O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), juntamente com outras ferramentas de edição do genoma, revolucionou a manipulação do genoma humano nos últimos anos1-7. Os principais componentes do sistema CRISPR/Cas9 são RNA guia único (sgRNA) e Cas9. Cas9 é uma endonuclease de DNA tipo II guiada por RNA. Possui dois domínios de nuclease, HNH e RuvC, que são responsáveis por fazer quebras de fita dupla (DSBs) de DNA em uma região genômica específica próxima a um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) 7-10. Um sgRNA tem uma função combinada de crRNA e tracrRNA, duas moléculas de RNA de imunidade adaptativa identificadas em bactérias (como Streptococcus pyogenes) e archaea para lutar contra a invasão de DNA de fontes exógenas9-11. Quando adequadamente projetado e co-introduzido em células de mamíferos, o sgRNA reconhece a sequência PAM, pares de bases com a fita complementar do DNA alvo e guia e transativa Cas9 para clivar em ambas as fitas de DNA imediatamente a montante do PAM7. Posteriormente, ocorrerá recombinação dirigida homóloga (HDR, na presença de um vetor de direcionamento) ou junção de extremidade não homóloga (NHEJ) para reparar os DSBs. Transgenes como cDNAs, repórter ou fragmentos resistentes a antibióticos podem ser integrados e linhas transgênicas ou knockin feitas.
Embora o sistema CRISPR/Cas9 seja altamente eficiente e relativamente específico, atividades indesejadas fora do alvo foram relatadas12-15. Para minimizar eventos fora do alvo, as nickases Cas9 (Cas9n) também foram projetadas9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A ou Cas9 H840A) é uma enzima Cas9 com mutações em um dos dois domínios de nuclease, que provoca apenas um corte em uma fita de DNA. Para obter clivagem em ambas as fitas, dois sgRNAs são projetados para guiar um par de nickases, que cortam separadamente em loci próximos das duas fitas de DNA diferentes. A estratégia de "corte duplo" requer um design mais rigoroso do que a plataforma Cas9 convencional e oferece alta eficiência e alta especificidade para experimentos de edição de genes.
Este manuscrito descreve um protocolo para gerar repórter de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) específicas da linhagem usando recombinação homóloga assistida pelo sistema CRISPR/Cas. São descritas as etapas para obter os componentes necessários para fazer linhas repórter de linhagem neural usando a edição de genoma mediada pelo sistema CRISPR/Cas, com foco na construção de vetores de direcionamento e sgRNAs. Este protocolo foi repetido com sucesso em várias linhagens de hiPSC, incluindo aquelas derivadas de indivíduos saudáveis e de pacientes com doenças do SNC. Os genes direcionados em nosso laboratório incluem OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 e SOD1. A eficiência de direcionamento da recombinação homóloga mediada pelo sistema CRISPR/Cas em hiPSCs varia de 20 a 40%, o que é consistente com relatórios anteriores1,18,19. Em comparação com uma eficiência típica de 1-2% em experimentos convencionais de direcionamento de genes, a eficiência de direcionamento é significativamente melhorada.