Protocol
Estudo aprovação: Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (Roma, Itália) de acordo com o Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "della Direttiva Attuazione n. 86/609 / CEE, em materia di Protezione degli animali utilizzati um fini Sperimentali o ad altri fini scientifici."
1. A obtenção de amostras de pele
- Euthanize o mouse por deslocamento cervical.
- Orelha:
- Cortar a parte sem pêlos das orelhas do rato.
- dorsal separada e lado ventral por separá-las com uma pinça. Remova qualquer cartilagens restantes raspando suavemente a parte interna das orelhas com uma pinça.
- pele do tronco:
- Raspar toda a pele do animal, tanto com um barbeador elétrico e com loção depilatória delicado.
- Cortar a amostra de pele desejado (de 2 cm2 até a pele do animal inteiro).
- Se cortando todo o dorsal e venpele do rato tral, fazer um corte vertical no meio do mouse para trás e, em seguida, corte ao longo das fronteiras das áreas raspadas ao redor do corpo do rato.
- Suavemente separar a pele a partir do peritoneu e os músculos das costas, mantendo a amostra de pele ainda com a pinça enquanto separa a amostra de pele, com as pontas afiadas redonda fechada de uma tesoura cirúrgica ou bisturi.
- Prepara-se uma placa de cultura de células de 100 milímetros contendo 10 ml de PBS gelado.
- Eliminar a gordura subcutânea por submersão da amostra de pele em PBS na placa preparado no passo 1.3.3 e raspagem da amostra de pele com fórceps.
- Rabo:
- Cortar a cauda do rato.
- Fazer um corte vertical na cauda, com uma tesoura cirúrgica ou bisturi cirúrgico, a partir da base da cauda e atingindo até a ponta da cauda.
- Use uma pinça para separar a pele da cauda. Agarrar a borda do corte na base da cauda e puxe na direcção da ponta, mantendo ocorpo da cauda com uma pinça.
- Remova qualquer excesso de gordura suavemente raspando a amostra de pele.
- salteador
- Cortar o pé inteiro do rato com uma tesoura cirúrgica. Evitando cortar qualquer pele aveludada.
- Cortar a pele do pé longitudinalmente desde o tornozelo até o início dos dígitos.
- Manter os ossos do tornozelo com uma pinça ou com a mão enquanto agarrando a pele com uma pinça e puxar a pele para os dígitos como se tirar uma luva.
2. Digestão
- Prepare o coquetel de digestão da solução-mãe (preparado como no Lista de Materiais) com a seguinte receita: mistura de enzimas (ver Lista de Materiais para as especificações) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Dilui-se em meio RPMI 5% de FBS.
- Pique amostras de pele com uma tesoura em pequenos pedaços num prato de Petri com 35 milímetros 2 ml de cocktail de digestão (para a pele do tronco: 2 ml de mistura de digestão a cada 2 cm2 de pele, até 3 mL no total).
- Incubar a 37 ° C durante 90 min. Agitar suavemente a placa de Petri 1-2 vezes durante a incubação.
- Pour amostras de pele digeridas sobre um filtro de 70 | iM de células em 66 milímetros placa de Petri contendo 1 ml de RPMI 1640, FBS a 5%.
- Lavar o filtro com 5 ml de meio RPMI 1640 FBS a 5%.
- Espremer a amostra através do filtro de células com um êmbolo da seringa.
- êmbolo flush, placa de Petri e filtro com 20 ml de RPMI1640 5% FBS, transferir para tubo de 50 ml.
3. Os anticorpos e rotulagem
- Lava-se a suspensão obtida duas vezes com 5 ml de PBS, 1% de FBS (ou BSA).
- Rotular a suspensão de células obtida com os anticorpos desejados.
- Ressuspender as amostras em 100 ul / amostra de uma mistura contendo 2 ug / mL de aCD16 / CD32 (clone 2.4G2) diluída em PBS 1% de FBS.
- Incubar durante 15 min a 4 ° C, a fim de bloquear a ligação não específica dos anticorpos desejados, via receptores de Fc.
- Adicionar os anticorpos indicados na Tabela1.
- Prepara-se uma mistura diluir os anticorpos desejados em 100 ul / amostra de PBS a 1% de FBS, para uma concentração de 4 ug / ml.
- Adicionar 100 ul da mistura preparada no passo 3.2.3.1 para cada amostra de modo a que no tubo, haverá um volume de 200 ul de mistura de anticorpo a uma concentração final de 2 ug / ml.
- Incubar durante 30 min a 4 ° C e cobrir de luz.
- Lava-se com 1 ml de PBS, 1% de FBS, centrifugar durante 5 minutos a 400 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 300 ul de PBS, 1% de FBS.
- Adicionar DAPI a uma concentração final de 2 ug / ml e incubar a 4 ° C, protegida da luz durante 10 min.
- Analisar as amostras obtidas por FACS.
- Para isolar leucócitos, use a seguinte estratégia gating:
- Primeiro eliminar as células mortas por gating sobre a população DAPI-.
- Seleccione interiores do FSC-A vs. FSC W, como indicado na Figura 1
- Portão as células com base no tamanho e granularidade típico dos leucócitos de interesse.
- Escolha CD45 + células no FSC-A trama CD45 conforme indicado na Figura 1.
- Distinguir as diferentes populações de leucócitos através da expressão de marcadores de superfície como se segue:
- Identificar DCs como CD11c + II + células MHC. Estes podem ser depois analisados para a expressão de CD207 para distinguir as células de Langerhans e CD207 + Dérmico DCs de CD207- Dérmico DCs.
- Identificar Macrófagos como CD64 + / 80 + F4 células.
- Identificar as células B como as células CD19 + + MHCII.
- Identificar células T CD8 como + ou células CD4 +.
- Para isolar leucócitos, use a seguinte estratégia gating:
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Representative Results
A pele a partir de diferentes regiões do corpo foi digerida de acordo com o protocolo descrito e corados com os anticorpos indicados. A estratégia de propagação está representado na Figura 1. Em primeiro lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), em seguida, no portão singuletos (FSC-A versus FSC-W) e em células com a morfologia de linfócitos (FSC vs SSC-A-A). Quando indicado, as células CD45 + de origem hematopoiética são selecionados.
DCs são marcadas com anti-CD11c, -MHCII, e -CD45 anticorpos, os macrófagos são identificados como F4 / 80 + CD64 + CD45 +, células CD19 + B como CD45 + MHCII + células, os linfócitos T CD4 + como CD4 + CD45 + as células, e os linfócitos T CD8 + como CD8 + CD45 + (Figura 2).
Este método guarantees alta viabilidade da população digerido com mais do que 50% de células viáveis totais (DAPI-) em todas as regiões da pele que são analisados (Figura 3A). Uma indicação do número de células CD45 + produzir por cm 2 está representada na Figura 3B.
Uma estimativa do número total de DCs, os macrófagos, as células B e células T CD4 + ou células T CD8 + obtidas a partir da digestão de 1 cm 2 de pele de rato é indicada na Figura 3C.
Figura 1. Identificação de células de origem hematopoiética, em suspensões de célula única de pele. Suspensões de uma única célula foram corados com DAPI e o anticorpo anti-CD45. Entre as células vivas (DAPI-negativos), singletos (FSC-A vs FSC-H) são analisadas para selecionar células com leucócitos morfologia (FSC-A vs. SSC-A). As células de origem hematopoiéticas são identificados como CD45 +.
Figura 2. A análise das células imunes presentes na pele de ratinho derivadas de diferentes regiões. As células são fechadas, tal como indicado na Figura 1. DCs são identificadas como células de MHC II + CD45 + CD11c + e depois coradas com CD207 para distinguir as células de Langerhans e CD207 + dérmica DCs de CD207 -; Os macrófagos são identificados como CD64 + F4 80 células / + CD45 +; Os linfócitos T são divididos em células CD8 + CD45 + e células T CD4 + CD45 + células; As células B são identificadas como células CD19 + MHCII + CD45 +. As percentagens são referidas ao total das células CD45 +.
Figura 3. Análise quantitativa das células imunes presentes na pele de ratinho a partir de diferentes regiões (A) Percentagem de viabilidade. (DAPI -) células derivadas de regiões indicadas de pele de ratinho. (B) os números absolutos de células CD45 + nas diferentes regiões da pele de ratinho expressa em número de células por cm2 de pele. (C) Número de Estimativa de DCs, MO, células B e células T CD4 + ou T CD8 + derivados de 1 cm2 de pele a partir das regiões indicadas de pele de ratinho.
| Anticorpo | coloração | Concentração | Tempo | Temperatura |
| DCsMisturar | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 ug / mL | 30 minutos | 4 ° C |
| II do MHC | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| macrófagos Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 ug / mL | 30 minutos | 4 ° C |
| II do MHC | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| As células T e B Misturar | PE | 2 ug / mL | 30 minutos | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabela 1. As indicações para a coloração das diferentes populações de células do sistema imunológico que povoam a pele. Três misturas são indicadas para a coloração de DCs, macrófagos e linfócitos.
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Discussion
Descrevemos um método para a preparação de suspensões unicelulares a partir de regiões diferentes da pele do rato. O método de digestão adoptámos, não só dá rendimentos elevados mas também preserva a expressão de marcadores de superfície, que é fundamental para a análise de FACS subsequente.
A utilização de uma mistura de colagenase I e II e termolisina, garante lote mínimo de diferenças de lote na actividade da enzima, tornando este método altamente reprodutível. Outros métodos publicados dependem de diferentes coquetéis enzimáticos, mas em nossas mãos que dão rendimentos mais baixos e, mais importante, são menos reprodutível. Nosso método, no entanto, não discrimina entre as células que povoam a epiderme e células que povoam a derme. Como em muitos casos poderia ser útil para distinguir entre esses dois compartimentos diferentes, nós direcionar o leitor para esses trabalhos anteriores que usam tais métodos 15.
Em nossa amostra experiência peles a partir da orelha e da cauda são mais fáceis de digerir do que a pele do tronco, onde a camada de gordura subcutânea tem de ser muito bem raspada de modo a tornar a derme acessível à mistura de enzimas. O passo de lubrificação de, embora, bem como o corte deve ser realizado rápida e cuidadosamente, a fim de manter a viabilidade celular. Um passo de desengorduramento prolongada ou demasiado profunda pode resultar em danos para o residente células do sistema imune na pele e, portanto, resultar em muito menor rendimento e uma redução da viabilidade das células recuperadas.
Também deve ser notado que para preservar a integridade dos marcadores de superfície, a digestão deverá ser realizada em um meio desprovido de agentes tais como β-mercaptoetanol redução. Para evitar danos indesejados para marcadores de superfície, o tempo de incubação deve ser mantido tão curto quanto possível e, em qualquer caso, não prolongada por mais de 90 min.
Um cuidado especial deve ser, também, tomado quando vazar as amostras de pele digeridas dentro da célulafiltro. É importante, para lavar cuidadosamente a pele digerido, a fim de lavar as células libertadas antes de quebrar a amostra digerida com o êmbolo da seringa. Com este passo, a amostra de pele é lavada a partir das células do sistema imunológico libertadas que então não se submetem a nenhum estresse mais físico. O esmagamento também deve ser realizado com cuidado para não matar todas as células e tanto o filtro de células e o êmbolo de seringa deve ser cuidadosamente lavado na etapa de lavagem subsequente.
digestão da pele pode também ser realizada num Falcon de 50 ml num banho de água a 37 ° C. Neste caso, a pele pode ser cortado previamente e, em seguida, introduzida num tubo Falcon. Note-se que as amostras de pele deve estar sempre submersa no tampão de digestão durante a incubação e o ouvido peças de colar às paredes de tubos de Falcon. Ao usar tubos Falcon, portanto, certifique-se os pedaços de picada estadia pele submersas no meio de digestão.
Este método pode ser útil em MAny diferentes configurações experimentais, particularmente quando se estuda a pele não inflamada. Durante a inflamação, a vasodilatação e inchaço dos tecidos afrouxar a estrutura do tecido e as células imunes do sangue são massivamente recrutados para a pele. A eficiência da recuperação de células é, assim, muito mais elevada. Em condições homeostáticos, um meio eficaz para digerir a matriz de colagénio da derme apertada é, de facto, necessário, a fim de recuperar a célula imune que constituem a rede complexa de preencher a pele.
O leitor também pode estar interessado em uma revisão abrangente que cobre a origem e fenótipo de diferentes células dendríticas e macrófagos que povoam a pele em ambas as condições homeostáticas e inflamatórias 16.
Em diferentes configurações experimentais, diferentes porções da pele de ratinho pode ser tratada. Por exemplo, em modelos de transplante de pele, uma porção da cauda pode ser transplantado no tronco de um animal que recebe; quando studying formação de edema ou procedimentos de imunização, os estímulos são frequentemente injectados na pata de ratos, enquanto o ouvido é frequentemente utilizado para avaliar a memória das células T com ensaios de DTH. Com o nosso método poderíamos eficiente extrair células do sistema imunológico residentes pele de diferentes locais que fazem o nosso método útil para a configuração experimental de escolha.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
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