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Developmental Biology

माउस hippocampal ऊतक के पूर्व utero Electroporation और Organotypic स्लाइस संस्कृति

Published: March 4, 2015 doi: 10.3791/52550
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

Introduction

हिप्पोकैम्पस एक स्मृति और सीखने में महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में अच्छी तरह से भावनात्मक व्यवहार निभाता है। एक मुख्य समारोह तंत्रिका तंत्र के उच्च plasticity की आवश्यकता है, जो लंबे समय तक याद में अल्पकालिक स्मृति के समेकन, के होते हैं। हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस इनपुट जानकारी के लिए प्राथमिक प्रवेश द्वार के रूप में कार्य करता है और वयस्कता 1,2 भर में भी चल रही न्यूरोजेनेसिस के साथ दो मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक है। हिप्पोकैम्पस संरचना का विकास देर से embryogenesis दौरान और विशेष रूप से पहले 3 से 4 सप्ताह के प्रसव के बाद 3 के दौरान होता है। दांतेदार के प्रारंभिक विकास के दौरान एक स्टेम सेल पूल वयस्क न्यूरोजेनेसिस 4 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रसव के बाद के लिए आवश्यक की स्थापना की है गाइरस। विकासशील न्यूरॉन्स प्रसव के बाद के रूप में अच्छी तरह से वयस्क न्यूरोजेनेसिस दौरान अपरिपक्व और अंत में परिपक्व न्यूरॉन को पूर्वज कोशिकाओं के कई चरणों के माध्यम से स्टेम सेल से, विभिन्न चरणों के माध्यम से गुजरती हैं। न्यूरोजेनेसिस की अभिव्यक्ति के विभिन्न चरणों मेंविशिष्ट जीन हिप्पोकैम्पस circuitry के 5,6 में परिपक्वता और नए न्यूरॉन्स के एकीकरण की अनुमति देने के लिए आवश्यक है।

इन जीनों में से कई की अभिव्यक्ति पैटर्न और समारोह को परिभाषित करने की अनुमति दी माउस आनुवंशिकी और immunohistochemistry द्वारा phenotype के विश्लेषण के साथ ही आणविक विधियों का प्रयोग। इसके अलावा माइक्रोएरे विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से chromatin immunoprecipitation (चिप) में संभावित प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से लक्ष्य जीन 7,8 के बारे में जानकारी प्रदान की। हालांकि, दांतेदार गाइरस के विशेष विकास में हिप्पोकैम्पस के विकास के लिए नियामक तंत्र के विषय में कई खुला सवाल है, वहाँ अब भी कर रहे हैं। नीचे से या ऊपर-विनियमन ब्याज और / या अपने लक्ष्य जीन और विकास के दौरान उनके भाग्य का पालन के जीन की विशिष्ट जीन कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के हेरफेर की अनुमति के लिए आवश्यक है एक प्रणाली विनियमित रहे हैं कि कैसे आगे जानकारी हासिल करने के लिए। Utero electroporation में shRNAs, ब्याज या रचनात्मक recombina के जीन की सीडीएनएएसई इस तरह के एक उपकरण प्रदान करता है। Electroporation के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए वांछित डीएनए या छोटे RNAs अभिव्यक्ति plasmids की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए। यह दृष्टिकोण बहुत सफलतापूर्वक कारण गहरी मस्तिष्क परतों में हिप्पोकैम्पस संरचनाओं की स्थिति के लिए दांतेदार गाइरस के विकास की जांच के लिए एक अधिक चुनौतीपूर्ण दृष्टिकोण कॉर्टिकल विकास 9,10 अध्ययन में लागू किया, लेकिन है।

Organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा पूर्व utero electroporation के इस समस्या 11,12 नाकाम करने के लिए एक दृष्टिकोण है। के विपरीत utero electroporation के नहीं पूरे भ्रूण लेकिन केवल सिर इसलिए हिप्पोकैम्पस और दांतेदार गाइरस की ओर shRNA / डीएनए निर्देशित करने के लिए एक और अधिक अनुकूल रास्ते में इलेक्ट्रोड जगह करने की अनुमति के लिए किया जाता है में। हमारे समूह सफलतापूर्वक दांतेदार गाइरस विकास 8 दौरान प्रतिलेखन कारक Bcl11b की भूमिका का अध्ययन करने के पूर्व utero electroporation के कार्यरत हैं। Bcl11b आर द्वारा दांतेदार गाइरस विकास में एक दोहरी भूमिका हैimmunohistochemistry के द्वारा प्रदर्शन किया गया के रूप में पूर्वज सेल प्रसार के साथ-साथ भेदभाव egulating। आगे इन प्रक्रियाओं में Bcl11b भागीदारी के लिए एक तंत्र को परिभाषित करने के लिए, Polleux समूह 11,12 के प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल अनुभाग में नीचे वर्णित के रूप में दांतेदार गाइरस अध्ययन करने के लिए समायोजित किया गया। पहली बार एक दृष्टिकोण में सवाल Bcl11b स्वायत्त neuronal सेल भेदभाव सेल को विनियमित किया जाता है कि क्या संबोधित किया। एक दूसरा दृष्टिकोण Desmoplakin, Bcl11b का एक सीधा लक्ष्य जीन, Bcl11b phenotype के बचाव के लिए पर्याप्त है कि क्या जांच की।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रयोगों जर्मन कानून के अनुसार किए गए और Tubingen में सरकारी कार्यालयों द्वारा अनुमोदित किया गया।

Micropipettes, समाधान और झिल्ली 1. तैयारी

  1. Micropipettes की तैयारी
    1. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक micropipette खींचने का उपयोग कांच micropipettes खींचो: गर्मी: 540, खींचो: 125, वेग: 20 और देरी: 140. सुई लंबाई मात्रा 5.5 सेमी।
    2. एक microgrinder का उपयोग कर बेवल सुई 4 मिमी का एक उपयुक्त टिप आकार प्राप्त करने के लिए। सुझावों के हानिकारक को रोकने के लिए एक बॉक्स या 15 सेमी पेट्री डिश में सुई की दुकान।
  2. समाधान की तैयारी
    1. प्लास्मिड डीएनए समाधान
      1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक endotoxin मुक्त मैक्सी तैयारी किट का उपयोग कर वांछित सीडीएनए निर्माण युक्त प्लास्मिड डीएनए तैयार करें।
      2. प्लास्मिड डीएनए (GFP कील वेक्टर के बिना) 3 माइक्रोग्राम प्रति / μl के अंतिम एकाग्रता का हल या 4 समायोजित माइक्रोग्राम प्रति /μl अन्तर्जीवविष में (GFP कील वेक्टर के एक माइक्रोग्राम प्रति) के साथ फास्ट ग्रीन (अंतिम एकाग्रता 0.05%) युक्त Tris-EDTA के बफर मुक्त।
    2. Laminin स्टॉक समाधान
      1. 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए बाँझ पानी में laminin की 1 मिलीग्राम भंग। -80 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl aliquots और दुकान तैयार करें।
    3. पाली-एल Lysine स्टॉक समाधान
      1. 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ पानी की 50 मिलीलीटर में पाली एल लाइसिन की 50 मिलीग्राम भंग। -20 डिग्री सेल्सियस में 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान तैयार करें।
    4. हांक संतुलित नमक समाधान पूरा पूरा (HbSS)
      1. 2 CaCl, 10 एमएल 100 मिमी की MgSO 4 10x HBSS के 100 मिलीलीटर, 1 एम HEPES बफर के 2.5 मिलीलीटर (7.4 पीएच), 1 एम ग्लूकोज़ की 30 मिलीलीटर, 100 मिमी के 10 एमएल के संयोजन से पूरा HBSS तैयार करें, और 4 1 मिलीलीटर एम 3 NaHCO। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक एल और स्टोर करने के लिए बाँझ पानी जोड़ें।
        नोट: आटोक्लेव सभी समाधान 1 एम HEPES बफर की उम्मीद है और 1 एम ग्लूकोज़, fil रहे हैं जोआतंकवाद निष्फल।
    5. टुकड़ा संस्कृति मध्यम
      1. करने के लिए बेसल मध्यम ईगल के 35 मिलीलीटर, पूरा HBSS के 12.9 मिलीलीटर (1.2.4), 1 एम ग्लूकोज़ की 1.35 मिलीग्राम, 200 मिमी एल glutamine के 250 μl, और के 500 μl जोड़कर टुकड़ा संस्कृति मध्यम तैयार पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम 5% की एकाग्रता और स्टोर करने के लिए घोड़े सीरम जोड़ें।
    6. कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose
      1. Agarose उच्च शक्ति पर 1-2 मिनट के लिए एक माइक्रोवेव में हीटिंग द्वारा पीछा पूरा HBSS के 50 मिलीलीटर (1.2.4) के लिए एलएमपी के 2 जी जोड़कर एक 4% एलएमपी agarose समाधान तैयार करें। 39 डिग्री सेल्सियस - 37 पर एक पानी के स्नान में इस समाधान रखें। 4 डिग्री सेल्सियस और पुन: उपयोग में समाधान स्टोर।
    7. Paraformaldehyde समाधान
      1. एक धूआं हुड में 1x पीबीएस के 100 मिलीलीटर paraformaldehyde के 4 जी जोड़कर एक 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार है। 60 डिग्री सेल्सियस का हल गर्मी और समाधान सी हो जाता है जब तक एक एन NaOH की कुछ बूँदें जोड़नेलेअर।
    8. Permeabilization समाधान
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.3% trition एक्स 100 और स्टोर युक्त 1x पीबीएस के 300 मिलीलीटर में बीएसए की 9 ग्राम भंग। लंबी अवधि के भंडारण के लिए 10% सोडियम azide जोड़ें।
  3. झिल्ली आवेषण की कोटिंग
    1. 12 एमएल की अंतिम मात्रा को laminin के शेयर समाधान (1.2.2) और बाँझ पानी में पाली एल Lysine शेयर समाधान (1.2.3) का एक विभाज्य की एक विभाज्य पतला।
    2. बाँझ पानी की हर अच्छी तरह से युक्त 2 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटों में झिल्ली आवेषण रखें। झिल्ली के शीर्ष पर कोटिंग समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
    3. ऊष्मायन के बाद झिल्ली बाँझ पानी और सूखे के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार सम्मिलित धो लें। एक सूखी 6 अच्छी तरह से थाली में से चार सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ही दिन में या दुकान पर लेपित झिल्ली आवेषण का उपयोग करें।

2. डीएनए इंजेक्शन और E15.5 के electroporation और E18.5 भ्रूण

  1. भ्रूण दिन पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (ई) 15.5 या 18.5 से बेहोश माउस euthanize। भ्रूण 13 युक्त गर्भाशय काटना और ठंड पूरा HBSS के 15-20 मिलीलीटर युक्त एक पेट्री डिश में जगह।
    नोट: इस बिंदु के बाद से, बर्फ पर भ्रूण और ऊतकों रहते हैं।
  2. ठंड पूरा HBSS युक्त एक दूसरे पेट्री डिश में गर्भाशय सींग और जगह से प्रत्येक भ्रूण अलग करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, गर्भाशय मांसपेशियों की दीवार और ठीक संदंश (# 55) और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग नाल तोड़। ध्यान से जर्दी थैली से भ्रूण जारी।
  4. Decapitat को बॉन कैंची की एक जोड़ी का प्रयोग करेंसिर्फ एक 60 डिग्री के कोण पर forelimbs ऊपर ई भ्रूण। प्रयोग भ्रूण की जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है, जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए एक ऊतक का नमूना (पूंछ का एक छोटा सा टुकड़ा) इकट्ठा।
  5. एक साफ और शुष्क पेट्री डिश के लिए सिर स्थानांतरण। सिर एक 60 डिग्री के कोण में decapitated कर दिया गया था क्योंकि पृष्ठीय पक्ष रखा, जब सिर एक तरफ झुकाव होना चाहिए।
  6. पर्वबिन्दु को गोलार्द्ध के करीब के बीच में ध्यान से एक सुई प्लेस (चित्रा 1 ए, बी)। 5-8 दालों को लागू करने, नाड़ी प्रति 10-15 मिसे की अवधि के लिए दबाव के 30 पाउंड का उपयोग कर Picospritzer III के पेडल पर कदम द्वारा डीएनए समाधान के (3 या 4 माइक्रोग्राम प्रति / μl में) लगभग 2-3 μl इंजेक्षन। दालों की अवधि और संख्या और अधिक समय की जरूरत पड़ेगी छोटे खुलने के साथ सुई खोलने के व्यास पर निर्भर करता है। प्रत्येक नाड़ी के बीच का अंतराल एक सेकंड के बराबर है।
  7. इलेक्ट्रोड रखने से पहले, embr के सिर पर पूरा HBSS के कुछ बूँदें लागूयो। 'नकारात्मक' टर्मिनल इंजेक्ट वेंट्रिकल और भ्रूण के सिर (चित्रा 1C, डी) के कान के नीचे इंजेक्शन के वेंट्रिकल के विपरीत पक्ष पर 'सकारात्मक' इलेक्ट्रोड के रूप में एक ही पक्ष पर है कि इस तरह से इलेक्ट्रोड रखें। 50 वी के 5 दालों लागू करें
    1. ई 18.5 के लिए ई 15.5 के लिए 3 मिमी इलेक्ट्रोड और 5 मिमी इलेक्ट्रोड का उपयोग करें।

ब्रेन 3. विच्छेदन

  1. Electroporation के बाद, ठीक संदंश की एक जोड़ी की मदद से सिर से त्वचा छील। वसंत कैंची की एक जोड़ी का उपयोग खोपड़ी के midline पर सेरिबैलम के बीच में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं।
  2. चीरा में वसंत कैंची डालें और बाण के समान सिवनी साथ अनुलंबीय काटा। खोपड़ी दूर छील और ठीक संदंश का उपयोग करके खोपड़ी से मस्तिष्क अलग। 15-20 मिलीलीटर ठंड पूरा HBSS समाधान में पूरे दिमाग स्थानांतरण।
  3. इस बीच, 4% एलएमपी agarose डालनाएक छील दूर मोल्ड में, एक पानी के स्नान में 37-39 डिग्री सेल्सियस पर रखा।
  4. एक छोटे से स्कूप रंग से पूरा HBSS के बाहर मस्तिष्क लो और ठीक टिशू पेपर या Kimwipes का उपयोग करके HBSS के अतिरिक्त नाली।
  5. Agarose में धीरे पूरे दिमाग रखें और एक ठीक सुई के साथ अपनी स्थिति को समायोजित करें। Agarose जम है और ब्लॉक (राज्याभिषेक वर्गों के लिए घ्राण बल्ब अप प्वाइंट) sectioned है जब तक बर्फ पर मोल्ड रखें।

4. Vibratome सेक्शनिंग और स्लाइस संस्कृति

  1. एलएमपी agarose ब्लॉक ट्रिम और 'सुपर गोंद' का उपयोग नमूना चरण के लिए उन्हें गोंद। गोंद के बाद सूखी हस्तांतरण vibratome के बफर ट्रे के लिए नमूना चरण है और ब्लॉक समाधान में डूब जाता है, जब तक HBSS के पूरा ठंड बर्फ के साथ भरें।
    नोट: सेक्शनिंग से पहले 70% इथेनॉल के साथ सभी साधन और उपकरण सतहों जीवाणुरहित।
  2. बाद के रूप में एक नया ब्लेड का उपयोग कर 250 माइक्रोन मोटी vibratome वर्गों तैयार करें।
    1. ब्लॉक वाई छाँटोनिम्न सेटिंग्स वें; आवृत्ति - 60 हर्ट्ज, आयाम - 0.7 माइक्रोन, गति 16-18 मिमी / सेकंड। धीमी गति (9 मिमी / सेकंड) पर ऊपर सेटिंग्स के साथ वांछित ऊतक युक्त वर्गों में कटौती। Hindbrain से सेक्शनिंग शुरू, मस्तिष्क से 5-7 वर्गों इकट्ठा।
    2. एक तुला रंग की मदद से HBSS को पूरा करने और सभी वर्गों (चित्रा 1E) एकत्र कर रहे हैं जब तक बर्फ पर रख ठंड बर्फ के 5 मिलीलीटर युक्त स्वच्छ 6 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के लिए वर्गों स्थानांतरण।
  3. वर्गों के उन्मुखीकरण की सुविधा के लिए, झिल्ली पर वर्गों रखने से पहले पूरा HBSS के 100 μl के साथ एक क्रॉस फैशन में झिल्ली गीला।
  4. (झिल्ली पर खंड पुश करने के लिए संदंश का उपयोग तो संदंश के साथ खंड के एक कोने उठाओ और रंग पर खींचने के लिए और) झिल्ली पर एक तुला रंग का उपयोग वर्गों स्थानांतरण। एक झिल्ली पर पांच वर्गों के लिए ऊपर रखें और (संदंश का उपयोग करके चित्रा 1F व्यवस्था)। एक दूसरे के साथ वर्गों ओवरलैप नहीं है।
    1. एक विंदुक का उपयोग झिल्ली बंद HBSS के अतिरिक्त ले लो। यहां इस्तेमाल विशिष्ट झिल्ली एक फ्रेम से जुड़ी है और ऊतक संपर्क में हो सकता है लेकिन मध्यम द्वारा कवर नहीं करने के लिए अनुमति देता है जो टिशू कल्चर प्लेट, में डाला जाता है।
  5. टुकड़ा संस्कृति मध्यम (1.2.5) (चित्रा 1G, एच) के 1.8 मिलीग्राम से युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली में झिल्ली आवेषण रखें। 11 div या 14 DIV के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति डिश सेते हैं। आधा मध्यम (0.9 मिलीलीटर) हर दूसरे दिन बदलें।
    नोट: इस स्तर पर, Bromodeoxyuridine तरह अभिकर्मकों जोड़ें (BrdU, 10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) लेबलिंग संस्कृति समय के पहले 20 घंटे के लिए मीडिया के लिए कोशिकाओं proliferating लिए।

Immunofluorescence धुंधला द्वारा पीछा धारा 5. फिक्सेशन

  1. कटौती करने के लिए एक स्वच्छ और तेज स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें और के उन्मुखीकरण के आधार पर झिल्ली ट्रिमवर्गों।
  2. 4% पीएफए ​​(1.2.7) के 1 मिलीलीटर युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए झिल्ली के साथ वर्गों स्थानांतरण। 15 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस के साथ 3 washes के द्वारा पीछा आरटी पर 1 घंटे के लिए वर्गों सेते हैं। कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर permeabilization के समाधान के साथ वर्गों हे / एन सेते हैं।
  3. अगले दिन, permeabilization के समाधान में पतला उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों, सेते हैं, ओ / एन या कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा के लिए।
  4. 1x पीबीएस के साथ 15 मिनट के लिए वर्गों तीन बार धोएं और permeabilization के समाधान में पतला उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए DAPI धुंधला द्वारा पीछा 15 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ एक बार वर्गों धो लें।
  6. 15 मिनट प्रत्येक के लिए वर्गों 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और स्लाइड खुर्दबीन के लिए हस्तांतरण। ImmunoMount जोड़ें और धीरे वर्गों के शीर्ष पर एक coverslip जगह है। 4 डिग्री सेल्सियस और एसई पर स्लाइड हे / एन सूखीनेल पॉलिश के साथ अल।
    नोट: हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड रखें।
    1. Confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 मैं) द्वारा टुकड़ा संस्कृतियों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

प्रतिलेखन कारक Bcl11b की एबलेशन पूर्वज सेल प्रसार और एक कम दांतेदार गाइरस आकार और सेल संख्या में जिसके परिणामस्वरूप neuronal भेदभाव की हानि का कारण बनता है। इसके अलावा उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स सीखने और स्मृति हानि 8 के कारण हिप्पोकैम्पस circuitry में एकीकृत करने के लिए असफल। पूर्व utero electroporation के नियोजित किया गया था कि इन प्रक्रियाओं में Bcl11b के नियामक तंत्र (एस) से संबंधित प्रश्नों के उत्तर देने के लिए।

सवाल को संबोधित Bcl11b सेल स्वायत्त E15.5 में Bcl11b flox / flox हिप्पोकाम्पी में, Bcl11b की पच्चीकारी विलोपन एक GFP- Cre recombinase निर्माण या अकेले GFP के 11 पूर्व utero electroporation द्वारा उत्पन्न किया गया neuronal सेल भेदभाव को नियंत्रित करता है organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा किया है कि क्या electroporation के बाद 18 दिनों के लिए (2A चित्रा, बी, यह आंकड़ा 8 से संशोधित किया गया है)। Bcl11 कि क्या यह निर्धारित करने के लिएबी सेल-स्वायत्त immunofluorescence धुंधला GFP के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NeuroD पहचानने विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था दाना कोशिकाओं के भेदभाव को नियंत्रित करता है। NeuroD mitotic चरणों 2 बी / 3 और जल्दी postmitotic 14 कोशिकाओं में व्यक्त किया है। हम NeuroD सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में काफी neuronal भेदभाव 8 के एक गिरफ्तारी का संकेत Bcl11b सशर्त म्यूटेंट में वृद्धि हुई है पहले से पता चला है कि। अकेले GFP सकारात्मक कोशिकाओं और GFP / NeuroD सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या NeuroD सकारात्मक कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई कोशिकाओं Cre recombinase प्राप्त किया था, जहां दांतेदार गाइरस में मनाया गया नियंत्रण और उत्परिवर्ती कोशिकाओं में अलग नहीं किया था जबकि (चित्रा -2, यह आंकड़ा संशोधित कर दिया गया है 8 से)। Cre recombinase प्राप्त किया था जो कोशिकाओं में भी, लेकिन जंगली प्रकार की कोशिकाओं में न केवल NeuroD सकारात्मक कोशिकाओं ढूँढना अप्रत्यक्ष तंत्र neuronal सेल भेदभाव की Bcl11b विनियमन में शामिल हैं जो सुझाव दिया। इन आंकड़ों से, तथापि, additBcl11b की ional सेल स्वायत्त कार्यों से बहिष्कृत नहीं किया जा सकता।

इससे पहले, Desmoplakin Bcl11b 8 का एक सीधा लक्ष्य जीन के रूप में निर्धारित किया गया था। यह भी Desmoplakin पूर्वज सेल प्रसार और केरेटिनकोशिकाओं 15 के भेदभाव के विनियमन में शामिल है कि दिखाया गया था। Desmoplakin अकेले या सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण के तहत GFP और Desmoplakin नियंत्रण और Bcl11b उत्परिवर्ती दिमाग (चित्रा 3 ए में electroporated किया गया था GFP व्यक्त दांतेदार गाइरस प्लास्मिड डीएनए के पूर्वज सेल प्रसार और / या neuronal भेदभाव के नियमन में शामिल है कि क्या प्रदर्शित करने के लिए - सी, यह आंकड़ा 8 से संशोधित किया गया है)। मस्तिष्क स्लाइस BrdU (10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) की उपस्थिति में पहले 20 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। Electroporation के बाद 11 दिन में टुकड़ा संस्कृतियों BrdU के immunostaining के द्वारा पीछा तय किया गया और BrdU सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित किया गया था। उत्परिवर्ती Tissu Bcl11bनियंत्रण ऊतक की तुलना में जब GFP के साथ electroporated ई ही काफी कम BrdU सकारात्मक कोशिकाओं निहित। (; यह आंकड़ा 8 से संशोधित किया गया है चित्रा 3 डी) हालांकि, GFP और Desmoplakin के सह-electroporation के स्तर को नियंत्रित करने के लिए BrdU सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को बचाया। साथ में ले ली इन आंकड़ों आगे एक सीधा लक्ष्य Bcl11b के जीन और पूर्वज सेल प्रसार के नियमन में अपनी भूमिका के रूप में Desmoplakin की पुष्टि करें।

चित्र 1
E15.5 में पूर्व utero electroporation और organotypic टुकड़ा संस्कृति की चित्रा 1. सेट अप। (ए) डीएनए इंजेक्शन एक गोलार्द्ध में। (बी) के डीएनए इंजेक्शन के योजनाबद्ध ड्राइंग। इलेक्ट्रोड (सी) पोजिशनिंग। (डी) योजनाबद्ध इलेक्ट्रोड नियुक्ति की ड्राइंग। (ई) Vibratome सेक्शनिंग और जदांतेदार गाइरस के मस्तिष्क वर्गों के ANDLING। (एफ) विशिष्ट झिल्ली पर मस्तिष्क वर्गों रखकर। (सैनिक) उज्ज्वल क्षेत्र (जी) और प्रतिदीप्ति (एच, GFP) के electroporation के बाद 1 दिन पर टुकड़ा संस्कृतियों का विश्लेषण। (मैं) confocal छवि 11 दिन में DAPI और GFP धुंधला का उपयोग electroporation के बाद। धराशायी लाइन दांतेदार गाइरस इंगित करता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
पूर्व utero electroporation और (8 से संशोधित) organotypic टुकड़ा संस्कृति से Bcl11b चित्रा 2. मोज़ेक विलोपन। नियंत्रण वेक्टर pCIG2 अकेले (ए) और pCIG2- Cre चुनाव के electroporation18 दिनों के लिए organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा E15.5 में दांतेदार गाइरस में संरचना (बी)। धारा GFP (हरा) और NeuroD (लाल) को पहचानने का उपयोग कर एंटीबॉडी द्वारा immunostained थे। Insets Cre -recombinase व्यक्त कोशिकाओं में Bcl11b अभिव्यक्ति की हानि प्रदर्शित करने के लिए उच्च बढ़ाई GFP (हरा) और Bcl11b (लाल) धुंधला प्रदर्शित करते हैं। (सी) GFP, NeuroD और GFP / NeuroD सकारात्मक कोशिकाओं के सांख्यिकीय विश्लेषण। धराशायी लाइनों दांतेदार गाइरस संकेत मिलता है। T-परीक्षण, * पी <0.005; त्रुटि सलाखों, एसडी; एन = 5। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Bcl11b फेनोटाइप (8 से संशोधित) Desmoplakin की फिर से लागू होने से बचाया है। GFP के केवल (ए, बी) के रूप में अच्छी तरह से GFP और Desmoplakin (सी) नियंत्रण (ए) और उत्परिवर्ती की दांतेदार गाइरस में electroporated गया (बी, E15.5 में सी) दिमाग में 11 दिनों के लिए organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा किया। धारा GFP (हरा) और BrdU (लाल)। (डी) BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के सांख्यिकीय विश्लेषण पहचानने का उपयोग कर एंटीबॉडी द्वारा immunostained थे। धराशायी लाइनों दांतेदार गाइरस संकेत मिलता है। Insets उच्च बढ़ाई Desmoplakin धुंधला (हरा) प्रदर्शित करते हैं। T-परीक्षण, * पी <0.01; त्रुटि बार, SEM; एन = 4। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
ई 18.5 पर चित्रा 4. पूर्व utero electroporation के organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा किया।Electroporation के बाद 16 दिन में immunostaining द्वारा पीछा एक गोलार्द्ध में GFP व्यक्त डीएनए इंजेक्शन (ए) DAPI धुंधला;। (बी) GFP के धुंधला, (ग) छवि विलय कर दिया। धराशायी लाइन दांतेदार गाइरस इंगित करता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हिप्पोकैम्पस सीखने और स्मृति में एक महत्वपूर्ण कार्य किया है। दांतेदार गाइरस भी न्यूरोजेनेसिस विकास के दौरान, लेकिन यह भी वयस्कता भर में न केवल तब होता है, जहां दो मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक है। प्रसव के बाद और कई आम कारकों को शामिल एक समान तरीके से वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस आय। इन कारकों में से नियामक तंत्र की परिभाषा बदले में नए उपचारों और निवारक उपाय करने के लिए नेतृत्व करेंगे जो neurodegenerative रोगों को समझने में बहुत मददगार होगा। इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए एकल कक्षों में हेरफेर और organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा पूर्व utero electroporation द्वारा प्रदर्शन के रूप में उनके पैतृक वातावरण में उन्हें देखने के लिए एक प्रणाली की आवश्यकता है।

पूर्व utero electroporation के सफलतापूर्वक कॉर्टेक्स विकास 11,16 अध्ययन में पहली बार लागू किया गया था। हिप्पोकैम्पस के विकास में Bcl11b की भूमिका की जांच के हमारे ज्ञान करने के लिए विकास के पहले का वर्णन पूर्व utero electroporation हैदांतेदार में एनए ऊतक 8 गाइरस। हम कॉर्टेक्स विकास 11,12 का अध्ययन Polleux समूह द्वारा प्रकाशित तरीकों पर हमारे प्रोटोकॉल आधारित है। सफलतापूर्वक आकार और इलेक्ट्रोड की स्थिति को समायोजित किया जा सकता था दांतेदार गाइरस अध्ययन करने के लिए इस पद्धति लागू करने के लिए। इंजेक्शन साइट और कान के नीचे विपरीत स्थल पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड के पास कॉर्टेक्स पर नकारात्मक इलेक्ट्रोड रखकर इलेक्ट्रोपोरेशन के polarity बदल गया है और दांतेदार गाइरस की कोशिकाओं में डीएनए को प्रस्तुत करने में सफल रहा। सही ढंग से इलेक्ट्रोड रखकर और एमए संतोषजनक electroporation के परिणाम प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण कदमों निकला 0.06-0.08 के एक वर्तमान आवेदन। ऊपर वर्णित के रूप में सबसे पर्याप्त वर्तमान इलेक्ट्रोड का सही रखने पर मुख्य रूप से निर्भर करता है प्राप्त करने के लिए। प्रोटोकॉल के अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम वेंट्रिकल में सामग्री इंजेक्शन लगाने के साथ ही vibratome सेक्शनिंग के बाद स्लाइस संभाल रहे हैं। मस्तिष्क के ऊतकों पूरी प्रक्रिया के दौरान तय नहीं है औरखेती के लिए झिल्ली पर vibratome से स्थानांतरित इसलिए जब ऊतक बहुत नरम और आसानी से destroyable है। धारा भी immunostaining के प्रारंभ करते समय बड़ी सावधानी से नियंत्रित किया जाना है। इन संशोधनों और दांतेदार गाइरस के एकल कक्षों का विचार जोड़तोड़ के साथ सफलतापूर्वक जल्दी हिप्पोकैम्पस विकास की Bcl11b विनियमन से संबंधित प्रश्नों (; इस आंकड़े 8 से संशोधित किया गया है चित्रा 2 और 3) का जवाब दे प्रदर्शन किया गया।

एकल कक्षों में हेर-फेर से ऊपर उल्लेख किया और निरीक्षण के रूप में उनके भाग्य पूर्व utero electroporation की प्रमुख लाभ है। गर्भाशय electroporation में के साथ तुलना में पूर्व utero दृष्टिकोण की एक बड़ी खामी संस्कृति में स्लाइस रखने के लिए सीमित समय है। यह पूर्व utero खेती शर्तों विकास में देरी के कारण हो सकता है कि यह भी संभव है। हमारे प्रयोगों में अब तक हम संस्कृति में स्लाइस रखने में सक्षम थे कि यूP14 साल की उम्र से मेल खाती है जो पी करने के लिए 18 दिनों के लिए। इस समय परे organotypic स्लाइस की खेती के ऊतकों के विघटन पैदा होती हैं। पूर्व utero दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त नुकसान माँ प्रति electroporated जा सकता है कि भ्रूण की सीमित संख्या है। अप करने के लिए 8 भ्रूण इस संख्या में इलाज किया जा सकता है, जहां utero में electroporation के विपरीत पूर्व utero दृष्टिकोण में चार भ्रूण तक सीमित है। भ्रूण, इलेक्ट्रोपोरेशन, vibratome सेक्शनिंग और संस्कृति की स्थिति में स्लाइस के हस्तांतरण की विच्छेदन सफल टुकड़ा संस्कृतियों सुनिश्चित करने के लिए एक कम समय में प्रदर्शन किया जा रहा है।

दांतेदार गाइरस विकास की प्रमुख घटनाओं P14 और P30 के बीच होते हैं क्योंकि यह लंबे समय अवधि के लिए संस्कृति में organotypic स्लाइस रखने के लिए आवश्यक होगा। संस्कृति का विस्तार करने के लिए एक पहले ही प्रयास में समय electroporations तदनुसार शर्तों का समायोजन ई 18.5 पर प्रदर्शन किया गया (चित्रा 4; प्रोटोकॉल देखें)। वें पर electroporatingसमय बिंदु जैसे ई 15.5, जब की तुलना में हिप्पोकैम्पस गठन के आगे ई 18.5 पर विकसित की है इसके अलावा p17 या 18 के लिए संस्कृति में मस्तिष्क वर्गों रखने की अनुमति देता है, हिप्पोकैम्पस संरचनाओं पहले से ही बनाई और अधिक आसानी से पहचानने योग्य होते हैं। भविष्य में हम P30 अप करने के लिए दांतेदार गाइरस विकास के दौरान परिवर्तन की जांच करने के लिए पी 4 को, उदाहरण के लिए, यहां तक कि बाद में समय बिंदुओं पर P0 के पूर्व utero electroporation के प्रदर्शन करने के लिए करना चाहते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller Sutter Instruments Company (USA) P-97
Fine Glass Pipettes Warner Instruments G100F-4
Microgrinder Narishige, Japan EG-44
Anesthetic Bracket unit Harvard Apparatus PY2 34-0412
Halovet Vaporizer Harvard Apparatus PY2 34-0398
Fluovac System Harvard Apparatus PY2 34-0387
IMS Fluosorber Harvard Apparatus PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber Harvard Apparatus PY2 34-0460
Electroporator BEX Company CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes BEX Company LF650P3 3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes BEX Company LF650P5 5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III Parker Hannifin Corporation P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V Thermo Scientific 920120
Dissection Microscope Carl Zeiss Microscopy Gmbh Stemi SV8
Inverted Microscope Leica Leica DM IL LED
Confocal Microscope Leica Sp5II
6 well dish BD Falcon #353502
6 well dish CELLSTAR #657160
Tissue culture inserts BD Falcon #353090
Fast Green Sigma F7252
Laminin Sigma #L2020
Poly-L-lysine Sigma #P5899
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Forceps Dumont #55 11255-20 Inox
HBSS 10x Life Technology 14180-046
BME Life Technology 41010-26

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विकास जीवविज्ञान अंक 97 हिप्पोकैम्पस दांतेदार गाइरस विकास Bcl11b प्रतिलेखन कारक, organotypic टुकड़ा संस्कृति मोज़ेक विलोपन फेनोटाइप बचाव
माउस hippocampal ऊतक के <em>पूर्व utero</em> Electroporation और Organotypic स्लाइस संस्कृति
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Venkataramanappa, S., Simon, R.,… More

Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52550, doi:10.3791/52550 (2015).

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