Name: Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a usar eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas para estudar o hipocampo de camundongo. Este método permite marcar e modificar células individuais do giro denteado e acompanhar seu desenvolvimento.

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Este trabalho foi financiado por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft para SB (BR-2215; SFB 497/A9).

NOTA: Todas as experiências com animais foram realizados em conformidade com a lei alemã e foram aprovados pelos escritórios do governo em Tübingen. 1. Preparação de Micropipetas, Soluções e Membranas <ol><li> Preparação de micropipetas <ol><li> Puxe micropipetas de vidro usando um extrator micropipeta com o seguinte programa: Calor: 540, Pull: 125, Velocidade: 20 e Delay: 140. Os valores comprimento da agulha para 5,5 cm. </li><li> Agulhas cônicas usando um microgrinder para obter um tamanho adequado ponta de 4 mm. Armazene as agulhas em uma caixa ou 15 centímetros de Petri para evitar danos das dicas. </li></ol></li><li> Preparação de Soluções <ol><li> O plasmídeo de DNA Solução <ol><li> Preparar DNA de plasmídeo contendo a construção de ADNc desejado utilizando um kit Maxi-prep livre de endotoxina de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Ajuste a solução de DNA do plasmídeo para uma concentração final de 3 mg / mL (GFP sem espigão vector) ou 4 ug /ul (com 1 ug de vector de GFP pico) em endotoxina libertar tampão Tris-EDTA contendo Fast Green (concentração final 0,05%). </li></ol></li><li> A laminina da solução <ol><li> Dissolve-se 1 mg de laminina em água estéril até um volume final de 1 ml. Prepare 100 mL alíquotas e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> A poli-L-lisina da Solução <ol><li> Dissolve-se 50 mg de poli-L-lisina em 50 ml de água estéril para uma concentração final de 1 mg / ml. Preparar alíquotas de 1 ml e loja em -20 ° C. </li></ol></li><li> Conclua solução salina equilibrada de Hank (HBSS completa) <ol><li> Prepare completa HBSS combinando 100 ml de HBSS 10x, 2,5 ml de 1 M de tampão HEPES (pH 7,4), 30 ml de 1 M de D-glucose, 10 ml de 100 mM CaCl 2, 10 ml de 100 mM de MgSO4, e 4 ml de 1 M de NaHCO3. Adicionar água estéril até 1 L e armazenar a 4 ° C. NOTA: Autoclave todas as soluções tampão de esperar de HEPES 1 M e 1 M de D-glicose, que são filter esterilizado. </li></ol></li><li> Slice Meio de Cultura <ol><li> Prepare fatia meio de cultura pela adição de 35 ml de Meio Basal de Eagle, 12,9 ml de HBSS completo (1.2.4), 1,35 ml de 1 M de D-glucose, 250 ul de 200 mM de L-glutamina, e 500 ul de penicilina-estreptomicina a obter um volume final de 50 ml. Adicionar soro de cavalo a uma concentração final de 5% e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Low-Ponto de fusão (LMP) Agarose <ol><li> Prepara-se uma solução de agarose a 4% LMP por adição de 2 g de agarose LMP a 50 ml de HBSS completo (1.2.4), seguido por aquecimento num forno de microondas durante 1-2 minutos, a alta energia. Manter a solução num banho de água a 37-39 ° C. Guardar a solução a 4 ° C e reutilização. </li></ol></li><li> Solução paraformaldeído <ol><li> Numa hotte preparar uma solução a 4% de paraformaldeído (PFA) por adição de 4 g de paraformaldeído a 100 ml de PBS 1x. Aquece-se a solução para 60 ° C e adiciona-se algumas gotas de NaOH 1 N até que a solução se torna clear. </li></ol></li><li> Solução permeabilização <ol><li> Dissolve-se 9 g de BSA em 300 mL de PBS 1x contendo 0,3% Triton X-100 e armazenar a 4 ° C. Adicionar azeto de sódio a 10% para armazenamento a longo prazo. </li></ol></li></ol></li><li> Revestimento de Membrana inserções <ol><li> Dilui-se uma alíquota da solução de reserva de laminina (1.2.2) e uma aliquota de solução mãe de poli-L-lisina (1.2.3) em água estéril para um volume final de 12 ml. </li><li> Coloque inserções de membrana em placas de 6 poços com cada poço contendo 2 ml de água estéril. Adicionar 1 ml de solução de revestimento por cima da membrana e incubar O / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> Após a incubação, lavar a membrana insere três vezes com 1 ml de água estéril e seco. Use pastilhas membrana revestida no mesmo dia ou armazenar a 4 ° C por até quatro semanas em um seco placa de 6 poços. </li></ol></li></ol> 2. Injecção de ADN e electroporação de embriões E15.5 e E18.5 <ol><li&gt; Anestesiar uma vez acoplado rato fêmea, colocando-a dentro de uma câmara de anestesia saturado com 5% de isoflurano e ligado a um vaporizador. Circule isoflurano e oxigênio a uma taxa de 1 L / min. Mantenha o animal na caixa de 2-4 min ou até inconsciente, que é testada por beliscar entre as patas do mouse. </li><li> Eutanásia o mouse inconsciente por deslocamento cervical no dia embrionário (E) 15,5 ou 18,5. Dissecar o útero contendo os embriões 13 e colocá-lo em uma placa de Petri contendo 15-20 ml de frio HBSS completa. NOTA: A partir deste ponto em diante, manter os embriões e tecidos no gelo. </li><li> Use um par de tesouras para separar cada embrião do corno uterino e lugar para uma segunda placa de Petri contendo frio HBSS completa. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, cortar a parede do músculo uterino e da placenta, usando um par de fórceps finos (# 55) e tesoura. Solte cuidadosamente o embrião a partir do saco vitelino. </li><li> Use um par de tesouras de Bona para decapitate os embriões só acima dos membros anteriores em um ângulo de 60 °. Se a experiência requer genotipagem dos embriões, recolher uma amostra de tecido para isolamento de ADN genómico (um pequeno pedaço da cauda). </li><li> Transfira a cabeça para um prato limpo e seco Petri. Porque a cabeça tinha sido decapitado em um ângulo de 60 °, a cabeça deve inclinar para um lado quando colocado dorsal para cima. </li><li> Coloque uma agulha cuidadosamente para o meio do hemisfério perto da bregma (Figura 1A, B). Injectar cerca de 2-3 ul (em 3 ou 4 ug / uL) de solução de ADN por pisar o pedal do Picospritzer III usando 30 libras de pressão durante o período de 10-15 ms por impulso, aplicando impulsos de 5-8. A duração e número dos impulsos depende do diâmetro da abertura de agulha com aberturas menores que precisam de mais tempo. O intervalo entre cada pulso corresponde a 1 seg. </li><li> Antes da colocação dos eletrodos, aplique algumas gotas de HBSS completa sobre a cabeça do embryo. Colocar os eléctrodos de tal maneira que o terminal de &quot;negativo&quot; é no mesmo lado que o ventrículo injectado e o eléctrodo &quot;positivo&quot;, no lado oposto do ventrículo injectado abaixo da orelha da cabeça do embrião (figura 1C, D). Aplicar 5 pulsos de 50 V. <ol><li> Use 3 eletrodos mm para 15,5 E e 5 mm para eletrodos E 18.5. </li></ol></li></ol> 3. Dissecção do Cérebro <ol><li> Após a electroporação, descasca a pele da cabeça, com a ajuda de um par de fórceps finos. Utilizando um par de tesouras de mola fazer uma pequena incisão no meio do cerebelo na linha média do crânio. </li><li> Insira a tesoura primavera na incisão e cortar longitudinalmente ao longo da sutura sagital. Retire o crânio e separar o cérebro do crânio usando uma pinça fina. Transferir todo o cérebro em 15-20 ml frio solução HBSS completa. </li><li> Enquanto isso, coloque 4% LMP agarose,mantida a 37-39 ° C num banho de água, para um molde de casca-de distância. </li><li> Leve o cérebro para fora do HBSS completa por uma pequena espátula colher e drenar o excesso de HBSS usando lenço de papel fino ou Kimwipes. </li><li> Coloque todo o cérebro suavemente para dentro da agarose e ajustar a sua posição com uma agulha fina. Mantenha o molde em gelo até a agarose é solidificada e o bloco é segmentado (por cortes coronais os bulbos olfatórios apontar para cima). </li></ol> 4. Vibratome Seccionamento e Cultura Slice <ol><li> Apare os blocos de agarose LMP e cola-los para o palco amostra usando &#39;super cola &quot;. Depois de a cola de transferência é seca a fase espécime para a bandeja de tampão de vibratome e encher com gelo frio completar HBSS até que o bloco está imerso na solução. NOTA: Esterilizar todas as superfícies de instrumentos e equipamentos com etanol a 70% antes do corte. </li><li> Prepare 250 mm seções vibratome grossas usando uma lâmina nova como seguida. <ol><li> Apare o wi blocoth as seguintes configurações; freqüência - 60 Hz, amplitude - 0,7 mm, velocidade de 16-18 mm / sec. Corte as seções que contêm o tecido desejado com as configurações acima em velocidade lenta (9 mm / seg). Iniciando o seccionamento do cérebro posterior, recolher 5-7 seções do cérebro. </li><li> Transfira as seções para uma placa de cultura de 6 bem limpo contendo 5 ml de gelo frio completar HBSS com a ajuda de uma espátula dobrado e manter em gelo até que todas as seções são coletados (Figura 1E). </li></ol></li><li> Humedecer a membrana de forma cruzada com 100 ul de HBSS completa antes de colocar as secções sobre a membrana, a fim de facilitar a orientação das secções. </li><li> Transfira as seções usando uma espátula dobrado sobre a membrana (pegar um canto da seção com uma pinça e puxe para a espátula e, em seguida, use a pinça para empurrar a seção sobre a membrana). Coloque até cinco seções em uma membrana e organizar por usando uma pinça (Figura 1F). Não sobreponha as seções com os outros. <ol><li> Tirar o excesso de HBSS fora da membrana utilizando uma pipeta. As membranas específicas utilizadas aqui estão ligados a uma armação e inserido na placa de cultura de tecido, o que permite que o tecido estar em contacto, mas não coberta pelo meio. </li></ol></li><li> Coloque as inserções de membrana numa placa de 6 poços contendo 1,8 ml de meio de cultura de fatia (1.2.5) (Figura 1G, H). Incubar a placa de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 por 11 ou 14 DIV DIV. Mudar metade do meio (0,9 ml) a cada segundo dia. NOTA: Nesta fase, adicionar reagentes como bromodeoxiuridina (BrdU; 10 mM concentração final) para a rotulagem proliferação de células para a mídia pela primeira 20 horas do tempo de cultura. </li></ol> 5. A fixação das Seções Seguido por Imunofluorescência Coloração <ol><li> Use uma lâmina de bisturi limpa e afiada para cortar e aparar as membranas, dependendo da orientação doas seções. </li><li> Transferem-se as secções em conjunto com a membrana de uma placa de 24 poços contendo 1 ml de 4% PFA (1.2.7). Incubam-se as secções durante 1 hora à t.a., seguido por 3 lavagens com 1x PBS durante 15 min cada. Incubar as secções O / N com uma solução de permeabilização a 4 ° C com agitação suave. </li><li> No dia seguinte, incubar as secções com anticorpos primários apropriados, diluídos em solução de permeabilização, S / N ou durante 48 horas a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Lavam-se as secções 3 vezes durante 15 min com PBS 1x e incubar O / N a 4 ° C com os anticorpos secundários apropriados diluídos em solução de permeabilização. </li><li> Após a incubação com os anticorpos secundários, lavar uma vez as secções com 1x PBS, durante 15 minutos, seguido por coloração com DAPI durante 10 min. </li><li> Lave as seções 3 vezes com PBS 1x por 15 min cada, e transferir para lâminas de microscópio. Adicionar ImmunoMount e coloque delicadamente uma lamela em cima das seções. Secar as lâminas O / N a 4 ° C e seal com unha polonês. NOTA: Mantenha os slides sempre a 4 ° C. <ol><li> Analisar as culturas fatia por microscopia confocal (Figura 1-I). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li>
<li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus%3A+what+we+are+learning+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li>
<li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li>
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<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li>
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<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19(2002).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li>
<li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li>
<li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin%3A+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li>
<li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants%3A+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O hipocampo tem uma função importante na aprendizagem e memória. O giro dentado é também uma das duas regiões do cérebro onde ocorre a neurogénese não só durante o desenvolvimento, mas também ao longo da idade adulta. Pós-natal e neurogênese adulta rendimentos do hipocampo de uma forma semelhante envolvendo muitos fatores comuns. Definir os mecanismos de regulação desses fatores vai ser muito útil para a compreensão das doenças neurodegenerativas, que por sua vez levará a novas terapias e medidas preventivas. Para obter...

O hipocampo desempenha um papel importante na memória e aprendizagem, bem como o comportamento emocional. Uma função principal consiste na consolidação da memória de curto prazo em memória de longo prazo, que requer alta plasticidade do sistema nervoso. O giro denteado do hipocampo actua como primário para a porta de entrada de informação de entrada e é também uma das duas regiões do cérebro com a neurogénese contínuo ao longo da idade adulta 1,2. O desenvolvimento da estrutura do hipocampo ocorre durante a embriogénese tardia e particularmente durante os primeiros 3 a 4 semanas pós-natal 3. Durante o desenvolvimento inicial do giro denteado um pool de células-tronco é estabelecida necessário para pós-natal, bem como a neurogênese adulta 4. Neurônios em desenvolvimento passam por várias etapas, desde a célula-tronco por várias fases de células progenitoras para os imaturos e, finalmente, o neurônio maduro durante a pós-natal, bem como neurogênese adulta. Em diferentes estádios da neurogénese a expressão degenes específicos é necessária para permitir a maturação e integração de novos neurónios do hipocampo para o circuito 5,6. Usando mouse genética e análise de fenótipo por imuno-histoquímica, bem como métodos moleculares permitiu definir o padrão de expressão e função de muitos destes genes. Além análise microarray, bem como imunoprecipitação da cromatina (CHIP) forneceram informações sobre possíveis genes alvos diretos e indiretos 7,8. No entanto, ainda há muitas questões em aberto sobre os mecanismos de regulação do desenvolvimento do hipocampo, em particular o desenvolvimento do giro denteado. Para obter mais conhecimentos específicos como os genes são regulados de um sistema é necessário permitir que a manipulação de um pequeno número de células por jusante ou a sobre-regulação do gene de interesse e / ou dos seus genes-alvo e seguir o seu destino durante o desenvolvimento. No útero electroporação de shRNAs, cDNA de genes de interesse ou Cre recombinase oferece essa ferramenta. Para assegurar a presença do DNA desejado ou pequenos RNAs de plasmídeos de expressão deve ser utilizado para a electroporação. Esta abordagem é implementado com muito sucesso no estudo do desenvolvimento cortical 9,10, mas é uma abordagem mais difícil de examinar o desenvolvimento do giro denteado, devido à posição das estruturas do hipocampo em camadas mais profundas do cérebro. Eletroporação utero Ex seguido de cultura fatia organotípica é uma abordagem para contornar esse problema 11,12. Em contraste no útero não electroporação todo o embrião, mas apenas a cabeça é usada, permitindo, por conseguinte, para colocar os eléctrodos de um modo mais favorável para dirigir o shRNA / DNA para o hipocampo e giro dentado. Nosso grupo empregada com sucesso ex utero eletroporação para estudar o papel do fator de transcrição Bcl11b durante o desenvolvimento do giro denteado 8. Bcl11b tem um duplo papel no desenvolvimento do giro denteado por regulating proliferação de células progenitoras, bem como a diferenciação como foi demonstrado por imuno-histoquímica. Para definir ainda um mecanismo para o envolvimento Bcl11b nestes processos, os protocolos do grupo Polleux 11,12 foram ajustados para estudar o giro denteado, conforme descrito abaixo na secção de protocolo. Numa primeira abordagem, a questão foi abordada se Bcl11b está regulando celular diferenciação de células neuronais de forma autônoma. A segunda abordagem examinou se desmoplakin, um gene alvo direto de Bcl11b, é suficiente para recuperar o fenótipo Bcl11b.

<table><tbody><tr><td>Extrator de Micropipetas Flamejantes/Marrom</td><td>Sutter Instruments Company (EUA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Vidro Fino</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Japão</td> Unidade de Suporte Anestésico <td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizador</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Harvard do Sistema Fluovac</td><td></td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Aparelho Harvard</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Anestesia</td><td>Aparelho Harvard</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Pinças com eletrodos de disco</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>eletrodos de 3 mm para Pinças E15.5</td></tr><tr><td>com eletrodos de disco</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>eletrodos de 5 mm para E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Micrótomo de Lâmina Vibratória, 230 V</td> Microscópio de Dissecção <td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Invertido Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>Leica DM IL</td><td></td></tr> LED <tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>prato de 6 poços</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>prato de 6 poços</td><td>CELLSTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de tecidos</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>#L2020</tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Bonn Extra Fina</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>Rolamento 41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero eletroporação e organotípicas cultura slice of mouse hippocampal tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

A genética do camundongo oferece uma ferramenta poderosa para determinar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento. A análise dos fenótipos resultantes por métodos imuno-histoquímicos e moleculares fornece informações sobre potenciais genes-alvo e vias de sinalização. Para elucidar ainda mais mecanismos regulatórios específicos, é necessário um sistema que permita a manipulação de apenas um pequeno número de células de um tecido específico por superexpressão, ablação ou reintrodução de genes específicos e siga seu destino durante o desenvolvimento. Para conseguir isso, a eletroporação ex utero das estruturas do hipocampo, especialmente o giro denteado, seguida de cultura de fatias organotípicas, fornece essa ferramenta. O uso desse sistema para gerar deleções em mosaico permite determinar se o gene de interesse regula os processos de desenvolvimento autônomos da célula, como proliferação de células progenitoras ou diferenciação neuronal. Além disso, facilita o resgate de fenótipos ao reintroduzir o gene deletado ou seus genes-alvo. Em contraste com a eletroporação in utero, a abordagem ex utero melhora a taxa de atingir com sucesso as camadas mais profundas do cérebro, como o giro denteado. No geral, a eletroporação ex utero e a cultura de fatias organotípicas fornecem uma ferramenta potente para estudar mecanismos regulatórios em um ambiente semi-nativo que espelha as condições endógenas.

A ablação do factor de transcrição Bcl11b provoca a diminuição da proliferação de células progenitoras e a diferenciação neuronal resultando numa redução do tamanho do giro denteado e o número de células. Além disso neurônios mutantes não conseguem integrar-se no circuito do hipocampo causando aprendizagem e memória comprometimento 8. Para responder a perguntas sobre o mecanismo de regulação (s) de Bcl11b nestes processos eletroporação ex utero foi empregado. Dirigindo-se...

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

O objetivo geral deste procedimento é rotular e modificar células individuais do giro denteado e acompanhar seu desenvolvimento. Isso é realizado primeiramente injetando DNA em um hemisfério do cérebro no dia embrionário 15,5 ou 18,5. O segundo passo consiste em eletroporar o DNA injetado na região em desenvolvimento do giro denteado.Em seguida, cortes cerebrais são preparados utilizando um vibrátomo, e as fatias cerebrais são mantidas em cultura por até 14 dias. O passo final é a coloração imunofluorescente das fatias cerebrais utilizando anticorpos apropriados. Por fim, a microscopia confocal de imunofluorescência é utilizada para demonstrar alterações nas células granulares modificadas do giro denteado em desenvolvimento.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de neurobiologia, como o papel de genes específicos no desenvolvimento de células neuronais específicas em diferentes regiões cerebrais. No nosso caso, o fator de transcrição BC 11 B no desenvolvimento do giro. Inicie o procedimento dissecando o útero de um camundongo eutanasiado, que contém os embriões.Coloque-o em uma placa de Petri contendo de 15 a 20 mililitros de HBSS completo frio sobre gelo. Em

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem...

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Fonte: Keener, D. G., et al. Eletroporação de célula única em diferentes culturas de fatias organotípicas de neurônios excitatórios do hipocampo de camundongos e inibitórios específicos de classe. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o processo de eletroporação de célula única para introduzir DNA de plasmídeo em neurônios dentro de culturas de fatias de hipocampo de camundongos. O procedimento envolve posicionamento preciso da pipeta, ajustes de pressão e pulsos de eletroporação para...

Expressão gênica via eletroporação de célula única em culturas de fatias de hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o protocolo para eletroporação de genes de célula única em neurônios excitatórios e inibitórios em uma variedade de culturas de fatias de hipocampo in vitro. A técnica é útil para examinar funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações de proteínas transsinápticas.

Eletroporação de célula única em culturas organotípicas de fatias cerebrais: uma técnica in vitro para entregar plasmídeos dentro de neurônios-alvo em fatias cerebrais do hipocampo

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica...

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Aprenda a usar eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas para estudar o hipocampo de camundongo. Este método permite marcar e modificar células individuais do giro denteado e acompanhar seu desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

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