Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz

Resumo

Nós desenvolvemos uma hipocampo in vitro desdobrada que preserva CA1-CA3 matriz de neurónios. Combinada com a rede de micro-eléctrodo penetrante, actividade neuronal pode ser monitorizada em ambas as orientações longitudinais e transversais. Este método oferece vantagens em relação a preparações de fatias do hipocampo como a propagação em todo o hipocampo podem ser gravados simultaneamente.

Resumo

Este protocolo descreve um método para a preparação de uma nova preparação de hipocampo in vitro fixa combinada com uma rede de micro-maquinado para mapear a actividade neuronal no hipocampo. A preparação transversal fatia do hipocampo é a preparação do tecido mais comum para estudar hipocampo eletrofisiologia. Uma fatia de hipocampo longitudinal também foi desenvolvido a fim de investigar as ligações longitudinais no hipocampo. Os hipocampo do rato também intactos podem ser mantidas in vitro, porque a sua espessura permite a difusão de oxigénio adequado. No entanto, estas três preparações não fornecem acesso direto a propagação neural já que alguns dos tecidos está ausente ou dobrado. O hipocampo intacto desdobrado fornece tanto transversais e longitudinais conexões em uma configuração plana para acesso direto ao tecido para analisar toda a extensão da propagação do sinal no hipocampo in vitro. A fim de controlar eficazmente a atividade neural de tele camada de células, um feito penetrar rede de micro-eléctrodo (PMEA) foi fabricado e aplicado ao hipocampo desdobrado. O PMEA com 64 eletrodos de 200 mm de altura poderia gravar a atividade neural profundo dentro do hipocampo do rato. A combinação única de uma preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA fornece uma nova ferramenta in vitro para estudar a velocidade e direcção de propagação da actividade neural nas regiões bidimensionais CA1-CA3 do hipocampo, com uma alta relação sinal-ruído.

Introdução

Compreendendo a condução neural ou propagação de sinais neurais é crucial para a determinação do mecanismo da comunicação neuronal, tanto no funcionamento normal e em condições patológicas do cérebro ^1-3. O hipocampo é uma das estruturas mais estudadas no cérebro, uma vez que desempenha papel fundamental em diversas funções cerebrais como memória, e rastreamento espacial e está envolvido em várias alterações patológicas que afetam drasticamente o comportamento bem ^1,6. Embora, o hipocampo exibe uma organização complexa, os diferentes elementos da sua estrutura pode ser facilmente identificado e consultados na preparação fatia ^4-6. No sentido transversal do hipocampo, actividade neuronal é conhecida a propagar através da via de tri-sináptica que compreendem o giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Acredita-se que a transmissão sináptica e a condução axonal, desempenham um papel importante para comuniem neste circuito transversal ^4,6. No entanto, a propagação do sinal neural ocorre em ambas direções transversal e longitudinal ^4,6. Isto implica que o hipocampo não pode ser totalmente investigado usando preparações de fatias que limitam a observação de uma determinada direcção de propagação ^4. A fatia longitudinal foi desenvolvido para investigar os caminhos axonal ao longo do eixo longitudinal ^5. Pesquisadores observaram gama e teta oscilações específicas de comportamento predominantemente ao longo eixos transversal e longitudinal, respectivamente ^6. Esses comportamentos foram estudados separadamente, mas o acesso simultâneo a ambos os sentidos é crucial para entender esses comportamentos. Mesmo com o desenvolvimento da preparação hipocampo intactos, é difícil controlar a propagação ao longo de todo o tecido devido à estrutura dobrada do hipocampo ^4. O hipocampo desdobrado dá acesso aos neurônios embaladosem uma forma de uma camada de células de ^7,8 bidimensional plana.

Por desdobramento do giro dentado (DG) (Figura 1), o hipocampo adopta um formato achatado com uma configuração rectangular, em que ambos transversais e longitudinais permanecem intactos ligações com a camada de células piramidais dispostos numa chapa bidimensional contendo tanto CA3 e CA1, deixando uma peça plana de tecido neural que pode ser utilizado para investigar a propagação neural (Figura 2) ^8. Actividade neural pode ser monitorada com pipetas individuais de vidro, matrizes microeléctrodos, eléctrodos estimulantes, bem como corantes sensíveis à voltagem (VSD) ^3,7,8. Além disso, o indicador de tensão geneticamente codificado a partir de ratinhos transgénicos que pode ser usado para controlar o padrão de propagação ^9.

A configuração plana da rede do hipocampo desdobrada é bem adequado para a gravação óptica método mas também para uma matriz de microeléctrodos. Most das matrizes disponíveis no mercado são fabricados com eletrodos de perfil plano ou baixo e pode gravar a atividade neural em ambas as fatias de tecido e neurônios cultivados ^10-12. No entanto, a relação sinal-para-ruído (SNR) decresce quando os sinais são obtidos a partir de um tecido intacta uma vez que a soma dos neurónios estão localizadas mais profundamente no tecido. Matrizes de eletrodos de microeletrodos com proporções elevadas são necessárias para melhorar o SNR.

Para este efeito, uma matriz de microeléctrodos penetrante (PMEA), foi desenvolvido no nosso laboratório, e proporciona a capacidade para sondar directamente no tecido através da inserção de 64 pontos com um diâmetro de 20 mm e altura de 200 mm no hipocampo desdobradas ^7,13 . Esta matriz de microeléctrodos tem SNR superior em comparação com o corante de imagem sensível à voltagem e o SNR permanece estável durante uma experiência ^7,13. A combinação da preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA proporciona uma nova maneira de investirIGATE a propagação neural ao longo de um plano bidimensional. Experimentos usando esta técnica já produziu resultados significativos sobre os mecanismos de propagação do sinal neural no hipocampo em que a atividade neural pode propagar de forma independente das sinapses sinápticas ou elétricos ^7.

Protocolo

NOTA: Animal protocolos experimentais foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na universidade. Ratos CD1 de ambos os sexos com a idade de P10 a P20 são usadas neste estudo.

1. Soluções para Cirurgia Experimental e Gravação

1. Preparar tampão normal de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO 4 1,25, _MgSO4 2, _NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl ₂ 2. Utilizar esta ACSF normal para a recuperação do tecido após a dissecação, bem como para o sistema de lavagem no início da experiência.
2. Prepare ACSF sacarose que é usada durante a dissecção do hipocampo e contém (mM): Sacarose 220, KCl 2,95, NaH ₂ PO 4 1,3, MgSO ₄ 2, _NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl ₂ 2. A fim de induzir a actividade epileptiforme na preparação intacta tecido do hipocampo, e adicionar 4-aminopiridina (4-AP) para ACSF normal noa concentração de 100 uM.

2. Procedimento cirúrgico para a Intacta Hippocampus Preparação

1. Gota isoflurano (1 ml) para dentro da câmara na parte inferior de um frasco de vidro exsicador (No.1 em Materiais e Equipamento específicos) e usar uma toalha de papel comum para cobrir a superfície da fase de fundo, de modo que o animal não entrar em contacto com o líquido. Em seguida, coloque o CD1 do mouse dentro do frasco e feche a tampa. Manter o animal no frasco fechado durante cerca de 1 min e 2 min. Quando a freqüência de respiração é de cerca de um por segundo, retire o mouse do frasco.
2. Posicione o mouse sobre o estágio de cirurgia e decapitar com uma tesoura adequados. Imediatamente após a decapitação, coloque a cabeça para dentro do gelado (3-4 ° C), oxigenado aCSF sacarose por cerca de 30 segundos.
3. Utilize uma tesoura fina (No.5 em Materiais e Equipamento específicos) para remover a pele na parte superior do crânio e para cortar o crânio, ao longo da linha média da cabeça, bem como em duas extremidades perto do ritmolóbulo ral. Use uma pinça (# 6 em materiais específicos e equipamentos) para descascar o crânio corte no sentido de cada lado da cabeça, a fim de expor o cérebro.
4. Insira uma espátula laboratório micro (No. 8 em materiais específicos e equipamentos) no espaço entre os lobos parietais do cérebro e do crânio de descascar cuidadosamente o cérebro a partir do fundo do crânio e, em seguida, solte-o em uma gelada preparada (3 -4 ° C) estágio cirúrgico coberto com papel de filtro molhado (No.2 em materiais específicos e equipamentos). Remover o cerebelo com uma lâmina de gelo-refrigerados e separar os dois hemisférios por corte da linha média do cérebro. Em seguida, colocar os dois hemisférios separadas em um copo cheio com a sacarose ACSF gelado borbulhar com 95% _{de O2} / 5% de CO _2.
5. Pegue uma metade do hemisfério e lugar no cenário papel de filtro gelada. Coloque toalhas de papel regulares ou filtro de papel ao redor do cérebro para sugar a solução extra. Use duas ferramentas de pipetas de vidro polido-fogo (# 10 em Materiais eEquipamento) para separar o córtex do resto da parte central do cérebro.
6. Após o hipocampo é exposta a partir de dentro do córtex e colocou na fase gelada, colocar dois ou três gotas de sacarose gelada ACSF sobre o tecido e, em seguida, remover a solução extra em torno do hipocampo. Corte as ligações com o córtex em duas extremidades do hipocampo. Em seguida, dissecar o hipocampo para fora do cérebro com as ferramentas de vidro polido de fogo e remover a restante parte do cérebro.
7. Separe toda a hipocampo com o seu lado alveus voltada para cima e hipocampo sulco voltado para baixo. Cair rapidamente duas ou três gotas de sacarose gelada ACSF sobre o tecido novamente e remover a solução extra em torno do tecido usando um pedaço de toalha de papel. Usar uma ferramenta de vidro polido ao fogo entregar todo o hipocampo para expor o sulco (Figura 1B, C).
8. Sob um microscópio óptico normal, inserir uma agulha de vidro feita sob encomenda (No. 11 em Materi Specificals e Equipamento) em uma das extremidades do sulco e cortar as conexões de fibra, a partir de giro dentado (DG) para subículo ou o campo CA1, ao longo da direcção do sulco (Figura 1C). Aplicar uma lâmina gelada para aparar as extremidades do septo e temporais do hipocampo, se necessário. Insira um loop fio de metal personalizado feito (No. 12 em materiais específicos e equipamentos) no sulco de corte e encostar o DG longe do tecido, mantendo o final subiculum / CA1 do hipocampo por uma ferramenta de fogo de vidro polido (Figura 1D) .
9. Seguindo o procedimento acima desdobramento, adicionar mais duas ou três gotas de sacarose ACSF gelado para remover o tecido e a solução extra em torno do tecido. Em seguida, a guarnição do hipocampo desdobrado com a lâmina gelada nas bordas (Figura 1E) e colocar a preparação de uma espátula para a câmara de recuperação preenchido com ACSF normal e borbulhada com 95% _{de O2} / 5% de _CO2 à temperatura ambiente (cerca de 25 ° C). Deixaro tecido de hipocampo desdobrado para recuperar cerca de 1 hora antes da sua colocação na câmara de gravação.
10. Pegue o outro hemisfério cerebral e usá-lo a passar por etapas 2,5-2,9. Geralmente, levam cerca de 1 a 2 minutos para terminar todo o processo a se desenrolar um único hipocampo e soltar gelada sacarose aCSF continuamente para manter o tecido oxigenada e hidratada.

Setup 3. Sistema Experimental

1. Cole um PMEA fabricados sob encomenda em um pacote pin grid array (PGA) e usar ligação micro fios para conectar cada almofada a partir de um único microeléctrodos para a almofada de um pino sobre o pacote (Figura 3B). Em seguida, insira o pacote no soquete em uma placa de circuito feito sob medida ^13.
2. Individualmente conectar cada microeletrodos para seus filtros com passagem de banda de freqüência de corte de 1 Hz a 4 KHz e amplificadores com ganho de 100 na placa de circuito personalizado feito ^13. Digitalize a saída analógica da placa de circuito por um A D conv /sistema Erting, e adquirir e armazenar os dados em um computador.
3. Cole numa câmara de registo de plástico feito por medida em torno da matriz e com uma entrada de tubo de saída para o fluxo da solução (Figura 4A). Use pelo menos duas garrafas para manter as soluções diferentes no sistema, e se juntar e controlar a tubagem de saída das garrafas por um grupo tri-válvula. Ligue a saída do tri-válvula para um sistema de tubagem com uma câmara de gotejamento IV, que é guiar a solução para a câmara de gravação.
4. Entre os tri-válvula e a entrada da câmara de gravação, adicionar um aquecedor eléctrico para aquecer a solução a uma temperatura controlada (35 ° C) antes que a solução é orientada para a câmara de registo. Anexar a saída da câmara de registo para um tubo de vácuo para recolher a solução para um balão ligado tubo de vácuo. Não reciclar qualquer solução em qualquer experiência neste estudo.

4. Colocar o Unfolded Hippocampus para o PMEA para registrar a atividade Neural

1. Para preparar a configuração experimental, encha uma garrafa com aCSF normal e outra garrafa com 4-AP aCSF. Em ambos os frascos, bolha de 95% _{de O2} / 5% de CO ₂ a partir do início de cada experiência. Usar um conector tri-válvula para controlar qual a solução será seleccionado durante uma experiência. Conectar um tubo de vácuo na saída da câmara para bombear a solução para um recipiente de pó. Aquece-se a tubagem antes de serem enviados para a câmara de registo e manter a solução a um nível de temperatura controlada (35 ° C).
2. Quando a entrada e a saída de câmara de registo está fechado, utilizar um conta-gotas de pipeta de vidro feito à medida para transferir e colocar o hipocampo desdobrado para dentro da câmara de gravação. Sob o microscópio, posicionar o hipocampo desdobrado utilizando um pequeno pincel de pintura regular, enquanto o tecido está a flutuar na solução. Coloque o hipocampo desdobrado com o seu lado alveus voltada para baixo, a área CA3 apontando para fora, e no campo CA1 apontando para o pesquisador.
3. Chupar cuidadosamente afastado da solução na câmara de vácuo com uma pipeta a partir da borda da câmara de registo para reduzir o nível da solução até que a câmara é seca e o tecido é reduzido, para o agrupamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma âncora de tecido feito à medida (Figura 4) (No. 14 em materiais específicos e equipamentos) em cima do tecido para segurar o hipocampo desdobrado para a matriz. Coloque algumas gotas de solução para a câmara de registo para encher-lo, e abrir gradualmente a entrada e a saída para ajustar a taxa de fluxo de cerca de duas gotas por segundo na câmara de gotejamento IV.
4. Incubar o tecido na câmara de registo com ACSF normal durante cerca de 1 min para recuperar, depois mudar para o abastecimento da solução de 4-AP ACSF dissolvido e ajustar a taxa de fluxo adequada. Incubar o tecido em 4-AP dissolvido ACSF para cerca de 5 a 10 minutos e, em seguida, o investigador poderia iniciar o software para gravar o sinal de actividade espontânea quando aparece.

5. Retirar oTecido da PMEA Após uma experiência

1. Controlar a âncora do tecido por um micromanipulador e gradualmente levantar o tecido a partir da câmara de gravação. Desligue ambos entrada e saída para interromper o fluxo na câmara de gravação. A câmara de gravação deve estar cheio com solução ou adicionar algumas gotas de solução para encher a câmara se a câmara de gravação não é completa.
2. Usar um pequeno pincel de pintura para levantar cada canto do tecido. Se o tecido não está a flutuar na solução, em seguida, utilizar o tubo de vácuo para secar a câmara de cuidado com o tecido ainda está sentado sobre a matriz. Em seguida, abra cuidadosamente a entrada para encher gradualmente a câmara e fechou a entrada para interromper o fluxo quando a câmara de gravação está cheia. Aplique o pincel pequeno para levantar cada canto do tecido novo.
3. Repetir o passo 5.2 até o tecido é separado da matriz e que flutua na solução. Se o tecido está flutuando na solução, em seguida, usar o tubo de vácuo para sugar o tecido de distância. Abrir tele fluir na entrada e abrir o vácuo na saída. Lavar o sistema com água destilada e seca-lo.

Resultados

Os dados mostrados nas figuras aqui foram registados na preparação hipocampo desdobrado com 4-AP (100 uM) aCSF adicionado durante a incubação do tecido na câmara de gravação à TA (25 ° C). Normalmente atividade começa dentro de 5 min, mas em alguns tecidos do hipocampo dos animais mais velhos pode demorar mais tempo. O disparo neuronal induzida por AP-4 observado com o PMEA é o mesmo que anteriormente relatado ^14,15. Uma vez que os eléctrodos têm uma altura de 200 mm, as pontas dos eléctrodos estão localizado...

Discussão

O desenvolvimento do hipocampo preparação desdobrada, em que os eixos longitudinais e transversais do hipocampo são preservadas em combinação com uma matriz de microeléctrodos penetrante, fornece uma ferramenta poderosa para investigar as ligações anatomia ou propagação neural no hipocampo ^7. Este procedimento de desdobramento é também aplicável para estudar hipocampo em ratos adultos. Estudos recentes com esta preparação mostrou que a actividade epileptiforme induzido-4-AP poderia propagar com uma frente de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
frasco dessecador	LABRECYCLERS Inc.	5410	Coloque toalhas de papel comuns no fundo do frasco para uso em anestesia animal.
Uma lâmina e um estágio cirúrgico feito pela Custome para desdobrar o hipocampo	N/	A N/A	Uma placa de Petri é colocada de cabeça para baixo (no centro) no gelo com um papel de filtro úmido colocado em cima dela.
Câmara de recuperação de tecidos feita sob medida	N/A	N/A	Os tubos de plástico foram colados com malha plástica na parte inferior e borbulharam com 95% de O2/5% de CO2 no aCSF.
Operação Reta  Tesoura	Fisher Scientific	S17336B                                                                                      Medco Instruments No.:81995	Esta tesoura é usada para    decapitar os ratos.
Integra Miltex Goldman-Fox  Tesoura	Fisher Scientific	12-460-517                                              MILTEX INC                                                    No.:5-SC-320	Esta tesoura é usada para cortar o crânio dos ratos.
Fórceps de Histerectomia Miltex	Claflin Equipamento médico	CESS-722033-00001	Este fórceps é usado para descascar o crânio cortado para expor o cérebro
Micro Espátula	Cardinal Health		Esta micro espátula é usada para transferir todo o cérebro de uma semiesfera para a câmara de reperfuração.
Espátula Semi-Micro de Aço Inoxidável Frey Scientific	Cardinal Health		Esta espátula semi micro é usada para transferir o hipocampo desdobrado para a glicose aCSF na câmara de recuperação.
pincel pequeno	Lowe's	tem #:  105657                                  Modelo #:  90219	Aquele com o menor tamanho em um pacote de pincel normal
Ferramenta de ajuda de vidro polido a fogo	N / A	N / A	Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares.
Agulha de vidro feita sob medida	N/A	N/A	Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares.
Ferramenta de vidro feita sob medida com um laço de fio de metal	N/A	N/A	Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com um laço de fio de metal remodelado.
Conta-gotas de solução de vidro feito sob medida	N/A	N/A	Esta ferramenta foi feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com suas pontas cortadas e uma cabeça de borracha anexada com a extremidade cortada.
Âncora de tecido personalizada	N / A	N / A	A Malha de fibra de nylon foi colada em um anel de fio de cobre isolado. A âncora de tecido foi segurada por um micromanipulador.
Matriz de microeletrodos fabricada sob medida	N/A	N/A	Mais detalhes sobre a matriz, consulte  Kibler, et al, 2011.
Circuitos de filtro e amplificadores feitos sob medida para a matriz	N/A	N/A	Mais detalhes sobre a matriz, consulte  Kibler, et al, 2011.
Processador de aquisição de dados 3400a	Microstar Laboratories	N/A	Este é um sistema completo de aquisição de dados com conversor A/D.