Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

Resumo

A pele abriga uma complexa rede de células imunológicas. Descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos, de diferentes partes do corpo do animal, a fim de obter uma suspensão unicelular e analisar as diferentes populações de leucócitos residentes na pele por citometria de fluxo.

Resumo

A pele é um órgão de barreira que interage com o ambiente externo. Sendo continuamente expostas a potenciais invasões microbianas, a derme e a epiderme abrigam uma variedade de células imunes em condições homeostáticas e inflamatórias. Ferramentas para obter liberação de células da pele para análises citofluorimétricas são, portanto, muito úteis para estudar a complexa rede de células imunes que residem na pele e sua resposta a estímulos microbianos. Aqui, descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos para obter suspensões unicelulares de forma rápida e eficiente. Este protocolo permite a manutenção da viabilidade celular máxima sem comprometer a expressão do antígeno de superfície. Também descrevemos como coletar e digerir amostras de pele de diferentes locais anatômicos, como orelha, tronco, cauda e pata. As suspensões obtidas são então coradas e analisadas por citometria de fluxo para discriminar entre diferentes populações de leucócitos.

Introdução

A pele é um dos maiores órgãos do corpo e sua grande superfície está continuamente exposta ao ambiente externo. Portanto, a pele deve proteger o organismo de ameaças potenciais para manter a homeostase, tanto por meios físicos quanto por fornecer proteção ativa contra a entrada potencial de patógenos. De maneira semelhante à mucosa intestinal e pulmonar, a pele abriga uma variedade de células imunes que interagem continuamente com o epitélio para manter a vigilância imunológica. Esse sistema complexo que envolve células imunes e não imunes da pele é reconhecido desde os primórdios da imunologia, quando em 1978 o termo "tecido linfóide associado à pele" (SALT) ¹ foi cunhado pela primeira vez para descrever essa complexidade.

O grande número de células imunes que residem na pele ajuda o organismo não apenas a combater possíveis invasões, mas também a orquestrar a cicatrização de feridas e a manter a tolerância aos autoantígenos e à microbiota da pele ^2,3.

Entre as células imunes residentes na pele, as células dendríticas (DCs) têm um papel crucial na formação das respostas imunes e na manutenção da homeostase ⁴. DCs dérmicas e células de Langerhans respondem prontamente a invasões de patógenos e, após a migração para os linfonodos, ativam as células T e induzem a expressão de receptores de homing da pele nas células T efetoras recém-geradas ⁵. As DCs também têm um papel fundamental na regulação da homeostase da pele. As DCs que migram da derme para os linfonodos em condições homeostáticas transportam antígenos sequestrados pela pele com o objetivo de induzir a tolerância das células T, principalmente por meio da diferenciação de células T reguladoras (Tregs) específicas para antígenos cutâneos ^6-8.

T as células representam a população mais abundante de células imunes na pele. Eles não apenas se infiltram na pele durante uma infecção, mas também representam uma população estável entre os linfócitos residentes na pele ^9,10. As células T de memória residente CD8⁺ e CD4⁺ (rm)T residem na pele e, após uma infecção, podem responder muito antes de as células T efetoras serem recrutadas do sangue. Na pele, também reside uma população de Tregs residentes no tecido capazes de manter a tolerância aos antígenos cutâneos e à homeostase tecidual. Essas células são ativadas de forma rápida e potente após a exposição ao seu antígeno cognato e, portanto, foram definidas como Tregs de memória ^11,12.

Juntamente com DCs e células T, muitas células imunes inatas, como células NK, células T gama delta, ILCs ¹³ do grupo 2, mastócitos e macrófagos, povoam a pele e contribuem para a proteção do hospedeiro. Para analisar um ambiente tão complexo, é obrigatório obter suspensões unicelulares de espécimes de pele com alta eficiência, preservando ao mesmo tempo a expressão de marcadores de superfície para análise citofluorimétrica de fluxo ou classificação.

A pele murina apresenta uma camada epidérmica externa, constituída principalmente por queratinócitos, células de Langerhans e células T epidérmicas dendríticas; e a camada dérmica abaixo. A derme abriga a maioria das células imunes e é formada por uma matriz extracelular na qual as fibras colágenas são as mais abundantes, especialmente o colágeno-I e o colágeno-IV. Ao contrário da pele humana, a pele do camundongo é coberta de pelos e, portanto, mais povoada por folículos pilosos. É, também, muito mais fino que a pele humana e contém uma camada muscular, o panículo carnoso, que ajuda na cicatrização de feridas ¹⁴. Essas características tornam mais difícil interromper com eficiência a rede de colágeno da derme, a fim de retirar as células imunológicas.

Neste artigo, fornecemos um método adequado para digerir a matriz extracelular que depende de um coquetel de colagenase 1 e 2 de alta pureza e termolisina. Além disso, como a análise da pele de diferentes regiões requer diferentes procedimentos experimentais, mostraremos diferentes métodos para obter com eficiência amostras de pele do coxim das patas, cauda, orelha e tronco. Em seguida, rotularemos as amostras para avaliar a presença de DCs (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), macrófagos (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), células T CD8⁺ e CD4⁺.

Protocolo

Estudo aprovação: Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (Roma, Itália) de acordo com o Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "della Direttiva Attuazione n. 86/609 / CEE, em materia di Protezione degli animali utilizzati um fini Sperimentali o ad altri fini scientifici."

1. A obtenção de amostras de pele

1. Euthanize o mouse por deslocamento cervical.
2. Orelha:
   1. Cortar a parte sem pêlos das orelhas do rato.
   2. dorsal separada e lado ventral por separá-las com uma pinça. Remova qualquer cartilagens restantes raspando suavemente a parte interna das orelhas com uma pinça.
3. pele do tronco:
   1. Raspar toda a pele do animal, tanto com um barbeador elétrico e com loção depilatória delicado.
   2. Cortar a amostra de pele desejado (de 2 ^cm2 até a pele do animal inteiro).
      1. Se cortando todo o dorsal e venpele do rato tral, fazer um corte vertical no meio do mouse para trás e, em seguida, corte ao longo das fronteiras das áreas raspadas ao redor do corpo do rato.
      2. Suavemente separar a pele a partir do peritoneu e os músculos das costas, mantendo a amostra de pele ainda com a pinça enquanto separa a amostra de pele, com as pontas afiadas redonda fechada de uma tesoura cirúrgica ou bisturi.
   3. Prepara-se uma placa de cultura de células de 100 milímetros contendo 10 ml de PBS gelado.
   4. Eliminar a gordura subcutânea por submersão da amostra de pele em PBS na placa preparado no passo 1.3.3 e raspagem da amostra de pele com fórceps.
4. Rabo:
   1. Cortar a cauda do rato.
   2. Fazer um corte vertical na cauda, ​​com uma tesoura cirúrgica ou bisturi cirúrgico, a partir da base da cauda e atingindo até a ponta da cauda.
   3. Use uma pinça para separar a pele da cauda. Agarrar a borda do corte na base da cauda e puxe na direcção da ponta, mantendo ocorpo da cauda com uma pinça.
   4. Remova qualquer excesso de gordura suavemente raspando a amostra de pele.
5. salteador
   1. Cortar o pé inteiro do rato com uma tesoura cirúrgica. Evitando cortar qualquer pele aveludada.
   2. Cortar a pele do pé longitudinalmente desde o tornozelo até o início dos dígitos.
   3. Manter os ossos do tornozelo com uma pinça ou com a mão enquanto agarrando a pele com uma pinça e puxar a pele para os dígitos como se tirar uma luva.

2. Digestão

1. Prepare o coquetel de digestão da solução-mãe (preparado como no Lista de Materiais) com a seguinte receita: mistura de enzimas (ver Lista de Materiais para as especificações) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Dilui-se em meio RPMI 5% de FBS.
2. Pique amostras de pele com uma tesoura em pequenos pedaços num prato de Petri com 35 milímetros 2 ml de cocktail de digestão (para a pele do tronco: 2 ml de mistura de digestão a cada 2 ^cm2 de pele, até 3 mL no total).
3. Incubar a 37 ° C durante 90 min. Agitar suavemente a placa de Petri 1-2 vezes durante a incubação.
4. Pour amostras de pele digeridas sobre um filtro de 70 | iM de células em 66 milímetros placa de Petri contendo 1 ml de RPMI 1640, FBS a 5%.
5. Lavar o filtro com 5 ml de meio RPMI 1640 FBS a 5%.
6. Espremer a amostra através do filtro de células com um êmbolo da seringa.
7. êmbolo flush, placa de Petri e filtro com 20 ml de RPMI1640 5% FBS, transferir para tubo de 50 ml.

3. Os anticorpos e rotulagem

1. Lava-se a suspensão obtida duas vezes com 5 ml de PBS, 1% de FBS (ou BSA).
2. Rotular a suspensão de células obtida com os anticorpos desejados.
   1. Ressuspender as amostras em 100 ul / amostra de uma mistura contendo 2 ug / mL de aCD16 / CD32 (clone 2.4G2) diluída em PBS 1% de FBS.
   2. Incubar durante 15 min a 4 ° C, a fim de bloquear a ligação não específica dos anticorpos desejados, via receptores de Fc.
   3. Adicionar os anticorpos indicados na Tabela1.
      1. Prepara-se uma mistura diluir os anticorpos desejados em 100 ul / amostra de PBS a 1% de FBS, para uma concentração de 4 ug / ml.
      2. Adicionar 100 ul da mistura preparada no passo 3.2.3.1 para cada amostra de modo a que no tubo, haverá um volume de 200 ul de mistura de anticorpo a uma concentração final de 2 ug / ml.
   4. Incubar durante 30 min a 4 ° C e cobrir de luz.
3. Lava-se com 1 ml de PBS, 1% de FBS, centrifugar durante 5 minutos a 400 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 300 ul de PBS, 1% de FBS.
4. Adicionar DAPI a uma concentração final de 2 ug / ml e incubar a 4 ° C, protegida da luz durante 10 min.
5. Analisar as amostras obtidas por FACS.
   1. Para isolar leucócitos, use a seguinte estratégia gating:
      1. Primeiro eliminar as células mortas por gating sobre a população DAPI-.
      2. Seleccione interiores do FSC-A vs. FSC W, como indicado na Figura 1 .
      3. Portão as células com base no tamanho e granularidade típico dos leucócitos de interesse.
      4. Escolha CD45 + células no FSC-A trama CD45 conforme indicado na Figura 1.
   2. Distinguir as diferentes populações de leucócitos através da expressão de marcadores de superfície como se segue:
      1. Identificar DCs como CD11c ⁺ II ⁺ células MHC. Estes podem ser depois analisados ​​para a expressão de CD207 para distinguir as células de Langerhans e CD207 + Dérmico DCs de CD207- Dérmico DCs.
      2. Identificar Macrófagos como CD64 + / 80 + F4 células.
      3. Identificar as células B como as células CD19 + + MHCII.
      4. Identificar células T CD8 como + ou células CD4 +.

Resultados

A pele a partir de diferentes regiões do corpo foi digerida de acordo com o protocolo descrito e corados com os anticorpos indicados. A estratégia de propagação está representado na Figura 1. Em primeiro lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), em seguida, no portão singuletos (FSC-A versus FSC-W) e em células com a morfologia de linfócitos (FSC vs SSC-A-A). Quando indicado, as células CD45 ⁺ de origem hematopoiética são selecionados.

Discussão

Descrevemos um método para a preparação de suspensões unicelulares a partir de regiões diferentes da pele do rato. O método de digestão adoptámos, não só dá rendimentos elevados mas também preserva a expressão de marcadores de superfície, que é fundamental para a análise de FACS subsequente.

A utilização de uma mistura de colagenase I e II e termolisina, garante lote mínimo de diferenças de lote na actividade da enzima, tornando este método altamente reprodutível. Outros métodos publicados d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
Supplemented RPMI 1640 medium			RPMI1640 suplementado com L-glu, pen-strep sem beta mercapto etanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	ressuspender [2.5  mg/ml] em dH2O; Armazene alíquotas em -20  ° C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	ressuspende em RPMI 1640 sem soro [1,000  U/ml]
Materiais
Fórceps
Cirúrgica Bisturi Cirúrgico
35 mm Placas
Petri 66 mm Placas
70 µ m Cell Strainers	BD	352350
Coquetel de digestão			Diluído em RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 µ g/ml
DNAse1			50 U/ml
Anticorpos
Nome	Empresa	Clone	Rótulo
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC