Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz

Compreendendo a condução neural ou propagação de sinais neurais é crucial para a determinação do mecanismo da comunicação neuronal, tanto no funcionamento normal e em condições patológicas do cérebro ^1-3. O hipocampo é uma das estruturas mais estudadas no cérebro, uma vez que desempenha papel fundamental em diversas funções cerebrais como memória, e rastreamento espacial e está envolvido em várias alterações patológicas que afetam drasticamente o comportamento bem ^1,6. Embora, o hipocampo exibe uma organização complexa, os diferentes elementos da sua estrutura pode ser facilmente identificado e consultados na preparação fatia ^4-6. No sentido transversal do hipocampo, actividade neuronal é conhecida a propagar através da via de tri-sináptica que compreendem o giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Acredita-se que a transmissão sináptica e a condução axonal, desempenham um papel importante para comuniem neste circuito transversal ^4,6. No entanto, a propagação do sinal neural ocorre em ambas direções transversal e longitudinal ^4,6. Isto implica que o hipocampo não pode ser totalmente investigado usando preparações de fatias que limitam a observação de uma determinada direcção de propagação ^4. A fatia longitudinal foi desenvolvido para investigar os caminhos axonal ao longo do eixo longitudinal ^5. Pesquisadores observaram gama e teta oscilações específicas de comportamento predominantemente ao longo eixos transversal e longitudinal, respectivamente ^6. Esses comportamentos foram estudados separadamente, mas o acesso simultâneo a ambos os sentidos é crucial para entender esses comportamentos. Mesmo com o desenvolvimento da preparação hipocampo intactos, é difícil controlar a propagação ao longo de todo o tecido devido à estrutura dobrada do hipocampo ^4. O hipocampo desdobrado dá acesso aos neurônios embaladosem uma forma de uma camada de células de ^7,8 bidimensional plana.

Por desdobramento do giro dentado (DG) (Figura 1), o hipocampo adopta um formato achatado com uma configuração rectangular, em que ambos transversais e longitudinais permanecem intactos ligações com a camada de células piramidais dispostos numa chapa bidimensional contendo tanto CA3 e CA1, deixando uma peça plana de tecido neural que pode ser utilizado para investigar a propagação neural (Figura 2) ^8. Actividade neural pode ser monitorada com pipetas individuais de vidro, matrizes microeléctrodos, eléctrodos estimulantes, bem como corantes sensíveis à voltagem (VSD) ^3,7,8. Além disso, o indicador de tensão geneticamente codificado a partir de ratinhos transgénicos que pode ser usado para controlar o padrão de propagação ^9.

A configuração plana da rede do hipocampo desdobrada é bem adequado para a gravação óptica método mas também para uma matriz de microeléctrodos. Most das matrizes disponíveis no mercado são fabricados com eletrodos de perfil plano ou baixo e pode gravar a atividade neural em ambas as fatias de tecido e neurônios cultivados ^10-12. No entanto, a relação sinal-para-ruído (SNR) decresce quando os sinais são obtidos a partir de um tecido intacta uma vez que a soma dos neurónios estão localizadas mais profundamente no tecido. Matrizes de eletrodos de microeletrodos com proporções elevadas são necessárias para melhorar o SNR.

Para este efeito, uma matriz de microeléctrodos penetrante (PMEA), foi desenvolvido no nosso laboratório, e proporciona a capacidade para sondar directamente no tecido através da inserção de 64 pontos com um diâmetro de 20 mm e altura de 200 mm no hipocampo desdobradas ^7,13 . Esta matriz de microeléctrodos tem SNR superior em comparação com o corante de imagem sensível à voltagem e o SNR permanece estável durante uma experiência ^7,13. A combinação da preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA proporciona uma nova maneira de investirIGATE a propagação neural ao longo de um plano bidimensional. Experimentos usando esta técnica já produziu resultados significativos sobre os mecanismos de propagação do sinal neural no hipocampo em que a atividade neural pode propagar de forma independente das sinapses sinápticas ou elétricos ^7.

NOTA: Animal protocolos experimentais foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na universidade. Ratos CD1 de ambos os sexos com a idade de P10 a P20 são usadas neste estudo.

1. Soluções para Cirurgia Experimental e Gravação

1. Preparar tampão normal de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO 4 1,25, _MgSO4 2, _NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl ₂ 2. Utilizar esta ACSF normal para a recuperação do tecido após a dissecação, bem como para o sistema de lavagem no início da experiência.
2. Prepare ACSF sacarose que é usada durante a dissecção do hipocampo e contém (mM): Sacarose 220, KCl 2,95, NaH ₂ PO 4 1,3, MgSO ₄ 2, _NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl ₂ 2. A fim de induzir a actividade epileptiforme na preparação intacta tecido do hipocampo, e adicionar 4-aminopiridina (4-AP) para ACSF normal noa concentração de 100 uM.

2. Procedimento cirúrgico para a Intacta Hippocampus Preparação

1. Gota isoflurano (1 ml) para dentro da câmara na parte inferior de um frasco de vidro exsicador (No.1 em Materiais e Equipamento específicos) e usar uma toalha de papel comum para cobrir a superfície da fase de fundo, de modo que o animal não entrar em contacto com o líquido. Em seguida, coloque o CD1 do mouse dentro do frasco e feche a tampa. Manter o animal no frasco fechado durante cerca de 1 min e 2 min. Quando a freqüência de respiração é de cerca de um por segundo, retire o mouse do frasco.
2. Posicione o mouse sobre o estágio de cirurgia e decapitar com uma tesoura adequados. Imediatamente após a decapitação, coloque a cabeça para dentro do gelado (3-4 ° C), oxigenado aCSF sacarose por cerca de 30 segundos.
3. Utilize uma tesoura fina (No.5 em Materiais e Equipamento específicos) para remover a pele na parte superior do crânio e para cortar o crânio, ao longo da linha média da cabeça, bem como em duas extremidades perto do ritmolóbulo ral. Use uma pinça (# 6 em materiais específicos e equipamentos) para descascar o crânio corte no sentido de cada lado da cabeça, a fim de expor o cérebro.
4. Insira uma espátula laboratório micro (No. 8 em materiais específicos e equipamentos) no espaço entre os lobos parietais do cérebro e do crânio de descascar cuidadosamente o cérebro a partir do fundo do crânio e, em seguida, solte-o em uma gelada preparada (3 -4 ° C) estágio cirúrgico coberto com papel de filtro molhado (No.2 em materiais específicos e equipamentos). Remover o cerebelo com uma lâmina de gelo-refrigerados e separar os dois hemisférios por corte da linha média do cérebro. Em seguida, colocar os dois hemisférios separadas em um copo cheio com a sacarose ACSF gelado borbulhar com 95% _{de O2} / 5% de CO _2.
5. Pegue uma metade do hemisfério e lugar no cenário papel de filtro gelada. Coloque toalhas de papel regulares ou filtro de papel ao redor do cérebro para sugar a solução extra. Use duas ferramentas de pipetas de vidro polido-fogo (# 10 em Materiais eEquipamento) para separar o córtex do resto da parte central do cérebro.
6. Após o hipocampo é exposta a partir de dentro do córtex e colocou na fase gelada, colocar dois ou três gotas de sacarose gelada ACSF sobre o tecido e, em seguida, remover a solução extra em torno do hipocampo. Corte as ligações com o córtex em duas extremidades do hipocampo. Em seguida, dissecar o hipocampo para fora do cérebro com as ferramentas de vidro polido de fogo e remover a restante parte do cérebro.
7. Separe toda a hipocampo com o seu lado alveus voltada para cima e hipocampo sulco voltado para baixo. Cair rapidamente duas ou três gotas de sacarose gelada ACSF sobre o tecido novamente e remover a solução extra em torno do tecido usando um pedaço de toalha de papel. Usar uma ferramenta de vidro polido ao fogo entregar todo o hipocampo para expor o sulco (Figura 1B, C).
8. Sob um microscópio óptico normal, inserir uma agulha de vidro feita sob encomenda (No. 11 em Materi Specificals e Equipamento) em uma das extremidades do sulco e cortar as conexões de fibra, a partir de giro dentado (DG) para subículo ou o campo CA1, ao longo da direcção do sulco (Figura 1C). Aplicar uma lâmina gelada para aparar as extremidades do septo e temporais do hipocampo, se necessário. Insira um loop fio de metal personalizado feito (No. 12 em materiais específicos e equipamentos) no sulco de corte e encostar o DG longe do tecido, mantendo o final subiculum / CA1 do hipocampo por uma ferramenta de fogo de vidro polido (Figura 1D) .
9. Seguindo o procedimento acima desdobramento, adicionar mais duas ou três gotas de sacarose ACSF gelado para remover o tecido e a solução extra em torno do tecido. Em seguida, a guarnição do hipocampo desdobrado com a lâmina gelada nas bordas (Figura 1E) e colocar a preparação de uma espátula para a câmara de recuperação preenchido com ACSF normal e borbulhada com 95% _{de O2} / 5% de _CO2 à temperatura ambiente (cerca de 25 ° C). Deixaro tecido de hipocampo desdobrado para recuperar cerca de 1 hora antes da sua colocação na câmara de gravação.
10. Pegue o outro hemisfério cerebral e usá-lo a passar por etapas 2,5-2,9. Geralmente, levam cerca de 1 a 2 minutos para terminar todo o processo a se desenrolar um único hipocampo e soltar gelada sacarose aCSF continuamente para manter o tecido oxigenada e hidratada.

Setup 3. Sistema Experimental

1. Cole um PMEA fabricados sob encomenda em um pacote pin grid array (PGA) e usar ligação micro fios para conectar cada almofada a partir de um único microeléctrodos para a almofada de um pino sobre o pacote (Figura 3B). Em seguida, insira o pacote no soquete em uma placa de circuito feito sob medida ^13.
2. Individualmente conectar cada microeletrodos para seus filtros com passagem de banda de freqüência de corte de 1 Hz a 4 KHz e amplificadores com ganho de 100 na placa de circuito personalizado feito ^13. Digitalize a saída analógica da placa de circuito por um A D conv /sistema Erting, e adquirir e armazenar os dados em um computador.
3. Cole numa câmara de registo de plástico feito por medida em torno da matriz e com uma entrada de tubo de saída para o fluxo da solução (Figura 4A). Use pelo menos duas garrafas para manter as soluções diferentes no sistema, e se juntar e controlar a tubagem de saída das garrafas por um grupo tri-válvula. Ligue a saída do tri-válvula para um sistema de tubagem com uma câmara de gotejamento IV, que é guiar a solução para a câmara de gravação.
4. Entre os tri-válvula e a entrada da câmara de gravação, adicionar um aquecedor eléctrico para aquecer a solução a uma temperatura controlada (35 ° C) antes que a solução é orientada para a câmara de registo. Anexar a saída da câmara de registo para um tubo de vácuo para recolher a solução para um balão ligado tubo de vácuo. Não reciclar qualquer solução em qualquer experiência neste estudo.

4. Colocar o Unfolded Hippocampus para o PMEA para registrar a atividade Neural

5. Retirar oTecido da PMEA Após uma experiência

1. Controlar a âncora do tecido por um micromanipulador e gradualmente levantar o tecido a partir da câmara de gravação. Desligue ambos entrada e saída para interromper o fluxo na câmara de gravação. A câmara de gravação deve estar cheio com solução ou adicionar algumas gotas de solução para encher a câmara se a câmara de gravação não é completa.
2. Usar um pequeno pincel de pintura para levantar cada canto do tecido. Se o tecido não está a flutuar na solução, em seguida, utilizar o tubo de vácuo para secar a câmara de cuidado com o tecido ainda está sentado sobre a matriz. Em seguida, abra cuidadosamente a entrada para encher gradualmente a câmara e fechou a entrada para interromper o fluxo quando a câmara de gravação está cheia. Aplique o pincel pequeno para levantar cada canto do tecido novo.
3. Repetir o passo 5.2 até o tecido é separado da matriz e que flutua na solução. Se o tecido está flutuando na solução, em seguida, usar o tubo de vácuo para sugar o tecido de distância. Abrir tele fluir na entrada e abrir o vácuo na saída. Lavar o sistema com água destilada e seca-lo.

Os dados mostrados nas figuras aqui foram registados na preparação hipocampo desdobrado com 4-AP (100 uM) aCSF adicionado durante a incubação do tecido na câmara de gravação à TA (25 ° C). Normalmente atividade começa dentro de 5 min, mas em alguns tecidos do hipocampo dos animais mais velhos pode demorar mais tempo. O disparo neuronal induzida por AP-4 observado com o PMEA é o mesmo que anteriormente relatado 14,15. Uma vez que os eléctrodos têm uma altura de 200 mm, as pontas dos eléctrodos estão localizados logo abaixo da camada de células (Figura 3C) porque a camada de células é geralmente 250 a 300 mm acima do alveus do hipocampo (Figura 2), as gravações (57 de 64 no exemplo de experimento) de diferentes canais têm uma deflexão em sua maioria positivas. No entanto, algumas dessas gravações positivos poderia exibir pequenos desvios negativos, bem como (Figura 5B), se as pontas de eletrodos de gravação estão perto o suficiente para a camada de células.Se as dicas de eléctrodos estão localizados ao nível da camada de células, a gravação terá spiking negativo muito afiada com mudança positiva sobre ele ou apenas spiking negativo (Figura 5C) 16. Na amostra de dados mostrado aqui, 5 canais de 57 gravações têm spiking negativo. Após a aquisição dos dados de todos os 64 canais, o método de normalização individual (Figura 6B) é aplicada para mapear a propagação neural num plano 2-D ao longo do eixo do tempo da gravação 7. Com uma combinação de a PMEA e o hipocampo desdobrado, propagação neural é mapeado para iniciar e observado principalmente em um lado da CA3 e deslocar-se longitudinalmente em uma frente de onda em diagonal, atravessando toda a área do hipocampo (Figura 6).

Figura 1. O procedimento cirúrgico para um hipocampo desdobrado . (A) Um dos dois hipocampos é dissecado a partir do lobo temporal de cérebro de rato. (B) do septo e terminações temporais ao longo do eixo longitudinal. (C) O hipocampo é virada ao contrário, com uma pipeta de vidro polido ao fogo expor o sulco. Ambas as extremidades do hipocampo são aparados e uma agulha de vidro é usada para cortar as conexões entre a DG e CA1 ou subiculum ao longo do eixo longitudinal. (D) O hipocampo é desdobrada por uma alça de fio de metal feito por encomenda. (E) hipocampo Unfolded com subiculum e DG aparada. (F) A preparação final do tecido de um hipocampo desdobrado. Esta posição mostra a orientação do hipocampo quando ela é colocada sobre a matriz em uma experiência. Para detalhes adicionais sobre a anatomia hipocampo desdobrado consulte métodos experimentais em manuscritos publicados anteriormente 7."target =" _ g1large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Corte histológico do hipocampo desdobrado. Mancha de cristal-violeta mostra a posição da camada de células piramidais de CA1-CA3 do hipocampo desdobradas dentro de um nível de 250 a 300 mm acima do alveus localizando assim os microeléctrodos logo abaixo da camada de células (consulte a Figura 3C). Para obter as secções coradas com violeta de cristal a, o tecido foi pós-fixada após o hipocampo foi desdobrado. O hipocampo foi colocado desdobrado em PFA a 4% O / N. Em seguida, o tecido foi transferido e mantidas em solução de sacarose (30%) durante 48 horas, e seguido por snap-congelação de motociclista contendo isopentano (2-metilbutano) para arrefecer a -35 ° C em gelo seco. Congelação foram então cortados em criostato com20 mm de espessura no plano transversal (como mostrado na Figura 2) para revelar a localização da camada de células piramidais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. unfolded no hipocampo a PMEA. (A) Vista de cima de um novo PMEA com os microeletrodos localizados no final de cada traço de metal ouro. A inserção no lado direito mostra uma única microeléctrodo sob microscopia de electrões com uma altura de 200 mm e um diâmetro de 20 mm 7,13. (B) A matriz de microeléctrodos está colado sobre um pacote de PGA, com uma câmara de registo de plástico em torno dos microeléctrodos sobre um substrato de vidro. A inserção da direita mostra um hipocampo desdobrado colocado no arr microeletrodosay no meio. (C) À esquerda, Tomografia de Coerência Óptica (OCT) imagem mostra o tecido desdobrado posicionado no topo da matriz em uma experiência diferente. À direita, duas imagens de corte longitudinais obtidos a partir da imagem de outubro à esquerda mostra as dicas de microeletrodos (pontos brancos apontado pelas setas) chegar para a área logo abaixo da camada de corpo celular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Figura 4. configuração Experimental. (A) A tampa de cobertura de plástico com parafusos é colocada sobre os circuitos para protegê-lo contra possíveis danos causados ​​pela água. A câmara de gravação tem tanto de entrada e saída de tubos para transportar o fluxo de solução. Uma âncora de tecido feito à medida coladas com uma malha de fibra de nylon é usado para proteger o TISSue durante os experimentos. (B) Imagem tirada da parte inferior do substrato de vidro da PMEA que mostra a âncora segurando uma fatia de tecido da amostra durante uma experiência. Os arames curvos são as fibras de nylon da malha pressionando na parte superior do tecido. Os pontos redondos são as bases de microeletrodos. As setas indicam a eletrodos que foram danificados após várias experiências. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Os dados brutos registrados pela PMEA de um hipocampo se desenrolava. Painel esquerdo: 4-AP-induzida actividade epileptiforme gravado a partir de um único painel de microeléctrodos direita:.-Zunidas na versão do sinal marcado na janela de tempo do lado esquerdo. 10 seg secção de um exemplo da actividade espontânea em (A)produzida por 100 | iM de AP-4 ACSF obtido para um dos microeléctrodos localizados na região basal dendrítica com base na polaridade dos sinais com um SNR de 34,9 dB. (B) Os dados em bruto a partir de um outro microeléctrodo localizada mais próxima do somata com um SNR de 27,2 dB. (C) Exemplo de gravação obtido a partir de um eléctrodo posicionado no interior da camada somática. Neste exemplo, o SNR é 18,53 dB (D) de gravação. Obtidas a partir de um eléctrodo de realização ainda curvado mas não penetra no tecido. O eléctrodo dobrado tem uma significativa SNR mais baixo em comparação com os eléctrodos de 1,5 dB intactos (neste exemplo). (E) o ruído de linha de base gravada a partir de um microeléctrodo. A linha de base geralmente tem um valor pico a pico 150-200 mV e a impedância de um único eletrodo é de cerca de 1 a 2 mohms. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. A conversão de dados de gravação neurais no mapas propagação 2-D. (A) A janela de tempo ms 170 trunca um único spiking neural em cada canal plotados na fotografia do PMEA. Os dados brutos é filtrado por um filtro passa-baixa a 100 Hz. Os sinais provenientes dos eléctrodos quebradas são interpolados com as gravações em torno dele. Neste exemplo, todos os pontos são positivos. (B) Um único ponto neural a partir do pixel vermelho (A) é normalizado para a barra de cores com um método desenvolvido sob medida para a normalização individual (Por favor, consulte a publicação anterior para obter mais detalhes sobre a normalização 7). (C) Os mapas de cor criados pela normalização indivíduo mostram que se move de propagação ao longo de toda a área do hipocampo desdobrada em diferentes pontos de tempo."target =" _ www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.