Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Resumo

A genética do camundongo oferece uma ferramenta poderosa para determinar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento. A análise dos fenótipos resultantes por métodos imuno-histoquímicos e moleculares fornece informações sobre potenciais genes-alvo e vias de sinalização. Para elucidar ainda mais mecanismos regulatórios específicos, é necessário um sistema que permita a manipulação de apenas um pequeno número de células de um tecido específico por superexpressão, ablação ou reintrodução de genes específicos e siga seu destino durante o desenvolvimento. Para conseguir isso, a eletroporação ex utero das estruturas do hipocampo, especialmente o giro denteado, seguida de cultura de fatias organotípicas, fornece essa ferramenta. O uso desse sistema para gerar deleções em mosaico permite determinar se o gene de interesse regula os processos de desenvolvimento autônomos da célula, como proliferação de células progenitoras ou diferenciação neuronal. Além disso, facilita o resgate de fenótipos ao reintroduzir o gene deletado ou seus genes-alvo. Em contraste com a eletroporação in utero, a abordagem ex utero melhora a taxa de atingir com sucesso as camadas mais profundas do cérebro, como o giro denteado. No geral, a eletroporação ex utero e a cultura de fatias organotípicas fornecem uma ferramenta potente para estudar mecanismos regulatórios em um ambiente semi-nativo que espelha as condições endógenas.

Introdução

O hipocampo desempenha um papel importante na memória e aprendizagem, bem como o comportamento emocional. Uma função principal consiste na consolidação da memória de curto prazo em memória de longo prazo, que requer alta plasticidade do sistema nervoso. O giro denteado do hipocampo actua como primário para a porta de entrada de informação de entrada e é também uma das duas regiões do cérebro com a neurogénese contínuo ao longo da idade adulta ^1,2. O desenvolvimento da estrutura do hipocampo ocorre durante a embriogénese tardia e particularmente durante os primeiros 3 a 4 semanas pós-natal ^3. Durante o desenvolvimento inicial do giro denteado um pool de células-tronco é estabelecida necessário para pós-natal, bem como a neurogênese adulta ^4. Neurônios em desenvolvimento passam por várias etapas, desde a célula-tronco por várias fases de células progenitoras para os imaturos e, finalmente, o neurônio maduro durante a pós-natal, bem como neurogênese adulta. Em diferentes estádios da neurogénese a expressão degenes específicos é necessária para permitir a maturação e integração de novos neurónios do hipocampo para o circuito ^5,6.

Usando mouse genética e análise de fenótipo por imuno-histoquímica, bem como métodos moleculares permitiu definir o padrão de expressão e função de muitos destes genes. Além análise microarray, bem como imunoprecipitação da cromatina (CHIP) forneceram informações sobre possíveis genes alvos diretos e indiretos ^7,8. No entanto, ainda há muitas questões em aberto sobre os mecanismos de regulação do desenvolvimento do hipocampo, em particular o desenvolvimento do giro denteado. Para obter mais conhecimentos específicos como os genes são regulados de um sistema é necessário permitir que a manipulação de um pequeno número de células por jusante ou a sobre-regulação do gene de interesse e / ou dos seus genes-alvo e seguir o seu destino durante o desenvolvimento. No útero electroporação de shRNAs, cDNA de genes de interesse ou Cre recombinase oferece essa ferramenta. Para assegurar a presença do DNA desejado ou pequenos RNAs de plasmídeos de expressão deve ser utilizado para a electroporação. Esta abordagem é implementado com muito sucesso no estudo do desenvolvimento cortical ^9,10, mas é uma abordagem mais difícil de examinar o desenvolvimento do giro denteado, devido à posição das estruturas do hipocampo em camadas mais profundas do cérebro.

Eletroporação utero Ex seguido de cultura fatia organotípica é uma abordagem para contornar esse problema ^11,12. Em contraste no útero não electroporação todo o embrião, mas apenas a cabeça é usada, permitindo, por conseguinte, para colocar os eléctrodos de um modo mais favorável para dirigir o shRNA / DNA para o hipocampo e giro dentado. Nosso grupo empregada com sucesso ex utero eletroporação para estudar o papel do fator de transcrição Bcl11b durante o desenvolvimento do giro denteado ^8. Bcl11b tem um duplo papel no desenvolvimento do giro denteado por regulating proliferação de células progenitoras, bem como a diferenciação como foi demonstrado por imuno-histoquímica. Para definir ainda um mecanismo para o envolvimento Bcl11b nestes processos, os protocolos do grupo Polleux ^11,12 foram ajustados para estudar o giro denteado, conforme descrito abaixo na secção de protocolo. Numa primeira abordagem, a questão foi abordada se Bcl11b está regulando celular diferenciação de células neuronais de forma autônoma. A segunda abordagem examinou se desmoplakin, um gene alvo direto de Bcl11b, é suficiente para recuperar o fenótipo Bcl11b.

Protocolo

NOTA: Todas as experiências com animais foram realizados em conformidade com a lei alemã e foram aprovados pelos escritórios do governo em Tübingen.

1. Preparação de Micropipetas, Soluções e Membranas

1. Preparação de micropipetas
   1. Puxe micropipetas de vidro usando um extrator micropipeta com o seguinte programa: Calor: 540, Pull: 125, Velocidade: 20 e Delay: 140. Os valores comprimento da agulha para 5,5 cm.
   2. Agulhas cônicas usando um microgrinder para obter um tamanho adequado ponta de 4 mm. Armazene as agulhas em uma caixa ou 15 centímetros de Petri para evitar danos das dicas.
2. Preparação de Soluções
   1. O plasmídeo de DNA Solução
      1. Preparar DNA de plasmídeo contendo a construção de ADNc desejado utilizando um kit Maxi-prep livre de endotoxina de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Ajuste a solução de DNA do plasmídeo para uma concentração final de 3 mg / mL (GFP sem espigão vector) ou 4 ug /ul (com 1 ug de vector de GFP pico) em endotoxina libertar tampão Tris-EDTA contendo Fast Green (concentração final 0,05%).
   2. A laminina da solução
      1. Dissolve-se 1 mg de laminina em água estéril até um volume final de 1 ml. Prepare 100 mL alíquotas e armazenar a -80 ° C.
   3. A poli-L-lisina da Solução
      1. Dissolve-se 50 mg de poli-L-lisina em 50 ml de água estéril para uma concentração final de 1 mg / ml. Preparar alíquotas de 1 ml e loja em -20 ° C.
   4. Conclua solução salina equilibrada de Hank (HBSS completa)
      1. Prepare completa HBSS combinando 100 ml de HBSS 10x, 2,5 ml de 1 M de tampão HEPES (pH 7,4), 30 ml de 1 M de D-glucose, 10 ml de 100 mM CaCl _2, 10 ml de 100 mM de _MgSO4, e 4 ml de 1 M de _NaHCO3. Adicionar água estéril até 1 L e armazenar a 4 ° C.
         NOTA: Autoclave todas as soluções tampão de esperar de HEPES 1 M e 1 M de D-glicose, que são filter esterilizado.
   5. Slice Meio de Cultura
      1. Prepare fatia meio de cultura pela adição de 35 ml de Meio Basal de Eagle, 12,9 ml de HBSS completo (1.2.4), 1,35 ml de 1 M de D-glucose, 250 ul de 200 mM de L-glutamina, e 500 ul de penicilina-estreptomicina a obter um volume final de 50 ml. Adicionar soro de cavalo a uma concentração final de 5% e armazenar a 4 ° C.
   6. Low-Ponto de fusão (LMP) Agarose
      1. Prepara-se uma solução de agarose a 4% LMP por adição de 2 g de agarose LMP a 50 ml de HBSS completo (1.2.4), seguido por aquecimento num forno de microondas durante 1-2 minutos, a alta energia. Manter a solução num banho de água a 37-39 ° C. Guardar a solução a 4 ° C e reutilização.
   7. Solução paraformaldeído
      1. Numa hotte preparar uma solução a 4% de paraformaldeído (PFA) por adição de 4 g de paraformaldeído a 100 ml de PBS 1x. Aquece-se a solução para 60 ° C e adiciona-se algumas gotas de NaOH 1 N até que a solução se torna clear.
   8. Solução permeabilização
      1. Dissolve-se 9 g de BSA em 300 mL de PBS 1x contendo 0,3% Triton X-100 e armazenar a 4 ° C. Adicionar azeto de sódio a 10% para armazenamento a longo prazo.
3. Revestimento de Membrana inserções
   1. Dilui-se uma alíquota da solução de reserva de laminina (1.2.2) e uma aliquota de solução mãe de poli-L-lisina (1.2.3) em água estéril para um volume final de 12 ml.
   2. Coloque inserções de membrana em placas de 6 poços com cada poço contendo 2 ml de água estéril. Adicionar 1 ml de solução de revestimento por cima da membrana e incubar O / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2.
   3. Após a incubação, lavar a membrana insere três vezes com 1 ml de água estéril e seco. Use pastilhas membrana revestida no mesmo dia ou armazenar a 4 ° C por até quatro semanas em um seco placa de 6 poços.

2. Injecção de ADN e electroporação de embriões E15.5 e E18.5

1. Anestesiar uma vez acoplado rato fêmea, colocando-a dentro de uma câmara de anestesia saturado com 5% de isoflurano e ligado a um vaporizador. Circule isoflurano e oxigênio a uma taxa de 1 L / min. Mantenha o animal na caixa de 2-4 min ou até inconsciente, que é testada por beliscar entre as patas do mouse.
2. Eutanásia o mouse inconsciente por deslocamento cervical no dia embrionário (E) 15,5 ou 18,5. Dissecar o útero contendo os embriões ¹³ e colocá-lo em uma placa de Petri contendo 15-20 ml de frio HBSS completa.
   NOTA: A partir deste ponto em diante, manter os embriões e tecidos no gelo.
3. Use um par de tesouras para separar cada embrião do corno uterino e lugar para uma segunda placa de Petri contendo frio HBSS completa.
4. Sob um microscópio de dissecação, cortar a parede do músculo uterino e da placenta, usando um par de fórceps finos (# 55) e tesoura. Solte cuidadosamente o embrião a partir do saco vitelino.
5. Use um par de tesouras de Bona para decapitate os embriões só acima dos membros anteriores em um ângulo de 60 °. Se a experiência requer genotipagem dos embriões, recolher uma amostra de tecido para isolamento de ADN genómico (um pequeno pedaço da cauda).
6. Transfira a cabeça para um prato limpo e seco Petri. Porque a cabeça tinha sido decapitado em um ângulo de 60 °, a cabeça deve inclinar para um lado quando colocado dorsal para cima.
7. Coloque uma agulha cuidadosamente para o meio do hemisfério perto da bregma (Figura 1A, B). Injectar cerca de 2-3 ul (em 3 ou 4 ug / uL) de solução de ADN por pisar o pedal do Picospritzer III usando 30 libras de pressão durante o período de 10-15 ms por impulso, aplicando impulsos de 5-8. A duração e número dos impulsos depende do diâmetro da abertura de agulha com aberturas menores que precisam de mais tempo. O intervalo entre cada pulso corresponde a 1 seg.
8. Antes da colocação dos eletrodos, aplique algumas gotas de HBSS completa sobre a cabeça do embryo. Colocar os eléctrodos de tal maneira que o terminal de "negativo" é no mesmo lado que o ventrículo injectado e o eléctrodo "positivo", no lado oposto do ventrículo injectado abaixo da orelha da cabeça do embrião (figura 1C, D). Aplicar 5 pulsos de 50 V.
   1. Use 3 eletrodos mm para 15,5 E e 5 mm para eletrodos E 18.5.

3. Dissecção do Cérebro

1. Após a electroporação, descasca a pele da cabeça, com a ajuda de um par de fórceps finos. Utilizando um par de tesouras de mola fazer uma pequena incisão no meio do cerebelo na linha média do crânio.
2. Insira a tesoura primavera na incisão e cortar longitudinalmente ao longo da sutura sagital. Retire o crânio e separar o cérebro do crânio usando uma pinça fina. Transferir todo o cérebro em 15-20 ml frio solução HBSS completa.
3. Enquanto isso, coloque 4% LMP agarose,mantida a 37-39 ° C num banho de água, para um molde de casca-de distância.
4. Leve o cérebro para fora do HBSS completa por uma pequena espátula colher e drenar o excesso de HBSS usando lenço de papel fino ou Kimwipes.
5. Coloque todo o cérebro suavemente para dentro da agarose e ajustar a sua posição com uma agulha fina. Mantenha o molde em gelo até a agarose é solidificada e o bloco é segmentado (por cortes coronais os bulbos olfatórios apontar para cima).

4. Vibratome Seccionamento e Cultura Slice

1. Apare os blocos de agarose LMP e cola-los para o palco amostra usando 'super cola ". Depois de a cola de transferência é seca a fase espécime para a bandeja de tampão de vibratome e encher com gelo frio completar HBSS até que o bloco está imerso na solução.
   NOTA: Esterilizar todas as superfícies de instrumentos e equipamentos com etanol a 70% antes do corte.
2. Prepare 250 mm seções vibratome grossas usando uma lâmina nova como seguida.
   1. Apare o wi blocoth as seguintes configurações; freqüência - 60 Hz, amplitude - 0,7 mm, velocidade de 16-18 mm / sec. Corte as seções que contêm o tecido desejado com as configurações acima em velocidade lenta (9 mm / seg). Iniciando o seccionamento do cérebro posterior, recolher 5-7 seções do cérebro.
   2. Transfira as seções para uma placa de cultura de 6 bem limpo contendo 5 ml de gelo frio completar HBSS com a ajuda de uma espátula dobrado e manter em gelo até que todas as seções são coletados (Figura 1E).
3. Humedecer a membrana de forma cruzada com 100 ul de HBSS completa antes de colocar as secções sobre a membrana, a fim de facilitar a orientação das secções.
4. Transfira as seções usando uma espátula dobrado sobre a membrana (pegar um canto da seção com uma pinça e puxe para a espátula e, em seguida, use a pinça para empurrar a seção sobre a membrana). Coloque até cinco seções em uma membrana e organizar por usando uma pinça (Figura 1F). Não sobreponha as seções com os outros.
   1. Tirar o excesso de HBSS fora da membrana utilizando uma pipeta. As membranas específicas utilizadas aqui estão ligados a uma armação e inserido na placa de cultura de tecido, o que permite que o tecido estar em contacto, mas não coberta pelo meio.
5. Coloque as inserções de membrana numa placa de 6 poços contendo 1,8 ml de meio de cultura de fatia (1.2.5) (Figura 1G, H). Incubar a placa de cultura a 37 ° C com 5% de CO ₂ por 11 ou 14 DIV DIV. Mudar metade do meio (0,9 ml) a cada segundo dia.
   NOTA: Nesta fase, adicionar reagentes como bromodeoxiuridina (BrdU; 10 mM concentração final) para a rotulagem proliferação de células para a mídia pela primeira 20 horas do tempo de cultura.

5. A fixação das Seções Seguido por Imunofluorescência Coloração

1. Use uma lâmina de bisturi limpa e afiada para cortar e aparar as membranas, dependendo da orientação doas seções.
2. Transferem-se as secções em conjunto com a membrana de uma placa de 24 poços contendo 1 ml de 4% PFA (1.2.7). Incubam-se as secções durante 1 hora à t.a., seguido por 3 lavagens com 1x PBS durante 15 min cada. Incubar as secções O / N com uma solução de permeabilização a 4 ° C com agitação suave.
3. No dia seguinte, incubar as secções com anticorpos primários apropriados, diluídos em solução de permeabilização, S / N ou durante 48 horas a 4 ° C com agitação suave.
4. Lavam-se as secções 3 vezes durante 15 min com PBS 1x e incubar O / N a 4 ° C com os anticorpos secundários apropriados diluídos em solução de permeabilização.
5. Após a incubação com os anticorpos secundários, lavar uma vez as secções com 1x PBS, durante 15 minutos, seguido por coloração com DAPI durante 10 min.
6. Lave as seções 3 vezes com PBS 1x por 15 min cada, e transferir para lâminas de microscópio. Adicionar ImmunoMount e coloque delicadamente uma lamela em cima das seções. Secar as lâminas O / N a 4 ° C e seal com unha polonês.
   NOTA: Mantenha os slides sempre a 4 ° C.
   1. Analisar as culturas fatia por microscopia confocal (Figura 1-I).

Resultados

A ablação do factor de transcrição Bcl11b provoca a diminuição da proliferação de células progenitoras e a diferenciação neuronal resultando numa redução do tamanho do giro denteado e o número de células. Além disso neurônios mutantes não conseguem integrar-se no circuito do hipocampo causando aprendizagem e memória comprometimento ^8. Para responder a perguntas sobre o mecanismo de regulação (s) de Bcl11b nestes processos eletroporação ex utero foi empregado.

Dirigindo-se...

Discussão

O hipocampo tem uma função importante na aprendizagem e memória. O giro dentado é também uma das duas regiões do cérebro onde ocorre a neurogénese não só durante o desenvolvimento, mas também ao longo da idade adulta. Pós-natal e neurogênese adulta rendimentos do hipocampo de uma forma semelhante envolvendo muitos fatores comuns. Definir os mecanismos de regulação desses fatores vai ser muito útil para a compreensão das doenças neurodegenerativas, que por sua vez levará a novas terapias e medidas preventivas. Para obter...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrator de Micropipetas Flamejantes/Marrom	Sutter Instruments Company (EUA)	P-97
Pipetas de Vidro Fino	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japão	EG-44
	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizador	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Aparelho Harvard do Sistema Fluovac		PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Aparelho Harvard	PY2 34-0415
Câmara de Anestesia	Aparelho Harvard	PY2 34-0460
Eletroporador	BEX Company	CUY21 EDIT
Pinças com eletrodos de disco	BEX Company	LF650P3	eletrodos de 3 mm para Pinças E15.5
com eletrodos de disco	BEX Company	LF650P5	eletrodos de 5 mm para E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Micrótomo de Lâmina Vibratória, 230 V	Thermo Scientific	920120
Microscópio	Invertido Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
	Leica	Leica DM IL
Microscópio Confocal	Leica	Sp5II
prato de 6 poços	BD Falcon	#353502
prato de 6 poços	CELLSTAR	#657160
Inserções de cultura de tecidos	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma
Poli-L-lisina	Sigma	#P5899
Tesoura de mola	Fine Science Tools	15003-08
Tesoura Bonn Extra Fina	Ferramentas de Ciências Finas	14084-08
Fórceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	Rolamento 41010-26

Unidade de Suporte Anestésico Microscópio de Dissecção LED #L2020