É apresentada uma estratégia para analisar quantitativamente os dados histológicos na medula óssea. A microscopia confocal de células marcadas com fluorescência em seções de tecido resulta em imagens bidimensionais, que são analisadas automaticamente. As análises de co-localização de diferentes tipos de células são comparadas com dados de imagens simuladas, fornecendo informações quantitativas sobre as interações celulares.
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Artigo de método
Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia confocal é o método de escolha para a análise da localização de vários tipos de células presentes nos tecidos complexos, tais como a medula óssea. No entanto, a análise e quantificação de localização celular é difícil, já que em muitos casos, depende de contagem manual, tendo, assim, o risco de introduzir um viés dependente avaliadores e reduzindo a confiabilidade entre examinadores. Além disso, muitas vezes é difícil avaliar se a co-localização entre duas células resulta de posicionamento aleatório, especialmente quando tipos de células diferem fortemente da frequência de sua ocorrência. Aqui, um método para a quantificação isenta de co-localização celular na medula óssea é introduzido. O protocolo descreve a preparação da amostra para se obter secções histológicas de ossos longos de murino inteiros, incluindo a medula óssea, bem como o protocolo de coloração e a aquisição de imagens de alta-resolução. Um fluxo de trabalho de análise que vai desde o reconhecimento da hematopoiética e não hemattipos de células opoietic em 2 dimensões imagens de medula (2D) osso para a quantificação dos contactos directos entre as células é apresentado. Isto também inclui uma análise de vizinhança, para se obter informações sobre o microambiente celular em torno de um determinado tipo de célula. A fim de avaliar se a co-localização dos dois tipos de células é a mera função do posicionamento de célula ou aleatório reflecte associações preferenciais entre as células, uma ferramenta de simulação, que é adequado para testar esta hipótese, no caso de células hematopoiéticas, assim como as células do estroma, é utilizado. Esta abordagem não é limitada para a medula óssea, e pode ser alargado a outros tecidos para permitir a análise reprodutível, quantitativa dos dados histológicos.
Introdução
Devido a recentes desenvolvimentos tecnológicos rápidos na microscopia, incluindo imageamento óptico, a análise de células dentro do contexto de todo o tecido tornou-se cada vez mais acessível para os imunologistas. A caracterização de células individuais em suspensão representa um método valioso e indispensável para compreender a função celular e molecular. No entanto, a análise das células dentro do seu (micro) -anatomical ambiente é essencial para a compreensão das interacções entre os vários tipos de células que colaboram com os processos complexos, tais como o desenvolvimento de respostas imunitárias.
Embora seja relativamente fácil ....
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Protocolo
As experiências com animais foram aprovados pelos comitês estaduais apropriadas para bem-estar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) e foram realizados de acordo com as diretrizes atuais e regulamentos (licença de experiência com animais G0194 / 11).
1. Produção de fluorescente de Medula Óssea Ratos quiméricos
NOTA: A geração de medula óssea fluorescente ratinhos quiméricos para visualizar as células do estroma da medula óssea é realizado tal como descrito antes 9.
- Iniciar o tratamento Del-Cre x ratos ROSA-tdRFP (camundongos que expressam a proteína fluorescente vermelha ....
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Resultados
Cortando criocortes de osso descalcificada com o método de Kawamoto fita permite que todo o osso a ser cortado como uma secção intacta, com a medula óssea da região endosteal ainda ligado ao osso mineralizado, tanto na diáfise, bem como nas áreas da epífise com a sua alta densidade do osso trabecular (Figura 1). A coloração nuclear das secções revela que, apesar de pequenas fendas na preparação não pode ser totalmente evitado, a estrutura das artérias e sinusóides, bem como a rede reticular do parênquim.......
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Discussão
Apesar dos avanços nos métodos de imagem óptica modernos, a análise dos dados histológico ainda é muitas vezes dificultada pela falta de ferramentas adequadas e métodos de quantificação, ou por análises tendenciosas que se concentram em uma pequena área de interesse. A abordagem sinérgica aqui apresentada combina análise de imagem cobrindo toda a região de medula óssea, a segmentação automatizada e detecção de objectos de vários tipos de células hematopoiéticas e estromais, análise de co-localização, e, finalmente, uma .......
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Divulgações
Juan Escribano Navarro é afiliado à Wimasis GmbH, Munique, Alemanha. Os demais autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos Andreas Radbruch pelas valiosas discussões. Somos gratos a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde para assistência com cuidados com os animais e Robert Günther para excelente assistência técnica. Agradecemos aos nossos avaliadores treinados Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache e Katharina Chifre para avaliação das amostras histológicas e Randy Lindquist para revisão do manuscrito. Agradecemos J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, EUA para anticorpos MBP-específicas.
Este trabalho foi apoiado por DFG HA5354 / 4-1, por JIMI-a concessão da rede facilidade DFG núcleo par....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Neomicina |  Sigma | N6386 SIGMA | Sais hidratados de trissulfato de neomicina, código de perigo UE: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contém: 50.000 I.E. palmitato de retinila, 5.000 I.E. colecalciferol, 30 mg de acetato de tocoferol, 100 mg de ácido ascórbico, 1 mg de ácido sórbico, 200 mg de óleo de rícino polioxil 35, 0,5 mg de galato de propila | |
| Tampão de transferência (100 ml PBS, 1 ml HEPES 1 M, 50 U/ml penicilina/estreptomicina) | Sigma | P4333, H3375 | |
| Hapteno 4-hidroxi-3-nitrofenilacetil conjugado à gama globulina de galinha | |||
| Gama globulina de galinha (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | |
| Solução de paraformaldeído a 20% (grau EM) | Science Services | 15713 | Códigos de perigo UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| Sacarose D(+) | Carl Roth | 4621.1 | |
| Gelo seco | |||
| Acetona | Sigma-Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | Códigos de perigo UE: GHS02, GHS07 |
| Hexano | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | Códigos de perigo UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Moldes criogênicos Tissue-Tek (padrão) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | |
| Meio de inclusão SCEM de Kawamoto | Section-Lab, JP | ||
| Kit de preparação de crioseções de Kawamoto | Section-Lab, JP | ||
| Cryofilm tipo 2C(9) de Kawamoto | Section-Lab, JP | ||
| Lâmina de micrótomo MX35 premier plus, perfil baixo | Thermo Scientific | 3052835 | L X C: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), espessura: 0,25 mm (0,01") |
| Anticorpo policlonal de coelho anti-RFP, biotinilado | Rockland | 600-406-379 | |
| Estreptavidina Alexa Fluor 555 | Life Technologies | S-32355 | |
| Rato anti-MBP | J. e N. Lee | disponível em: J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, EUA, clone MT-14.7 | |
| Cabra anti-rato-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | |
| Rato anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produzido e conjugado internamente (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 da Life Technologies | ||
| Anti-cadeia leve l1 de camundongo -FITC | produzido e conjugado internamente (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rato anti-cadeia leve k - FITC | produzido e conjugado internamente (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol diidrocloridrato) | Sigma | D9542 SIGMA | |
| Meio de montagem fluorescente | DAKO | S3023 | |
| Lâminas de cobertura (24 x 24 x 0,13-0,16 mm) | Carl Roth | H875.2 | |
| Lâminas Superfrost (75 x 25 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Microscópio confocal de varredura a laser | equipado com linhas a laser de 405, 488, 561, 594, 633 nm e uma objetiva aérea de 20X/0,8 NA. Utilizamos um Zeiss LSM710 e o software Zen 2010 Versão 6.0. | ||
| Ferramentas automatizadas de análise de imagem para medula óssea | Wimasis, Munique | A ferramenta de contato celular e a ferramenta de proximidade celular estarão disponíveis mediante solicitação à Wimasis. | |
| Runtime VC2012 | Microsoft | download gratuito | |
| Ferramenta de simulação para posicionamento celular aleatório | disponível conosco, mediante solicitação | ||
| Software de análise de imagem com funções de segmentação de imagem | Utilizamos o Volocity (Perkin Elmer) para medir as distribuições de tamanho celular de tipos celulares hematopoiéticos na medula óssea (Figura 5). Alternativas são o Definiens Image Analysis (Definiens) ou o Cell Profiler (download gratuito) | ||
| Software de análise de imagem Fiji | download gratuito. O Fiji foi utilizado por avaliadores treinados para contagem celular manual (Figura 3). |
Referências
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2....
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Reimpressões e permissões
