Um método conveniente e poderoso para estudar a autofagia em Penicillium chrysogenum usando almofadas de fome (misturas de agarose e água da torneira em uma lâmina de microscópio contendo uma cavidade central) é apresentado aqui.
Um método conveniente e poderoso para estudar a autofagia em Penicillium chrysogenum usando almofadas de fome (misturas de agarose e água da torneira em uma lâmina de microscópio contendo uma cavidade central) é apresentado aqui.
O estudo dos sistemas de controle de qualidade celular emergiu como um campo altamente dinâmico e relevante da pesquisa contemporânea. Ficou claro que as células possuem várias linhas de defesa contra danos a moléculas biologicamente relevantes, como ácidos nucléicos, lipídios e proteínas. Além da dinâmica das organelas (fusão/fissão/motilidade/herança) e da atividade da protease rigidamente controlada, a degradação de organelas excedentes, danificadas ou comprometidas pela autofagia ('auto-alimentação' celular) tem recebido muita atenção da comunidade científica. A regulação da autofagia é bastante complexa e depende de fatores genéticos e ambientais, muitos dos quais até agora não foram elucidados. Aqui é apresentado um novo método que permite o estudo conveniente da autofagia no fungo filamentoso Penicillium chrysogenum. Baseia-se no crescimento do fungo nas chamadas 'almofadas de fome' para estimulação da autofagia de maneira reprodutível. As amostras são testadas diretamente por microscopia e avaliadas quanto à indução/progresso da autofagia. O protocolo aqui apresentado não se limita ao uso com P. chrysogenum e pode ser facilmente adaptado para uso em outros fungos filamentosos.
Os fungos filamentosos são excelentes sistemas de modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento. Eles oferecem vários benefícios experimentais como cultivo barato, um elevado número de descendentes e acessibilidade genética. O último ponto é de particular relevância para a construção de transformantes que permite que se investigue a importância de genes tão longe descaracterizados para vários mecanismos celulares. Os fungos filamentosos têm sido fundamentais para a elucidação de vários elementos e mecanismos de controlo de qualidade das vias celulares, como a actividade de protease para a degradação de proteínas anormais, dinâmica mitocondrial para manter a i....
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1. Preparação de P. chrysogenum para os experimentos de fome
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Para demonstrar a utilidade do protocolo detalhado acima degradação de peroxissoma no P. chrysogenum estirpe Ws54-1255 (GFP-SKL) foi analisada. Nesta estirpe GFP-SKL é geralmente importada para peroxisomes 9. Isto resulta no aparecimento de múltiplas formas esféricas quando a amostra é analisada através de microscopia de fluorescência. Se ocorrer a autofagia, vacúolos ampliar. GFP-SKL é incorporado vacúolos por autofagia (pexophagy). Devido ao facto de que a GFP é resistente à degradação por protease.......
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O método aqui apresentado permite o estudo conveniente e reprodutível de autofagia em P. chrysogenum. Por exemplo, ele pode ser usado para o rastreio de a eficácia de vários compostos se eles são capazes de modular a resposta autofagia deste fungo ou não. Os resultados obtidos com rapamicina demonstram que a inibição da sinalização de TOR conduz a uma indução de autofagia pronunciada em P. chrysogenum que foi também demonstrada para outros organismos 11.
É possív.......
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O autor não tem nada a divulgar.
CQS recebe uma bolsa do LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). O autor gostaria de agradecer a Ida J. van der Klei pelas cepas de P. chrysogenum usadas neste trabalho e a Andreas S. Reichert pelo presente da rapamicina.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas de microscópio com cavidade central | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha | H884.1 | Podem ser usadas várias vezes após a limpeza. |
| Contas de vidro | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha | A553.1 | Diâmetro: 0,25 - 0,50 mm |
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