocolo do fabricante.
  8. Avalie o sgRNA pelo ensaio T7E1 (consulte a Etapa 4 para obter detalhes). O hiPSC transfecto com o plasmídeo e o sgRNA será expresso sob o promotor U6 integrado no backbone Cas9n (D10A) (consulte a etapa 6 para obter detalhes).

4. Avaliação de sgRNAs pelo ensaio de endonuclease1 T7 (T7E1)

  1. Para uma placa de 24 poços, coloque 2 x 105 células de 293 pés por poço um dia antes (dia -1).
  2. No dia da transfecção (dia 0), co-transfectar células 293FT com plasmídeo sgRNA e vetor de expressão Cas9. Adicione 0,5 μg de vetor sgRNA, 0,5 μg de vetor de expressão Cas9 JDS246 (Cas9-003) e 1,5 μl de Lipofectamine 2000.
    1. Para controle negativo, adicione 0,5 μg de vetor de expressão GFP (por exemplo, GFP acionado pelo promotor CMV em um backbone pcDNA3) em vez de vetores sgRNA.
  3. Após 72 horas (dia 3), colha as células adicionando 100 μl de tampão de extração rápida de DNA e triturando vigorosamente.
  4. Incubar a mistura a 68 °C durante 15 min, depois a 95 °C durante 8 min. Este é o modelo para os experimentos de PCR subsequentes.
  5. Projete primers de PCR direto e reverso para amplificar a sequência que flanqueia o PAM. Normalmente, o produto de PCR direcionado tem cerca de 400-500 pb de comprimento. Sintetize os oligos7.
  6. Para uma reação de PCR de 50 μl, adicione 1 μl de molde da Etapa 4.5, 0,5 μl de Herculase II, 0,5 μl de DMSO, 10 μl de tampão 5x, 0,5 μl de mistura dNTP e 1 μl de mistura de primer direto e reverso.
  7. Use os seguintes parâmetros de PCR: 98 °C por 2 min, 35 ciclos de 98 °C por 20 seg, 59 °C por 20 seg, 72 °C por 1 min, com uma extensão final a 72 °C por 5 min.
    Nota: Os parâmetros de PCR descritos aqui produzem produtos específicos para vários genes testados. No entanto, essas condições dependem de genes de interesse escolhidos pelo usuário. As PCRs que usam DNA genômico como modelo geralmente requerem otimização para garantir que nenhuma banda extra apareça. Essas bandas extras podem ser confundidas com produtos de clivagem após o ensaio T7E1.
  8. Meça a concentração de DNA dos produtos de PCR usando um espectrômetro em A260.
  9. Adicione 400 ng de produtos de PCR a 2 μl de tampão de digestão 2. Adicionar ddH2O a um volume de reação final de 19 μl. Incube em água fervente por 5 min. Deixe a reação descansar no banco e esfrie naturalmente até RT (45-60 min).
  10. Adicione 1 μl (10 unidades/μl) de T7E1, incube a 37 °C por 15 min. Pare a reação adicionando 2 μl de EDTA 0,25 M misturado com 6x DNA Loading Dye.
  11. Dissolver 2,5 g de agarose em pó para 100 ml de 1xTAE. Microondas a mistura e despeje o gel em uma caixa de gel. Quando o gel for formado, carregue toda a reação de 20 μl no gel de agarose a 2,5%. Execute o gel a 100-150 V por 30 min.
  12. Inspecione o gel sob luz ultravioleta (Figura 3). T7E1 corta nos locais incompatíveis. Para sgRNAs que causaram junção de extremidade não homóloga, os produtos de PCR mostrarão bandas de migração rápida adicionais (menores em tamanho) em comparação com o controle negativo (descrito na etapa 4.3).
  13. Estime e classifique a eficiência de corte do sgRNA e a porcentagem de inserção e deleção (indel%) comparando a densidade da banda usando o software Image J.
    1. Para cada amostra que escorrer no gel, designe as bandas de gel como banda não cortada, banda cortada 1 e banda cortada 2.
    2. Meça a densidade de cada banda usando o ImageJ de acordo com o manual do software.
    3. Calcule fcorte usando a seguinte fórmula: fcorte = (faixa de corte 1 + banda de corte 2) / (faixa não cortada + banda de corte 1 + banda de corte 2)
    4. Calcule Indel% usando a seguinte fórmula: Indel=1- √(1-fcorte).

5. Previsão in silico de potenciais locais fora do alvo

Nota: Potenciais sites fora do destino podem ser previstos usando uma ferramenta de código aberto online chamada CasOT17, que é um programa baseado em Perl.

  1. Para um sistema Windows, baixe o programa CasOT e os arquivos do banco de dados do genoma humano para o disco rígido local.
  2. Prepare o arquivo de destino do sgRNA projetado no formato FASTA.
  3. Abra o arquivo chamado "casot". Uma janela de comando é exibida. Deixe como está por enquanto.
  4. Abra o arquivo chamado "opt-generator" para gerar a string de opções. Cole o caminho e o nome do arquivo de destino na caixa de diálogo da opção "-t" ou "-target".
  5. Cole o caminho do arquivo de sequência do genoma na caixa de diálogo da opção "-g" ou "-genoma".
  6. Valores de entrada de –s ou –seed (o valor padrão é 2) e –n ou -nonseed (o valor padrão é 255). A string de opção é gerada e aparecerá na caixa na parte superior da página.
  7. Copie a string de opção e cole-a na janela de comando CasOT descrita na Etapa 5.3.
    Nota: Pode levar de 30 a 90 minutos para executar o programa CasOT, dependendo das opções e do computador usado. Depois de concluído, uma pasta chamada '--' será gerada. Dois arquivos serão incluídos na pasta, um arquivo ".stat" descrevendo as estatísticas e um arquivo .csv (valores separados por vírgula) contendo os resultados detalhados da pesquisa.
  8. Abra o arquivo .csv com um programa de planilha. As seguintes informações são fornecidas no arquivo para cada local fora do alvo: localização cromossômica e genômica, sequência do local, tipo de incompatibilidade (Mm), número total de bases incompatíveis e informações de éxons relacionadas ao local fora do alvo.
  9. Projete primers de PCR para os locais que têm <2 Mm na sequência de sementes ou não sementes.
  10. Realize PCR para clone hiPSC positivo selecionado usando as seguintes condições: 98 ° C por 2 min, 35 ciclos de 98 ° C por 20 seg, 59 ° C por 20 seg, 72 ° C por 1 min, com uma extensão final a 72 ° C por 5 min.
    Nota: Os parâmetros de PCR descritos aqui produzem produtos específicos para vários genes testados em nosso laboratório. No entanto, essas condições dependem de genes de interesse escolhidos pelo usuário. As PCRs que usam DNA genômico como modelo geralmente requerem otimização para garantir que nenhuma banda extra apareça.
  11. Sequencie os produtos de PCR, alinhe os resultados do sequenciamento com as sequências previstas e procure mutações. Se existirem mutações, os eventos fora do alvo serão identificados.

6. Eletroporação de hiPSCs para fazer repórteres de linhagem neural

  1. HiPSCs de cultura em meio TeSR-E8 em placas revestidas com Geltrex. Troque o meio por meio MEF-CM (meio condicionado de fibroblastos embrionários de camundongo) dois dias antes da eletroporação. Incubar em 2 ml de Accutase durante 5 min e recolher as células.
  2. HiPSCs eletroporados com vetor de direcionamento linearizado, vetor de expressão Cas9-003 e vetor de sgRNA usando as seguintes condições: 1 x 107 hiPSCs, co-transfectar 2,5 μg de sgRNA, 2,5 μg de Cas9 e 50 μg de vetor de direcionamento. Para a estratégia de nickase dupla, adicione 50 μg de vetor de direcionamento, 2,5 μg de cada sgRNA (com Cas9n co-expresso pelo vetor).
  3. Selecione clones por seleções positivas e negativas, conforme descrito24,25.
  4. Identifique clones positivos por análise de Southern blot ou PCR genômico de longo alcance24,25.

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Resultados

Vetores de direcionamento com todos os componentes necessários, incluindo braços de homologia, cassete de repórter e cassetes de seleção positiva e negativa, são construídos (Figura 1). Com base no locus genômico endógeno, múltiplos (2 a 3) sgRNAs (se utilizando o sistema Cas9) ou pares de sgRNA (se utilizando a estratégia de duplo cortador Cas9n) são projetados e construídos nos vetores de expressão de gRNA humano MLM3636 ou pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) (Figura 2). Antes da ...

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Discussão

O direcionamento genético é uma ferramenta essencial na caracterização das funções gênicas. No entanto, a eficiência relativamente baixa exige trabalho intensivo e demorado. Recentemente, o desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhorou muito a eficiência do direcionamento. Este manuscrito descreve um protocolo para gerar repórter de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) específicas da linhagem usando...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Neurocirurgia, Fundação Memorial Hermann Staman Ogilvie Fund, Bentsen Stroke Center do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Houston e Mission Connect TIRR Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
pStart-KAddgene20346
pWS-TK6 Addgene20350
pKD3 Addgene45604
pKD46The Coli Genetic Stock Center, CGSC7634
PGK-neo-bpA sequência Addgene13442
clones BAC humanos de genes-alvo 
JDS246 (Cas9-003), Streptococcus pyogenes Cas9-3X otimizado para códons de mamíferosFlag Addgene43861
MLM3636, Vetor de expressão de gRNA humano com promotor U6 Addgene43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)Addgene42335
design de sgRNA, ZiFithttp://zifit.partners.org/ZiFiT/
Ferramenta de previsão de alvo CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA Síntese de primerSigma
One shot Top10 Electrocomp E. Coli Células competentesLife TechnologiesC4040-50
AccuPrime Pfx SupperMixLife Technologies12344-040
Enzimas de restriçãoNEB e Life Technologies
Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanZymo ResearechD4007
 Polimerases
Agilent Technologies600675
Tampão de Digestão 2New England Biolab
6X DNA Loading DyeKit Thermo ScientificR0611
TeSR-E8 para Manutenção hESC/hiPSCStem Cell Technologies05940
UltraPure Agarose Life Technologies16500-100
50xTAELife TechnologiesB49
Essential 8 médio Tecnologias de VidaA1517001
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésioLife TechnologiesA12856-01
D-MEM/F12 com Glutamax Life Technologies10565018
D-MEM com Glutamax Life Technologies10566040
Soro Fetal Bovino-ES qualificado por células Life Technologies10439
Substituição de soro Knockout Life Technologies10828010
2-mercaptoetanol 1000X Life Technologies21985023
Aminoácidos Não Essenciais Life Technologies11140050
Stempro Accutase Tecnologias de VidaA1110501
Exibir Life Technologies17105-041
0.25% Tripsina- Solução EDTA Life Technologies25200-056
Geltrex Tecnologias de Vida     12760-013
inibidor de ROCK Y-27632Millipore    SCM075
SMC4 reagente BD354357
MEF resistente à neomicina MilliporePMEF-NL
Resistente à higromicina MEF MilliporePMEF-HL
G418 (Geneticina)LifeTechnologies11811
Hygromycin B Life Technologies10687010
FIAU (Fialuridina, 1-2-Desoxi-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosil-5-iodouracil  Moravek Bioquímica e Radioquímica&nbsp;   M251
Electroporator: Gene Pulser Xcell Cubeta de eletroporação Bio-Rad
0,4 cm Bio-Rad165-2088
DIG-Kit inicial de marcação e detecção de DNA de alta potência II deda Roche
VWR82021-478
Kit de síntese de sonda PCR DIG Conjuntode lavagem Roche 11636090910
DIG Roche11585762001
Anti-Digoxigenina (DIG-AP)SistemaRoche 11093274910
CSPD Conjuntode
DIG Roche11585762001
tampão TAE 50X Life Technologies24710030
Tampão de Blotting (25 mM Tris pH 7.4,  0.15 M NaCl,  0.1% Tween20)
Hoefer Ultraviolet Crosslinker Fisher Scientific03-500-308
Espermidina FisherAC13274-0010
Tris HCl 2M (pH 7.5)VWR    200064-506
Denville Scientific blue bio film 8x10 Fishernc9550782
Marcador de peso molecular de DNA II ( Marcado com DIG )Roche11218590910
Amersham Membrana de Blotting Hybond-N+ Pyrex Roche95038-400
 Toalhas15-242A
Kimberly-Clark Papel Fisher06-666-32B
Whatman 3MM (26X41)Fisher    05-713-336
Bolsa de hibridização TubosRoche 11666649001
 Fisher13-247-300
Forno de Hibridização Rotisserie Shake 'n' Stack FisherHBMSOV14110
https://bacpac.chori.org Tampão de extração rápida de DNA de DNA de Fusão Herculase II Epicentre QE0905T Solução desnaturação de hibridização 11585614910 de quimioluminescência buffer de lavagem e bloco Roche 11755633001 Bandeja de secagem de vidro de papel dobráveis Fisher de hibridização

Referências

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