O aumento de artéria pulmonar fluxo pulsátil melhora Hypoxic Hipertensão Pulmonar em Leitões

Resumo

A hipertensão pulmonar está associada a uma redução significativa da pulsatilidade, contratilidade e elasticidade da artéria pulmonar, contribuindo para um aumento da pressão e da resistência pulmonar. Usando um modelo de leitão hipóxico, este estudo demonstrou que melhorar a plasticidade da artéria pulmonar usando um cateter pulsátil recém-desenvolvido melhora a hipertensão pulmonar hipóxica.

Resumo

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença que afeta as artérias pulmonares distais (PA). Estas artérias são deformados, levando à insuficiência ventricular direita. Os tratamentos atuais são limitadas. Fisiologicamente, o fluxo de sangue pulsátil é prejudicial para a vasculatura. Em resposta ao estresse pulsátil sustentado, vasos liberar óxido nítrico (NO) para induzir vasodilatação para auto-proteção. Com base nesta observação, este estudo desenvolveu um protocolo para avaliar se um fluxo de sangue pulsátil pulmonar artificial poderia induzir uma diminuição dependente de NO na pressão da artéria pulmonar. Um grupo de leitões foi exposta a hipoxia crónica, durante 3 semanas, e em comparação com um grupo de leitões de controlo. Uma vez por semana, os leitões foram submetidos ao ecocardiograma para avaliar a gravidade HAP. No final da exposição a hipoxia, os leitões foram submetidos a um protocolo pulsátil utilizando um cateter pulsátil. Depois de ter sido anestesiados e preparados para cirurgia, a veia jugular do leitão foi isolado e a cAtheter foi introduzido através do átrio direito, o ventrículo direito ea artéria pulmonar, sob controle radioscópico. A pressão arterial pulmonar (PAP) foi medida antes (T0), imediatamente depois (T1) e 30 min depois (T2), o protocolo pulsátil. Demonstrou-se que este protocolo pulsátil é um método seguro e eficaz de indução de uma redução significativa na PAP média através de um mecanismo dependente de NO. Esses dados abrem novas perspectivas para o manejo clínico da HAP.

Introdução

A hipertensão arterial pulmonar é uma doença fatal que afeta a vasculatura pulmonar. Existe um consenso no campo que um desequilíbrio entre o aumento na vasoconstritores (endotelina, a serotonina) e uma diminuição no vasodilatadores (NO, prostaciclina) contribui para o desenvolvimento de HAP. Ao longo do tempo, este fenótipo pró-constritiva evolui para um fenótipo pró-proliferativo e anti-apoptótica complexo, contribuindo para o desenvolvimento de lesões vasculares ^1.

A exposição prolongada a vasoconstritores leva a um aumento significativo e sustentado na [Ca2 ^+] _i em artéria pulmonar de células do músculo liso, o que permite a activação de vários factores de transcrição regulados em cálcio, tais como NFAT ^2-4, promovendo a proliferação e PASMC resistência a um apoptose fenótipo ^5. Este fenótipo leva a lesões vasculares pulmonares, contribuindo para um aumento na pressão PA e res pulmonaresistance, o que acaba por conduzir a insuficiência cardíaca direita fatal ^6.

Actualmente, não existe nenhum tratamento disponível que inverte HAP embora existam vários que melhoram a qualidade de vida dos pacientes ^7. Entre estes tratamentos, a eficácia do NO inalado tratamento foi demonstrada, mas devido à sua curta semi-vida é de difícil utilização na prática clínica. Por esta razão, os tratamentos mais estáveis ​​e duráveis ​​têm sido preferidos, tais como análogos da prostaciclina, ou bloqueadores do receptor de endotelina ^7. Para desenvolver melhores tratamentos, é essencial para melhorar e ampliar o conhecimento da fisiopatologia da HAP.

Pulsatilidade é um estímulo bem conhecido activação vasodilatação induzida por tensão de corte, de proteger a artéria distai não elástico de lesões de fluxo de alta pressão ^8,9. Em um modelo de HAP secundária a shunt aortopulmonar cirúrgico, Nour et al. Demonstraram str cisalhamento intrapulmonarmediada por ess realce a função endotelial ^10. Vários estudos têm demonstrado que o NO, prostaciclina e ET-1 expressão estão estreitamente regulada por alterações no fluxo pulsátil. De fato, um aumento moderado do fluxo pulsátil aumenta a atividade da eNOS e os níveis de prostaciclina, sendo que ambos são reduzidos em HAP. Modulação de fluxo pulsátil provavelmente está implicada na etiologia da hipertensão arterial pulmonar e aumento artificial é uma forma atractiva e de novo a aumentar a produção de NO e prostaciclina na circulação pulmonar.

O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos de um 10 min fluxo pulsátil através de um cateter pulsátil desenvolvido recentemente em medidas hemodinâmicas em um modelo de hipertensão pulmonar (HP) em leitões em quem foi induzida hipóxia. Postula-se que o aumento da pulsatilidade da artéria pulmonar induz relaxamento vascular das artérias pulmonares, diminuindo assim a pressão da artéria pulmonar.

Gato cardíaca direitaheterization (RHC) é uma intervenção clínica fundamental para o diagnóstico e acompanhamento de pacientes com HAP. Na verdade, é a maneira mais confiável de diagnosticar HAP e permite aos médicos para avaliar a reatividade vascular ^11,12, bem como a progressão da doença. Na verdade, cada paciente HAP sofre RHC várias vezes. O presente estudo em animais de grande porte tem como objetivo demonstrar a eficácia e segurança de cateteres pulsátil na avaliação e tratamento da hipertensão arterial pulmonar durante um procedimento normal RHC. Porque cateteres pulsátil já estão disponíveis e RHC é realizada rotineiramente em pacientes com HAP, este estudo fornece todas as informações necessárias para ser capaz de realizar ensaios clínicos rapidamente.

Protocolo

NOTA: Este estudo foi autorizado pela comissão de Ética número CEEA34.PB.103.12.

1. Utilização de Leitões como um modelo animal

1. Realize o em dois grupos (n = 6 em cada grupo), casadas em termos de sexo, idade (15 ± 3 meses) e peso (30 ± 10 kg) (grupo controle e hipóxia crônica (CH) do grupo). Casa do grupo CH por 3 semanas em uma câmara hipobárica (0,4 atm), ea casa do grupo controle em normobaric regulares (1 atm) condições.
2. Usar uma câmara hipobárica que consiste de uma caixa de plexiglass com uma pegada de 2 metro quadrado e uma altura de 1,6 metros, como se mostra na Figura 1.
3. Continuamente monitorizar e manter uma temperatura de 18 ° C e uma pressão de 0,4 atm. Proporcionar uma ventilação adequada por uma bomba de vácuo, permitindo uma taxa de renovação de ar de 8 m ³ por hora.
4. Coloque dois animais na câmara do lixo apropriado. Cada 48 horas, volte a pressão na caixa à condições normobáricas para metadeuma hora para limpar a caixa, na presença dos dois animais, com a caixa mantida closedto impedi-los de escapar. Este método de indução de hipertensão pulmonar tem sido amplamente validado ^13.
5. A anestesia dos animais
   1. Anestesiar os leitões com uma injecção intravenosa inicial de tiopental sódico (10 mg / kg) e manter a anestesia por inalação de isoflurano contínua (1,5 a 3,5%). Aplique duas gotas de gel Carbopol nos olhos dos leitões para prevenir o ressecamento da córnea.
   2. Colocar os animais em decúbito lateral esquerdo com suas patas dianteiras amarradas em uma posição flexionada para expor o peito. Limpe a pele com água e sabão e, em seguida, fazer a barba usando um barbeador elétrico para remover qualquer cabelo que poderiam impedir a penetração do ultra-som através do peito.
6. Ecocardiograma
7. Acompanhar o desenvolvimento da HAP longitudinalmente e não-invasiva por ecocardiografia. Execute um eco cada semana usando um transdutor de 3 MHz. Record um eletrocardiograma, colocando três eletrodos nas patas direita e esquerda e no lado direito do peito.
8. Grave bidimensionais e M-mode dados de imagem em três incidências diferentes (longitudinal, eixo menor e apical) usando sonda a-Doppler. Segure a sonda na mão direita e lugar entre os quarto e quinto espaços intercostais esquerdos. Mover a sonda lentamente para cima e para baixo, girando-o à direita e à esquerda até uma boa resolução de imagem é obtida para as diferentes estruturas cardíacas (ou seja, o septo). A janela acústica difere ligeiramente de um animal para outro, dependendo da posição do coração no peito.
9. Grave o ECG ao mesmo tempo para cada um destes incidentes e por pelo menos 10 ciclos cardíacos para permitir análise off-line. Diástole final é definido como o ponto no ciclo cardíaco coincidindo com o início da onda Q no ECG. Sístole final coincide com o início da onda T.
10. Medir o fluxo sanguíneo da válvula mitral e tricúspide por umultra-som Doppler vista Pical. Coloque a-Doppler sonda na ponta do manúbrio; a zona de amostragem estava localizada imediatamente acima da válvula para registar o fluxo do sangue de atravessar a válvula.
11. Grave a velocidade do sangue durante o ciclo cardíaco por dopplerfluxometria para obter a velocidade-tempo integral do fluxo de sangue através das válvulas mitral e tricúspide e as valvas aórtica e pulmonar. Use a matriz gráfica de vídeo do ecógrafo para armazenar imagens em uma taxa de quadros de 25 por segundo, a fim de obter imagens fixas ou imagens seqüência fornecidos pelo ecógrafo.
12. Medir as dimensões e área de superfície das cavidades cardíacas utilizando instrumentos de medição e os contornos das áreas de superfície propostos pelo software integrado no ecógrafo de acordo com as recomendações internacionais ^14.
13. Meça a espessura livre do ventrículo direito parede durante a diástole e sístole por TM (tempo-motion) de gravação em eixo menor incidência ^14.
14. MeaCertifique-se o diâmetro da raiz da artéria pulmonar na ponta das válvulas pulmonares na visão eixo menor ^14.
15. Medir o septo e a parede posterior do ventrículo esquerdo durante a diástole na TM movimento na vista longitudinal no início das ondas Q no ECG e em sístole na ponta da onda T do ECG ^14.
16. Medir o diâmetro do ventrículo esquerdo diastólico final (DDVE) e diâmetros sistólico final do ventrículo esquerdo (DSFVE). Calcular encurtamento fraccional (FS), utilizando a fórmula FS (%) = (DDFVE-DSFVE) / DDFVE. Medir o diâmetro da aorta e a área de superfície da aurícula direita e à esquerda.
17. A partir da velocidade-tempo integral da mitral e os fluxos sanguíneos tricúspide, medir o seguinte: amplitude máxima da onda E e A, a desaceleração do intervalo da onda E, índice de duração, velocidade-tempo ¹⁴ fluir.
18. A partir de medições Doppler da artéria pulmonar, medir o seguinte: velocidade máxima, ascensão meio-tempo,fluir duração e sua integral ^14.
19. Avaliar o volume do ventrículo esquerdo pelo método de Simpson ^15.
20. Armazenar os dados para cada leitão em um banco de dados para posterior análise estatística em todo o grupo.

2. Coração Direito Cateterismo

1. Preparação animal
   1. Antes da colocação do cateter pulsátil, porco é colocada numa câmara hipobárica durante 3 semanas, a fim de induzir a hipertensão arterial pulmonar.
   2. Jejuar os animais durante 24 horas antes da cirurgia (24 horas para alimentos sólidos, de 8 a 12 horas, para a água).
   3. 24 horas antes de RHC, ter um veterinário bem treinado realizar um exame clínico pré-anestesia para avaliar cor mucosas, tempo de enchimento capilar, pulmão global e funções do coração usando um estetoscópio e temperatura do corpo usando um termômetro retal.
   4. Administrar as injecções de midazolam (intramuscular, 0,5 mg / kg) e cloridrato de morfina (intramuscular, 0,1 mg / kg) de 15 a 30 min antes da indução of anestesia. Repita injecção de cloridrato de morfina (0,05 a 0,5 mg / kg, por via intramuscular), durante a indução cada 4 a 6 horas.
   5. Administrar tiopental sódico (10 mg / kg, intravenosa) através de uma injecção de bólus inicial de 5 mg / kg seguida por injecção parcial até que fosse eficaz. Siga este por bolsa e máscara de ventilação até a intubação traqueal.
   6. Intubação Leitão
      1. Lubrifique o tubo com gel pramocaine. Insira uma caneta de metal para dentro do tubo para endurecer-lo e facilitar o processo de intubação.
      2. Toque na pálpebra para assegurar a anestesia profunda. Realizar intubação por visualização direta da laringe, usando um laringoscópio para elevar a língua e evitar danos ao cabo vocal. Inflar o balão do tubo para evitar problemas relacionados com a regurgitação.
   7. Controle a taxa respiratória em 10-12 respirações por minuto; volume de corrente de 7-10 ml / kg, a pressão de insuflação de 25 a 30 cm de H ₂ O e uma fase inspiratória de 2 segundos com um e positivand pressão expiratória de 5 cm H ₂ O.
   8. Anestesiar os animais com isoflurano em 100% de oxigénio (3-5% de indução com o fluxo de oxigénio de 2 a 3 L / min, a manutenção do fluxo de oxigénio de 1,5-2,5% em 1 L / min). Aplicar gel de carbopol à córnea como no passo 1.5.1.
   9. Inserir um cateter heparinizado na artéria auricular caudal (5 ml de 0,9% de solução salina enriquecida com 5000 UI / ml de heparina) através de infusão subcutânea com cânula verde fixada no lugar com um ponto de sutura.
   10. Infundir solução de Ringer com lactato (10-20 ml / kg / h).
   11. Colocar o animal em uma mesa de exame ligeiramente inclinada. Mantenha a cabeça ligeiramente inclinada para baixo para promover o fluxo salivar.
2. Monitoração
   1. Cada 5 min, verificar e registrar os seguintes valores no indivíduo relato de caso anestesia: cor mucosas e tempo de enchimento capilar, tônus ​​muscular mandibular e posição do globo ocular, miosis / midríase, reflexo palpebral.
   2. Monitorar continuamente o coração e respirataxa tory, oximetria de pulso, temperatura corporal e eletrocardiogramas. Insira um introdutor arterial na artéria femoral. Insira um grande calibre 10 cm de comprimento do cateter, na artéria femoral e monitorar a pressão arterial sistêmica.
3. Criação do cateter pulsátil
   NOTA: Este dispositivo médico consiste de dois cateteres colocados lado-a-lado e soldadas entre si. A parte distal do primeiro está ligado a um balão standard com um diâmetro de 20 mm e uma capacidade máxima de volume de 5 ml. O segundo cateter permite a inserção de um fio para facilitar o posicionamento na artéria pulmonar. O dispositivo é de 750 mm de comprimento com um medidor interno de 0,035 e um diâmetro externo de 12 Fr.
   1. Para as experiências, realizar pulsação com um pequeno ventilador de animais Harvard 683, que se aplica um vácuo activo para o balão durante a deflação e pressão positiva durante o enchimento, com um volume de 2,5 ml por cada impulso. Use hélio como gás propulsor para a bolaoon bomba, a fim de evitar a embolia gasosa.
   2. Registam-se os traçados eletrocardiográficos de superfície continuamente para documentar quaisquer alterações do ritmo cardíaco durante o protocolo. Na artéria femural esquerda, ligar-se um dispositivo sensor para um cateter de calibre 20, ligada a um sistema de monitorização hemodinâmica.
4. O cateterismo cardíaco direito
   1. Lavar e raspar o pescoço do animal. Limpar a pele com uma solução anti-séptica cutânea (esfoliação Betadine) utilizando uma compressa de gaze. Para demarcar o local cirúrgico, coloque campos estéreis ao redor do jugular direita entre o ombro direito eo manúbrio.
   2. Faça uma incisão longitudinal de 4 cm, com tesoura estéril a meio caminho entre o ombro direito eo manúbrio.
   3. Remova cuidadosamente as camadas da pele e do músculo com uma pinça. Em seguida suavemente remover o tecido conjuntivo em torno da veia ao longo de um comprimento de cerca de 5 cm. Prenda o lado distal para prevenir hemorragias. Coloque um fio ligante em torno do proximal lado para poder controlar a abertura da veia pós-hemi secção.
   4. Usando um pequeno cinzel muito afiada específico, cortar a veia ao meio transversalmente. Certifique-se de que as bordas da incisão são arrumados. Usando espuma fina, levantar um bordo da incisão e empurre o cateter no lado proximal da veia. Controle do sangramento com fio ligante.
   5. Introduzir o cateter na veia jugular e empurrar sucessivamente através da veia cava superior, aurícula direita, do ventrículo direito e, finalmente, a artéria pulmonar.
   6. Grave as pressões ao longo de 10 ciclos cardíacos estáveis, em cada cavidade cardíaca ea artéria pulmonar (T0). Medida de sangue cardíaco fluxo três vezes em intervalos de 1 minuto.
   7. Posicione o cateter balão na artéria pulmonar sob controle radioscópico. Inflar e desinflar o balão (pulsação) com 1 ^cm3 de hélio. Continuar pulsação durante 10 min. Pressões gravar mais de 10 ciclos cardíacos estáveis, em cada cavidade cardíaca e da arte pulmonarry e medir o fluxo sanguíneo cardíaco após 10 min (T1).
   8. Medir o fluxo de sangue cardíaco novamente 30 min depois do protocolo de pulsatilidade (T2).

3. NO Medição

1. Conecte-se um saco de Douglas para o tubo de saída de gás respiratório exalado até que esteja completamente preenchido. Coloque-o sobre a in-pipe de um analisador de NO respiração.
2. Lentamente e constantemente forçar o ar exalado no analisador comprimindo o saco de Douglas elástica. Medir o saco de escoamento pelo medidor de fluxo do analisador, para manter um fluxo constante.

4. Medições Histologia

1. Sob anestesia, injectar 30 ml de Dolethal (solução injectável para eutanásia) no cateter pulsátil colocado no coração.
2. Imediatamente após a eutanásia, abra o baú serrando o manubrium longitudinalmente, ligeiramente mover o coração e manter o pulmão direito. Em seguida, utilizando tesouras de dissecação, cortados dois 2 ou 3 ^cm3 amostras a partir da middle lóbulo do pulmão.
3. Pressão congelar uma amostra em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Fixar a segunda amostra em 3,7% de paraformaldeído durante 24 h e, em seguida, incorporar em parafina para análise histológica subsequente.
4. Realizar medições de histologia, como descrito anteriormente ^16. Medir a espessura da parede PA como se segue: 2 medições / artéria 10 em artérias / leitão e em leitões 6 / grupo.
5. Realizar a análise estatística. Os valores foram expressos como a mudança vezes ± SEM.
   1. Para comparar dois meios, utilize o teste t de Student não pareado um. Para comparar mais de duas médias, use uma ANOVA one-way, seguido pelo teste de Dunn. Um p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo (*).

Resultados

O aumento de artéria pulmonar fluxo pulsátil Melhora Crónica Induzida Hypoxic Hipertensão Pulmonar em Leitões

Antes da exposição dos animais a um aumento do fluxo pulsátil, ultra-sons foi utilizado de forma não invasiva para verificar que os leitões tinham desenvolvido hipertensão pulmonar. Como mostrado na Figura 2, com três semanas de hipóxia crónica induzida o desenvolvimento de hipertensão pulmonar em leitões, caracterizada por uma redução significativa no tempo de acele...

Discussão

Pela primeira vez, mostrou-se que as alterações do fluxo pulsátil pulmonar está causalmente relacionada com o desenvolvimento de hipertensão arterial pulmonar hipóxica secundária à exposição crónica. Esta abordagem translacional fornece evidências de que induzir um aumento artificial fluxo pulsátil pulmonar utilizando um cateter projetado especificamente melhora a hipertensão pulmonar, provavelmente pelo aumento NO geração.

Estes resultados não são apenas original, eles são também de grande ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Medicamentos para anestesia
tiopental sódico, THIOPENTAL SODIUM	Abbott, França	0000071-73-8	pó 3 lugar Gustave Eiffe 94518 RUNGIS CEDEX.
isoflurano, FORANE	Abbott, França	05260-05	frasco de vidro 250 ml 3 place Gustave Eiffe 94518 RUNGIS CEDEX.
midazolam, Hypnovel	Accord Healthcare		Ampolas injetáveis Vidal 1mg/ml 45 Rue du Faubourg de Roubaix 59000 Lille France
pramocaine,TRONOTHANE 1%	Laboratoires LISAPHARM	Vidal	Gel appl locale T/30g 3, rue Scheffer. 75016 Paris.
morfina cloridrato Lavoisier	CMD Lavoisier Laboratoires CHAIX et DU MARAIS	Vidal	ampolas injetáveis  7, rue Labie -75017 Paris - França
Copolímero de Acrilatos-Carbopol® Aqua SF-1 Polymer	Lubrizol		gel appl local Elysé es La Dé fense 19 le Parvis 92073 Paris la dé Material da fense
Ventilateur Harvard 683	Aparelho Harvard	Aparelho	Harvard DRIM 75 rue des Anglais - 78700 Conflans Ste Honorine
Echographe Voluson E8 com uma sonda de 3,5 MHz	General Electric	GEHealthcare	DRIM 75 rue des Anglais - 78700 Conflans Ste Honorine
Cateter Pulsatil	Sistema inovador		Sistemas inovadores de cardio, 33 rue Vivienne, Paris, França 75002
SEM respiração Analisador	Respur Respur		26 rue Felix Rouget 95490 Vaureal França