Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Shenglan Li; Haipeng Xue; Bo Long; Li Sun; Tai Truong; Ying Liu

doi:10.3791/52539

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Artigo de método

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

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DOI:

10.3791/52539

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28 de maio de 2015

Shenglan Li^*¹^,² , Haipeng Xue^*¹^,² , Bo Long¹^,²^,⁵ , Li Sun¹^,²^,⁶ , Tai Truong¹^,²^,⁴^,⁷ , Ying Liu¹^,²^,³

¹Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, ²Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, ³The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, ⁴Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, ⁵Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, ⁶Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, ⁷Biology Department, University of West Georgia

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Resumo

Gene segmentação é uma abordagem crítica para a caracterização de funções de genes na pesquisa biomédica moderna. No entanto, a eficiência do direccionamento de genes em células humanas tem sido baixa, o que impede a geração de linhas celulares humanas, a uma taxa desejada. Os últimos dois anos têm testemunhado uma rápida progressão na melhoria da eficiência de manipulação genética por ferramentas de edição de genoma, tais como o sistema / Cas (associada à CRISPR) CRISPR (cluster regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete). Este manuscrito descreve um protocolo para a geração humana induzida em células estaminais pluripotentes (hiPSC) repórteres específicos de linhagem utilizando o sistema CRISPR / Cas assistida recombinação homóloga. Os procedimentos para a obtenção de componentes necessários para a tomada de linhas de linhagem repórter neurais utilizando o sistema CRISPR / Cas, com foco na construção de segmentação vetores e RNAs única guia, são descritos. Este protocolo pode ser estendido para estabelecimento plataforma e correcção mutação em hiPSCs.

Introdução

O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), juntamente com outras ferramentas de edição do genoma, revolucionou a manipulação do genoma humano nos últimos anos^1-7. Os principais componentes do sistema CRISPR/Cas9 são RNA guia único (sgRNA) e Cas9. Cas9 é uma endonuclease de DNA tipo II guiada por RNA. Possui dois domínios de nuclease, HNH e RuvC, que são responsáveis por fazer quebras de fita dupla (DSBs) de DNA em uma região genômica específica próxima a um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) ^7-10. Um sgRNA tem uma função combinada de crRNA e tracrRNA, duas moléculas de RNA de imunidade adaptativa ident....