Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

O objetivo geral deste procedimento é rotular e modificar células individuais do giro dentado e acompanhar seu desenvolvimento. Isso é feito injetando primeiro DNA em um hemisfério do cérebro no dia embrionário, 15,5 ou 18,5. O segundo passo é eletroporar o DNA injetado na área do giro dentado em desenvolvimento.

As próximas seções cerebrais são preparadas usando um vibrador e as fatias cerebrais são mantidas em cultura por até 14 dias. A etapa final é a coloração imunofluorescente das fatias cerebrais usando anticorpos apropriados. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência confocal é usada para mostrar alterações das células granulares modificadas do giro dentado em desenvolvimento.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da neurobiologia, como o papel de genes específicos no desenvolvimento de células neuronais específicas em diferentes áreas do cérebro. Em nosso caso, BC 11 B fator de transcrição no desenvolvimento do giro. Comece o procedimento dissecando o útero de um camundongo sacrificado, que contém os embriões.

Coloque-o em uma placa de Petri contendo 15 a 20 mililitros de HBSS completo frio no gelo. Em seguida, use uma tesoura para separar cada embrião do corno uterino. Em seguida, coloque-o em uma segunda placa de Petri contendo HBSS completo frio sob um microscópio de dissecação, corte a parede do músculo uterino.

Solte cuidadosamente o embrião do saco vitelino e da placenta. Depois disso. Use uma tesoura de ligação para decapitar os embriões logo acima dos limites anteriores em um ângulo de 60 graus.

Se o experimento exigir genotipagem dos embriões, colete uma amostra de tecido para isolamento de DNA genômico. Em seguida, transfira a cabeça para uma placa de Petri limpa e seca. Como a cabeça foi decapitada em um ângulo de 60 graus, ela deve inclinar-se para um lado quando colocada com o lado dorsal para cima.

Agora coloque uma agulha cuidadosamente no meio do hemisfério, perto do bgma. Injete aproximadamente dois a três microlitros de solução de DNA pisando no pedal do pico spritzer. Três, usando 30 libras de pressão durante 10 a 15 milissegundos por pulso.

Aplicação de cinco a oito pulsos com um segundo entre os pulsos. Antes de colocar os eletrodos, aplique algumas gotas de HBSS completo na cabeça do embrião O.Em seguida, coloque os eletrodos de forma que o terminal negativo fique do mesmo lado do ventrículo injetado e o eletrodo positivo no lado oposto do ventrículo injetado abaixo da orelha da cabeça do embrião. Em seguida, aplique cinco pulsos de 50 volts.

Após eletroporação. Coloque a cabeça do embrião em um prato contendo 15 a 20 mililitros de solução HBSS completa fria. Retire a pele da cabeça do embrião.

Em seguida, faça uma pequena incisão no meio do cerebelo, na linha média do crânio. Insira a tesoura de mola na incisão e corte longitudinalmente ao longo da sutura sagital. Retire o crânio e separe o cérebro dele.

Enquanto isso, despeje 4% LMP aros em um molde removível e descasque-o em temperatura ambiente. Retire o cérebro do HBSS completo com uma pequena espátula e escorra o excesso de HBSS com papel de seda fino ou lenço químico. Coloque todo o cérebro suavemente nas rosas de ágar e ajuste sua posição com uma agulha fina.

Mantenha o molde no gelo até que a rosa do ágar esteja solidificada e o bloco seja seccionado. Agora apare o bloco LMP agros e cole-o no estágio de amostra usando super cola. Depois que a cola estiver seca, transfira o estágio da amostra para a bandeja tampão do vibrador.

Encha-o com HBSS completo gelado até que o bloco esteja imerso na solução. Para se preparar para o seccionamento, defina o vibrador para as configurações apropriadas. Corte as seções contendo o tecido desejado em baixa velocidade, começando pelo cérebro posterior, e colete de cinco a sete seções do cérebro.

Em seguida, transfira as seções para um prato limpo de seis poços contendo cinco mililitros de gelo frio, complete o HBSS e mantenha-o no gelo até que todas as seções sejam coletadas. Em seguida, coloque as inserções de membrana em uma placa de seis poços contendo 1,8 mililitros de meio de cultura de fatias. Umedeça a membrana de forma cruzada com 100 microlitros de HBSS completo antes de colocar as seções na membrana para facilitar a orientação das seções.

Em seguida, transfira as seções para a membrana. Coloque até cinco seções em uma membrana e não sobreponha as seções umas às outras. Retire o excesso de HBSS da membrana usando uma pipeta.

Incube a placa de cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 11 ou 14 dias in vitro e troque metade do meio a cada dois dias. Nesta fase, adicione reagentes como bromo desoxiuridina para marcar células em proliferação ao meio durante as primeiras 20 horas do tempo de cultura. Nesta etapa, use uma lâmina de bisturi limpa e afiada para aparar a membrana de acordo com a orientação das seções.

Transfira as seções junto com a membrana para uma placa de 24 poços contendo um mililitro de 4% de PFA e incube as seções por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave-os três vezes com um XPBS por 15 minutos a cada lavagem. Em seguida, incubar as secções durante a noite com solução permeável a quatro graus Celsius com agitação suave no dia seguinte, incubar as secções com os anticorpos primários adequados, solução diluída e permeável durante a noite ou durante 48 horas a quatro graus Celsius com agitação suave.

Em seguida, lave as seções três vezes por 15 minutos com um XPBS e incube durante a noite a quatro graus Celsius com os anticorpos secundários apropriados, solução diluída e permeável. Após a incubação, lave as seções uma vez com um XPBS por 15 minutos, seguido de coloração por 10 minutos no final, lave as seções três vezes com um XPBS por 15 minutos cada e transfira para as lâminas do microscópio. Adicione o suporte imunológico e suavemente.

Coloque uma lamínula no topo das seções. Seque as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius e sele com esmalte antes de analisá-las por microscopia confocal. Aqui é mostrada a injeção de DNA expressando GFP em um hemisfério, seguida de imunocoloração no dia 18,5 após a eletroporação.

Esta imagem mostra a coloração DPI A coloração GFP é mostrada nesta imagem e a imagem mesclada é mostrada aqui. Esta figura mostra a deleção em mosaico de BCL 11 B por X útero, eletroporação, seguida de fatia organotípica. As seções de cultura foram imunocoradas usando anticorpos, reconhecendo GFP e NeuroD, as inserções exibindo GFP e BCL L 11 B. A coloração em maior ampliação demonstra a perda da expressão de BCL 11 B em células que expressam Cree recombinase.

Aqui está a análise estatística das células GFP, neuro D e GFP neuro D positivas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita duas horas e meia para quatro embriões, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o tecido com cuidado e evitar contaminação.