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Artigo de método

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

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DOI:

10.3791/52565

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18 de março de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.

Resumo

A construção de condutos vasculares é uma estratégia fundamental para o reparo cirúrgico de vasos danificados e lesados decorrentes de doenças cardiovasculares. O protocolo atual apresenta uma estratégia eficiente e reprodutível na qual enxertos de vasos de engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas (PiPSC) de fibroblastos humanos. Projetamos um biorreator de andaime de vaso descelularizado, que imita de perto a estrutura da proteína da matriz e o fluxo sanguíneo que existe dentro de um vaso nativo, para semeadura de células endoteliais PiPSC ou células musculares lisas antes do enxerto em camundongos. Essa abordagem demonstrou ser vantajosa porque camundongos imunodeficientes enxertados com enxertos derivados de PiPSC apresentaram taxa de sobrevida acentuadamente aumentada 3 semanas após a cirurgia. Este protocolo representa uma ferramenta valiosa para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular potencialmente específica do paciente em um futuro próximo.

Introdução

A construção de condutas vasculares é uma estratégia fundamental para a reparação cirúrgica de vasos danificados e feridos resultantes de doenças cardiovasculares. Até à data, materiais de enxerto utilizados em cirurgia incluem biocompatível polímeros sintéticos (politetrafluoretileno [Teflon], politetrafluoretileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] ou tereftalato de polietileno [Dacron]), enxertos, tecido autólogo (pericárdio ou veia safena) e xenotransplantes 1. Enquanto enxertos artificiais (por exemplo, Gore-Tex e Dacron) são mais comumente usados, estes materiais provável causar inúmeras complicações a curto e longo prazo que incluem estenose, a deposição de cálcio, trombo-embolia e infecções. Embora os pacientes com enxertos biológicos apresentam redução de eventos tromboembólicos, eles ainda se deparam com limitações, como a falência do enxerto secundário e durabilidade encurtado devido à calcificação degradação 2. Portanto, apesar das melhorias significativas na cirúrgico techniques longo dos anos, pesquisadores e clínicos ainda estão sobrecarregados com a necessidade de identificar a conduta ideal para doenças vasculares. Mais recentemente, no campo da engenharia de tecido vascular investigação tem gerado um conceito em que as células são incorporados em suportes biodegradáveis, com o objectivo de criar um ambiente biomimética que simboliza um recipiente funcional de um enxerto bem sucedido. Fundamentalmente, o sucesso das construções vasculares dependem de três componentes essenciais; As células que compreendem o andaime, ou seja, uma camada interior de células endoteliais e uma camada de células de músculo liso, um andaime que contém a matriz extracelular apropriado para proporcionar propriedades mecânicas comparáveis ​​à vasculatura nativa, e a sinalização celular / molecular que é necessário para iniciar / regulação reparação.

Dos enxertos a longo prazo e desenvolvimento sustentado dos neo-tecidos são altamente dependentes de semeadura de células eficaz de andaimes, thereby tornar a decisão do tipo de célula de importância crítica. Vários relatos demonstram a utilização de células endoteliais maduras e células do músculo liso a partir de várias fontes para desenvolver condutas de diâmetro pequeno 3-6. Embora promissora, a falta de vasos autólogos suficientes para se obter endoteliais maduras e células musculares lisas continuam a ser um fardo considerável. Mais recentemente, as células estaminais a partir de várias fontes têm sido exploradas para aplicações de engenharia de tecidos vasculares. Células mononucleares de fato, uma grande variedade de tipos de células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias 7, células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) 8,9, PPCPE 10,11, derivadas da medula óssea 12, células-tronco mesenquimais 13, células progenitoras endoteliais e da parede do vaso adulto -derived célula estaminal antigénio-1 (Sca-1) + de células estaminais / progenitoras 14,15 têm sido demonstradas ser capazes de se diferenciarem em células endoteliais ou funcional ou de músculo liso, em resposta a meios definidos econdições de cultura. Além disso, a capacidade de auto-renovação ilimitada das células estaminais torná-los melhores candidatos ao contrário endoteliais maduras e as células musculares lisas, que apenas se podem dividir para um número limitado de vezes antes de se submeter a paragem do crescimento e senescência.

A seleção do material andaime para gerar tecido sucesso navio projetado para enxertia depende de vários fatores, tais como biocompatibilidade, propriedades biomecânicas, e taxa de biodegradação. Fundamentalmente, os materiais usados ​​para criar suportes para os enxertos devem ser biodegradáveis ​​e não será montado receptores desnecessária respostas imunes. Além disso, ele deve abranger uma porosidade adequada e microestrutura para a fixação das células e subsequente sobrevivência. Até à data, os materiais mais comuns utilizados para suportes na engenharia de tecido vascular incluem polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, e poli-caprolactona ε 16. Mais recentemente, materiais biológicos têm decelularizadastambém sido aplicada com algum sucesso. Vários laboratórios mostraram que a semeadura vasos porcino descelularizado humano, canino ou com células autólogas proporcionado um enxerto biológico que resistiu a coagulação e a hiperplasia intimal 17-19. Outras estratégias de engenharia de tecido vascular incluem enxertos vasculares extracelulares baseada em proteínas da matriz, por exemplo, células de semeadura em gel de fibrina 13 e folhas de células geradoras sem apoio andaime 20, 21.

O actual protocolo demonstra a diferenciação de PPCPE humano em endotelial funcional e células do músculo liso, a geração de um biorreactor que consiste em um recipiente de andaime descelularizado para abrigar células vasculares PPCPE derivados funcionais, e enxerto de vasos em engenharia de tecidos de imunodeficiência combinada severa (SCID ) camundongos. PPCPE são um tipo de célula ideal para usar para engenharia de tecidos de enxertos de vasos porque essas células não formam tumores em camundongos ou aumentar ética eas respostas alo-imunes. Além disso, mostramos que a estratégia para a geração de células musculares pips-células endoteliais e pips-suave é eficiente e reprodutível 10,11. Depois disso, foi elaborado um navio descelulada para a semeadura de células vasculares PPCPE derivados para imitar de perto as proteínas da matriz que existe dentro de um vaso nativo, reforçando assim a enxertia e sobrevivência eficácia. Além disso, a descelularização dos vasos antes da semeadura PPCPE impede a ocorrência de reacções inflamatórias montados por tipos de células imunes tais como os macrófagos. Mais importante, este protocolo não representa apenas uma metodologia para gerar prometendo condutas vasculares para a tradução para os seres humanos, mas também fornece valioso meio de estudar e compreender os mecanismos moleculares que governam a regeneração do tecido vascular através de modelos de mouse.

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Protocolo

Executar todas as experiências com animais de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de uso e cuidados de animais de laboratório.

1. Preparação de Meios de Cultura

  1. Adicione meios de cultura para a linha de células de fibroblasto humano CCL-153: F-12K Médio, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina.
  2. Adicione reprogramação dos meios para geração de PPCPE: meio de Eagle modificado por KO Dulbecco (DMEM) contendo 20% de substituição KO Soro, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 Mínimo mM Meio Essencial (MEM) não-aminoácidos essenciais, 10 ng / ml do factor de crescimento básico de fibroblastos 2 (bFGF-2) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina. Adicionar bFGF-2 recém cada vez antes de usar a mídia.
  3. Adicione Diferenciação Meios (DM) para induzir células de músculo liso (SMC) diferenciação: α-MEM meio contendo 10% de FBS, factor de crescimento de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 100 U / ml de penicilina e de estreptomicina e 25 ng / ml Derivado de Plaquetas(PDGF-ββ).
  4. Adicione endotelial Diferenciação Meios (CE-MS) para induzir a diferenciação de células endoteliais (CE): crescimento endotelial meios-2 (EGM-2) meio contendo 50 ng / mL de Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina.

2. reprogramação fibroblastos humanos em induzidas Parcialmente células-tronco pluripotentes (PPCPE)

  1. Cultura linha de células de fibroblastos humanos CCL-153 em 0,04% de solução de gelatina frascos revestidos em meio de cultura.
  2. Células de passagem a cada 3 dias, à razão de 1: 6. Use as células antes da passagem 9 para otimizar a eficiência da geração de PPCPE. As células estão prontas para transfecção ao atingir 80 - 90% de confluência.
  3. Linearizar pCAG2LMKOSimO plasmídeo polycistronic contendo 4 fatores de reprogramação octâmero vinculativo fator de transcrição 4 (OCT4), SOX2, fator Kruppel-like 4 (KLF4) e C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug de plasmídeo com 5 unidades de enzima de restrição Pvul durante 3 horas a 37 ° C. Purificaro plasmídeo com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Transfectar 2 x 10 6 de fibroblastos humanos com 4 ug de plasmídeo linearizado pCAG-OSKM por electroporação com o kit de fibroblasto dérmico humano (NHDF) nucleofection de acordo com o protocolo do fabricante. Suavemente semear as células transfectadas para pré 0,04% de gelatina revestida frasco T25 contendo 5 ml de pré-aquecido reprogramação mídia.
  5. Após 24 h, alterar forma com suplementos de 25 ug / ml de neomicina para seleccionar uma população pura de células transfectadas.
  6. Alterar médio em dias alternados até dia 4.
    Nota: fibroblastos humanos tornam-se PPCPE após 4 dias de reprogramação.

3. Diferenciação de PPCPE em endotelial e nas células musculares lisas

  1. PPCPE Semente em pratos colágeno IV pré-revestidos contendo DM por 4 dias para induzir a diferenciação em células musculares lisas. Alterar médio em dias alternados até dia 4.
  2. PPCPE Semente sobre o colágeno IV pré-revestidas pratos containing endotelial-DM durante 6 dias para induzir a diferenciação em células endoteliais. Alterar médio em dias alternados até dia 6.

4. descelularizado Aorta Graft Preparação

Nota: Todas as soluções e equipamento deve ser estéril.

  1. Sacrifique o mouse por deslocamento cervical e corrigir o mouse em uma posição supina sob dissecção microscópio.
  2. Corte através do esterno e em torno da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Retirar o coração, pulmões e esôfago para expor a aorta. Com cuidado, retire a gordura peri-aorta com uma pinça.
  3. Corte a aorta a partir do final anterior com uma tesoura e gentilmente segure a ponta com uma pinça sem corte. Retire a aorta da coluna vertebral para trás por dissecção romba. Feche cuidadosamente todas as artérias se ramificam a partir da aorta por ligação com um electrocoagulador bipolar e corte a partir da extremidade da ligação com uma tesoura.
  4. Use uma seringa de 5 ml para irrigar o lúmen da aorta com 3 ml de solução salina contendo 100 U de heparina para prevenir a formação de coágulos sanguíneos.
  5. Corte a extremidade posterior da aorta antes de se ramifica na renal. Manter a integridade da aorta é muito importante durante todo o procedimento.
  6. Lave o lúmen da aorta ascendente com 5 ml de solução de 0,075% de dodecil sulfato de sódio (SDS), diluída em tampão fosfato salino (PBS).
  7. Mergulhe a aorta torácica em solução SDS 0,075% em uma placa de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm à temperatura ambiente.
  8. Lave o lúmen da aorta com 5 ml de PBS.
  9. Mergulhe a aorta na PBS em uma placa de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm à temperatura ambiente. Refresque PBS a cada 20 min.
  10. Lave o lúmen da aorta com 5 ml de PBS.
  11. Manter enxerto aorta descelularizado em PBS a 4 ° C durante até uma semana.

5. Dupla Sementeira de PPCPE e Bioreactor Condicionado

Nota: Toda a soluçãos e o equipamento deve ser estéril. Realizar todas as operações em uma capa de cultura de tecidos.

  1. Montar o circuito de fluxo biorreactor, como ilustrado na Figura 1. Ligue câmara de incubação, meios reservatório, bomba peristáltica, e câmara de conformidade com tubagem. Volume mínimo de meio necessário para a circulação é de 40 ml.
  2. Pré-condição do navio descelularizado com meio de cultura por imersão da aorta em meio DM em um prato de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 1 h, a 50 rpm à temperatura ambiente.
  3. Inserir um centímetro de comprimento de nylon tubos (OD 0,9 milímetros, 0,75 milímetros ID) em ambas as extremidades do recipiente de descelularização sob microscópio. Amarre a embarcação e os tubos com 8-0 suturas de seda.
  4. Montar o enxerto descelularizado aorta na câmara de incubação, ligando os tubos de nylon com as portas de entrada e de saída (1/32 ") de tubagem a partir da parede da câmara. Manter a câmara de incubação com 5 ml de meio de cada vez.
  5. Trypsinize PPCPE adicionando pré-aquecidotripsina para cobrir a placa de cultura e agite levemente o prato 10 vezes. Descarte a tripsina e deixar o prato na incubadora por 2-3 min. Adicionar meio de cultura pré-aquecido no prato e misturar o meio com as células.
  6. Contar o número de células usando um hemocitômetro. Centrífuga de duas alíquotas de suspensões de células contendo 5 x 10 5 células por cada 5 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante completamente.
  7. Depois de aspirar o sobrenadante completamente, ressuspender um sedimento dos pips sedimentos celulares em 50 ul de DM. Injetar a suspensão de células no lúmen do vaso descelularizados.
  8. Em seguida, voltar a suspender o outro pellet pips celular em 100 ul de Matrigel. Pipeta cuidadosamente a mistura sobre o enxerto aorta descelulada.
  9. Espere por 10-15 min até que a mistura se transforma em um estado de gel-like e uniformemente envolve em torno de superfície externa do navio. Encha a câmara de incubação com DM.
  10. Colocar todo o biorreactor configuração em um 5% de CO2 a 37 ° C. Rodar manualmente o enxerto descelularizado 90 ° em torno do eixo longitudinal a cada meia hora durante as primeiras 2 horas.
  11. Mantenha cultura estática durante 12 horas para permitir a adesão celular.
  12. MS entregar através do lúmen pela bomba peristáltica para induzir a diferenciação de células de músculo liso. Iniciar a taxa de fluxo inicial de 5 ml / min e aumento gradual de 20 mL / min ao longo de 24 h.
  13. Manter a taxa de fluxo do meio que circula em 20 ml / min durante 24 horas.
  14. Interromper o fluxo médio e mover a configuração fora da incubadora biorreator.
  15. Re-semente a luz do enxerto com PPCPE. Trypsinize, contar e centrífuga de 1 x 10 6 PPCPE como nos passos 5,5-5,6. Ressuspender as células em 50 ul de meio EGM-2 contendo 50 ng / ml de VEGF. Injectar a mistura de células para o lúmen do enxerto.
  16. Alterar a forma da câmara de incubação e toda a circulação de meio EGM-2 que continha 50 ng de VEGF / mL para induzir a diferenciação endotelial.
  17. Mova o biorreator configuração de volta ao the incubadora. Rodar manualmente o enxerto 90 ° de cada 30 min durante as primeiras 2 horas e, em seguida, manter uma cultura estática, durante 12 h.
  18. Começar a circular o fluxo de 5 ml / min e aumento gradual de 35 ml / min. Manter a taxa de fluxo a 35 ml / min, durante 5 dias. Alterar circulando e médio câmara a cada dois dias.
  19. Colher o enxerto de engenharia para posterior enxertia para mouse.

6. Alongamento das Duplo-semeado PPCPE Graft em Ratos

  1. Uso NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl ratos macho como receptores de enxertos navio. Assegure-se sempre que os ratos são cerca de 10 semanas de idade, pesar cerca de 25 - 35 g, e estão em boas condições de saúde.
  2. Anestesiar rato destinatário através da administração de uma combinação de Hypnorm (25 mg / kg) e Hypnovel (25 mg / kg) por via intraperitoneal. Aplique vaselina pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Confirme anesthetization eficiente, garantindo que os ratos têm músculos relaxados e está respirando de forma constante.
    1. Corrigir o mouse em decúbito dorsal com o seu pescoço raspada e estendida. Administrar sulfato de atropina (1,7 mg / kg) em combinação com os anestésicos para assegurar que o tracto respiratório do rato permanece claro.
  3. Prepare uma incisão na linha média da mandíbula para esterno do mouse. Sob um microscópio de dissecação com 5- a 10-vezes a amplificação, levantar as glândulas salivares direita lateralmente e remover o músculo cleidomastoid direito para expor a artéria carótida comum direita.
  4. Suavemente remover tecidos ligados a mobilizar a artéria carótida comum direita a partir da extremidade distai para a extremidade proximal. Ligadura a porção média da artéria carótida comum, duas vezes com uma sutura de seda 8-0 e dissecar entre os dois laços.
  5. Passe por uma braçadeira feita de tubo de nylon autoclavable em cada extremidade do vaso e corrigir cada extremidade com grampos microhemostat.
  6. Remover laço de sutura numa extremidade e aplicar uma gota de heparina (100 U / ml). Imediatamente depois, inverter a extremidade distal do the artéria para cobrir todo o corpo cuff e corrigir o navio invertido com uma sutura 8-0 seda para o manguito.
    1. Repetir o mesmo procedimento para a outra porção da artéria. Lave artéria com solução salina para remover coágulos sanguíneos.
  7. Implantar um enxerto navio descelulada entre duas extremidades da artéria carótida, deslizando as extremidades dos vasos decelularizadas do ao longo dos punhos das artérias e fixando-o com fio de seda 8-0. Remover pinças vasculares a partir de qualquer termina antes de avaliar a pulsação do enxerto.
  8. Coloque a glândula salivar de volta à sua posição original. Fechar a pele sobre o local cirúrgico com uma sutura interrompida utilizando um fio de sutura 6-0 de poliglactina.
  9. Consistentemente observar os sinais vitais do rato após o procedimento for concluído, até que ele retoma a consciência. Sacrifique ratos receptores por luxação cervical e vasos colheita enxertos ou 24 horas ou 3 semanas mais tarde, para posterior análise.

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Resultados

A geração bem sucedida de PPCPE foi confirmada 4 dias após nucleofecting fibroblastos humanos com um plasmídeo linearizado pCAG2LMKOSimO transportando quatro fatores de transcrição, Oct4, SOX2, KLF4 e c-Myc (OSKM). PPCPE apresentaram um fenótipo marcadamente distinta quando comparados com os fibroblastos (Figura 2A) e expressa os quatro factores de reprogramação no ARNm (Figura 2B) e de proteína (Figura 2C) 10 níveis. A eficácia de um enxerto vascular com bas...

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Discussão

O protocolo atual indica um som, rápido, estratégia simples, eficiente e reprodutível em que os navios da engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando PPCPE a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular específico paciente potencialmente no futuro próximo. As etapas críticas para assegurar a eficácia do protocolo inclui a preparação de PPCPE, preparação de aórticos descelularizados totalmente estéreis e, semeadur...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela The British Heart Foundation e pela The Oak Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fibroblastos Humanos CCL-153ATCCCCL-153Fibroblastos embrionários humanos pré-natais
ATCC F-12K Medium (Modificação de Kaighn do Meio F-12 de Ham)ATCC30-2004
Soro FetalBovino ATCC30-2020
Nocaute Meio DMEM otimizado para células-tronco embrionáriasLife technologies (Gibco)12660-012
Knockout Serum ReplacementLife technologies (Invitrogen)10828-028
Human Basic FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
meio alfa-MEMTecnologias de vida (Invitrogen)32571093
PDGF humanoR& D System120-HD-001
Solução de Gelatina 2%SigmaG1393
Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)Addgene20866
  Enzima de Restrição PvuINew England BiolabsRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
Kit de Nucelofection (Kit NHDF)LONZAVPD-1001
NeomicinaSIGMAG418
KL 1500 LCD, Iluminação para Microscopia EstéreoSCHOTTKL 1500 LCDIluminação de luz fria para microscopia estéreo
Esteromicroscópio Zoom Nikon SMZ800NikonSMZ800
Sal de sódio de heparinaSigmaH3393
10% SDS Solução de estoque Reagente de biologia molecularSevern BiotechCAS 151-21-3
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigmaD8537
Matrigel (10mg / ml)BDA6661
Agitador IKA Vibrax com plataforma vibratória VX 7 Jepson Bolton, Janke & KunkelS32-102
Masterflex L/S Bomba Digital DriveCole-ParmerWZ-07523-80
Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump headCole-ParmerEW-07519-15
Masterflex L/S large cartridges for pump headCole-ParmerEW-07519-75
Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ftCole-Parmer WZ-96410-14A tubulação passa pela bomba peristáltica
0.5mm ID, 0.8 mm OD Tubulação de SiliconeSILEXN/AAs tubulações conectam a câmara de incubação, o reservatório de mídia e a câmara de conformidade 
Redutor de Conexão 0.5 para 1.6, Polipropilina NaturalIbidi10829Adaptador conecta acima dois tipos de tubos
/32" Tubulação, ID 0.01" (250µ m) Material: PEEKLabSmithT-132-010PTubulação através da parede da câmara de incubação que conecta o enxerto com a tubulação externa
Conexões de uma peça LabSmithT-132-100Fixe os tubos acima através da parede da câmara de incubação
Tubos de nylon (OD 0.9mm, ID 0.75mm) Os tubos Smiths MedicalN/Asão inseridos em duas extremidades do enxerto de aorta
NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl camundongoCharles River
Suturas cirúrgicas, 8-0  sedaETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000Neuroleptanalgésico para uso em camundongos
Hypnovel (Midazolam)Roche59467-70-8Indução de anestesia
Microscópio de dissecaçãoCarl ZeissTubo de Nylon Stemi 2000
Portex LTD800/200/100/2000,65 mm de diâmetro e 1 mm de comprimento; para fazer manguito de artéria
EletrocoaguladorMartin SN 54.131Ligadura de ramos da artéria na aorta
Micro fórceps hemostático bipolarMartin80-91-12-04Fixação das extremidades dos vasos
Dilatador de vasosS & TJFX-7
Dilatador de VasoS & TJFL-3dZ
Dilatador de VasoS & TD-5aZ
Mini aplicador AESCULAPFE572K
Micro clipes hemostáticosAESCULAPFE720K
Suturas cirúrgicas, 6-0 VICRYLETHICONV489
1

Referências

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