Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Resumo

Os biofilmes têm interações complexas com o ambiente circundante. Para investigar de forma abrangente as interações biofilme-ambiente, apresentamos aqui uma série de métodos para criar um ambiente químico heterogêneo para o desenvolvimento do biofilme, quantificar a velocidade do fluxo local e analisar o transporte de massa dentro e ao redor das colônias de biofilme.

Resumo

Os biofilmes são comunidades microbianas em anexo de superfície que têm estruturas complexas e produzem heterogeneidades espaciais significativos. O desenvolvimento do biofilme é fortemente regulada pelo fluxo envolvente e ambiente nutricional. O crescimento do biofilme também aumenta a heterogeneidade do microambiente local, gerando campos de fluxo e os padrões complexos de transporte de solutos. Para investigar o desenvolvimento da heterogeneidade em biofilmes e interações entre biofilmes e sua micro-habitat local, nós crescemos biofilmes mono-espécies de Pseudomonas aeruginosa e biofilmes dual-espécies de P. aeruginosa e Escherichia Coli sob gradientes nutricionais em uma célula de fluxo de microfluidos. Nós proporcionam protocolos detalhados para a criação de gradientes de nutrientes dentro da célula de fluxo e para o crescimento e desenvolvimento de biofilme visualização sob estas condições. Nós também protocolos atuais para uma série de métodos ópticos para quantificar padrões espaciais na estrutura do biofilme, o fluxo distribuições sobre biofilmes, e transporte de massa ao redor e dentro de colônias de biofilme. Estes métodos apoiar investigações abrangentes do co-desenvolvimento de biofilme e habitat heterogeneidade.

Introdução

Microorganismos se prendem às superfícies e biofilmes de formulário - agregados de células fechadas em uma matriz extracelular-polímero ^1. Os biofilmes se comportam de forma muito diferente a partir de células microbianas individuais, pois biofilmes tem heterogeneidade espacial dramática resultante de uma combinação de limitações de transporte de soluto internos e variações espaciais no metabolismo celular ^2,3. As concentrações de oxigênio e de nutrientes diminuem drasticamente na interface entre biofilme e em torno de fluido e se ainda mais empobrecido dentro no biofilme ^2. As variações espaciais na respiração do biofilme e a síntese de proteínas também podem ocorrer como uma resposta ao oxigénio localizada a disponibilidade de nutrientes e ^2.

Em ambientes aquáticos e do solo, a maioria das bactérias habitam em biofilmes. Biofilmes naturais realizar processos biogeoquímicos importantes, incluindo o ciclo do carbono e nitrogênio e reduzindo metais ^4,5. Clinicamente, a formação de biofilme é responsvel para pulmonar prolongada e infecções urinárias ^6. Infecções associadas ao biofilme são altamente problemático porque as células em biofilmes tem altíssima resistência aos antimicrobianos em comparação com os seus homólogos planctônicas ^6. Porque biofilmes são importantes em diversos contextos, uma quantidade substancial de investigação tem-se centrado na compreensão dos fatores ambientais que controlam as atividades de biofilme e da heterogeneidade espacial em biofilmes e do microambiente circundante.

Estudos anteriores mostraram que o desenvolvimento do biofilme é fortemente regulado por uma série de factores ambientais: biofilmes desenvolver diferentes morfologias sob várias condições de fluxo; oxigênio e nutrientes disponibilidade influência morfologia biofilme; e tensões hidrodinâmicas afeta a fixação de células planctônicas a superfícies e o desprendimento de células de biofilmes ^7-9. Além disso, a condição de escoamento externo influencia a entrega de substratos into e dentro de biofilmes ^10. O crescimento de biofilmes também altera circundante condições físicas e químicas. Por exemplo, o crescimento de biofilme conduz à depleção local do oxigénio e nutrientes ^2; biofilmes acumular compostos inorgânicos e orgânicos provenientes do ambiente circundante ^11; e agrupamentos de biofilme desviar incremento da superfície de fricção do fluxo e ^12,13. Porque biofilmes interagir com o seu ambiente circundante em formas muito complexas, é crítico para a obtenção simultânea das informações sobre as propriedades de biofilme e condições ambientais, e multidisciplinares precisam de ser usados ​​para caracterizar exaustivamente interacções-biofilme ambiente.

Aqui apresentamos uma série de métodos integrados para caracterizar padrões espaciais em crescimento microbiano dentro mono-espécies e biofilmes dual-espécies sob um gradiente nutricional imposta, bem como observar a modificação resultante do produto químico local e microambiente fluido. Nós firr descrevem a utilização de uma célula de dupla via de entrada de fluxo de microfluidos recentemente desenvolvido para observar o crescimento do biofilme sob gradientes químicos bem definidos. Em seguida, demonstrar a utilização dessa célula de fluxo de microfluidos para observar o crescimento de duas espécies de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e, em biofilmes sob uma gama de condições nutricionais. Mostramos como na visualização situ de propagação marcador fluorescente em colônias biofilme pode ser usado para avaliar quantitativamente os padrões de transporte de soluto em biofilmes. Finalmente, mostra-se como microescala velocimetria de rastreamento de partículas, realizada sob microscopia confocal, pode ser usado para obter o fluxo de campo local em torno dos biofilmes em crescimento.

Protocolo

1. Fluxo Setup celular e Inoculação

NOTA:. Use uma célula de fluxo microfluídicos dupla via de entrada descrito no Song et al, 2014 ¹⁴ para crescer biofilmes. Esta célula de fluxo é capaz de criar gradientes químicos suaves bem definidos. O desenho da célula de fluxo é mostrado na Figura 1 e o fluxo de fabricação de células foi previamente descrito em Song et al., 2014 ^14. Aqui detalhes nossos métodos usando P. aeruginosa e E. coli para formar biofilmes, mas outras espécies podem também ser adequados. Usamos P. aeruginosa PAO1- GFP, que constitutivamente expressa uma proteína fluorescente verde (GFP), como um organismo modelo para o desenvolvimento do biofilme. Além disso, foi utilizado E. coli DH5ct de formar biofilmes mistos de espécies com P. aeruginosa. P. aeruginosa e E. estirpes de E. coli foram cultivadas em placas de LB-agar.

1. Prepare a célula de fluxo usando polidimetilsiloxano (PDMS) vinculado a umlamela de vidro via tratamento de plasma de oxigênio, conforme descrito no ^14. As dimensões da câmara de célula de fluxo são de 23 mm x 13 milímetros x 0,24 milímetros (comprimento x largura x profundidade).
2. Prepare modificado FAB meio de crescimento ^15. Para observar o crescimento do biofilme sob um gradiente nutricional dentro da célula de fluxo, introduzem modificado FAB média ¹⁵ com glicose 0,6 M em uma entrada e introduzir médio FAB sem qualquer fonte de carbono através da outra entrada. Filtrar a esterilizar (tamanho dos poros = 0,2 m) da solução de estoque de glucose (60 mM) antes de ser adicionada ao meio de FAB. Também autoclave o meio FAB com ciclo 1 (líquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) antes do uso.
3. Esterilizar o sistema de fluxo. Antes da inoculação, autoclave o caminho inteiro fluxo (médias garrafas, tubos, retentores de bolhas, as células de fluxo), utilizando o ciclo 1, excepto para as válvulas de três vias de plástico descartáveis ​​(e pré-esterilizado) situados a montante da célula de fluxo. (Válvulas de três maneiras são usadas para injetar células cultura, marcador fluorescente e micropérolas.) Para evitar a contaminação durante a montagem, cubra todos os tubos e conectores aberturas com folha de alumínio ou sacos de autoclave antes da autoclavagem.
4. Ligue o sistema de fluxo. Montar os componentes do sistema de células de fluxo com cuidado (veja o vídeo para a montagem do sistema de fluxo) e entregar meio de crescimento para a célula de fluxo por meio de uma bomba peristáltica que controla com precisão a taxa de fluxo.
5. Prepare cultura de células para inoculação através da transferência de uma colônia de P. aeruginosa ou E. coli a partir de placas LB a 3 ml de caldo LB e agitar a cultura O / N a 225 rpm e 37 ° C. Diluir o / n de culturas de células em 1 ml de água estéril para uma DO final ₆₀₀ = 0,01 como o inoculo. (Cultura e diluir as bactérias numa câmara de fluxo laminar para evitar contaminação).
6. Para as experiências com biofilmes de espécies mistas, diluir as duas culturas bacterianas a uma proporção de 1: 1 em 1 ml com uma DO ₆₀₀ = 0,01 equivalente para cada bactéria.
7. Inocular a célula de fluxo. Injectar 1 mL de inoculo para a entrada da célula de fluxo da válvula de três vias. Após a injeção, pausar o fluxo de 1 hora para permitir que as células bacterianas para anexar a tampa de vidro. (Certifique-se de que a célula de fluxo é colocado com o lado da lamela para baixo para permitir que as células suspensas para resolver sobre a lamela.)
8. Após 1 h, retomar o fluxo e bombear o meio de crescimento para a célula de fluxo a uma taxa constante de 0,03 ml / min para cada entrada, durante 3 dias.

2. Caracterizar biofilme Desenvolvimento para a resposta aos nutrientes gradientes usando microscopia confocal

NOTA: P. aeruginosa pode ser trabalhada com GFP-constitutivamente expresso, mas E. coli em biofilmes mistos de espécies deve ser trabalhada por contracoloração.

1. Observe os biofilmes de 3 dias usando microscopia confocal. Para os resultados representativos, observar biofilmes utilizando um microscópio confocal com um objetivo 63X. Antes de imagem, marcaa célula de fluxo dupla via de entrada com uma grade do lado da tampa de vidro. (A finalidade desta grelha é para permitir que o experimentador para localizar as regiões de imagem no interior da câmara de célula de fluxo.)
2. Para contracoloração, dilui-se 10 ul de ácido nucleico mancha fluorescente vermelho célula-permeante, tal como mancha fluorescente verde ácido nucleico tal como STYO 62, solução-mãe (1 mM) em 990 ul de água esterilizada e depois injectar lentamente a mancha diluída utilizando uma seringa a câmara de célula de fluxo da válvula de três vias a montante. Manter a célula de fluxo estagnado e no escuro durante 30 min, em seguida, retomar o fluxo para lavar o corante libertado durante 15 min.
3. Realizar imagem confocal. Ative a 488 nm laser de argônio para a excitação ea emissão coleta canais para GFP (500-535 nm) e mancha de ácido nucleico (por fluorescente mancha verde ácido nucleico, 650-750 nm). Ajuste ganhos e compensações para ambos os canais para ter imagens mais brilhantes e limpas. Select xyz e modo de gravação simultânea. Use o botão de controle z para identificar a parte inferior e superior do biofilme no campo. Definir o z-passo a 0,5 mm para aquisição de uma imagem da pilha de 3-D. (Para garantir a alta qualidade de imagem, use uma linha média de quatro para aquisição de imagem.)
4. Para mapear os padrões espaciais de desenvolvimento de biofilme dentro da célula de fluxo, biofilmes imagem em três ou mais longitudinal (x) as distâncias ao longo da entrada da célula de fluxo, e em três transversal (y) posiciona em relação ao gradiente nutricional aplicada, como mostrado na Figura 1 .

3. Caracterizar Soluto Interno Transportes por injeções de Conservador Fluorescent Tracer

NOTA: Um marcador fluorescente conservadora, tais como Cy5, pode ser utilizado para caracterizar o padrão de transporte de solutos dentro do biofilme.

1. Dissolve-Cy5 (mono-reactiva NHS Éster) em água a uma concentração final de 10 mg / ml como uma solução estoque. Guardar a solução estoque Cy5 em um congelador a -20 ° C.
   Nota: Como Cy5 é light-SensITive, loja, diluir e injetar soluções Cy5 no escuro.
2. Antes das injecções do marcador fluorescente, tomar uma imagem da pilha de 3-D do biofilme de 3 dias com microscopia confocal (com uma objectiva 63X). (Regiões largas de colônias biofilme são ideais para observações de séries temporais de transporte corante.) Também escolher um z-plane com colônias bem separados para imagens (como mostrado na Figura 5A).
3. Para cada experiência injecção Cy5, diluir 2 uL da solução de stock de Cy5 em 998 ul de água estéril para se obter uma solução para injecção com uma concentração de Cy5 20 ug / ml.
4. Parar a bomba para interromper o fluxo e injectar a solução para o Cy5 a montante da célula de fluxo, utilizando uma seringa, através da válvula de 3 vias. (É importante evitar que as bolhas de ar que entra no percurso de escoamento durante a injecção. Retentores de bolhas deve ser mantida aberta durante a injecção de volta).
5. Depois de injetar a solução Cy5, feche as armadilhas bolha, ajustar a válvula de 3 vias, e reiniciar obomba para fornecer a solução de Cy5 injectado para dentro da célula de fluxo.
6. Mudar o modo de imagem confocal para XYT. Ative Cy5 e GFP canais sob o modo de gravação simultânea. Ajustar as definições confocal sobre Cy5 intensidade (intensidade do laser, ganhar e offset) para evitar a saturação sinais, o que é crítico para a quantificação. (Alta resolução temporal é o preferido para a visualização de penetração do corante. No entanto, digitalização rápida diminui a qualidade da imagem.) Escolha a velocidade de verificação adequada e média linha para equilibrar o tempo de resolução de imagem e qualidade de imagem. Para este protocolo usar uma média de linha de quatro e uma taxa de quadros de 0,15 Hz.
7. Retomar o fluxo para entregar Cy5 para dentro da célula de fluxo (ainda a um caudal de 0,03 ml / min). Simultaneamente a hora de início da série confocal de imagem.
8. Quantificar Cy5 penetração por radialmente média intensidade Cy5 dentro de uma colônia de biofilme circular 2-D. Para fazer a média, primeiro identificar a aresta de um cluster de biofilme, em seguida, gerar um mapa de distância para uma secção de 2-D do aglomeradoE, finalmente, os padrões de intensidade média radiais Cy5 para gerar uma curva de penetração (ver Figura 6).
   1. Para computacionalmente perceber o passo 3.8, utilize BioSPA (Análise de Padrões de biofilme Spatial) pacote de software (inédito pacote, software e manual disponível mediante pedido) ou outros programas de análise de imagem.
   2. Para usar BioSPA, primeiro importar uma imagem colocada em BioSPA. Em seguida, selecione limite adequado para os canais de GFP e Cy5 para fazer imagens binárias. No menu de análise / cálculo, selecione Análise Avançada e, em seguida, Análise de Difusão. Usar o canal GFP para definir a aresta de um cluster e utilizar a ferramenta polígono para seleccionar um cluster como a região de interesse (ROI).
   3. Clique duas vezes o cluster biofilme selecionado para realizar a análise de difusão. Salve os resultados da análise de difusão e calibrar a intensidade Cy5 a concentração Cy5 utilizando uma curva de calibração.
      1. Para gerar Cy5 curva de calibração de concentração, medir intensidades Cy5 durante um conce Cy5gradiente ntration sob microscopia confocal. (Intensidade e concentração Cy5 têm uma relação linear).

4. Caracterização torno campo do fluxo através do rastreamento Fluorescent Particles

NOTA: partículas fluorescentes, tais como micro-esferas fluorescentes, podem ser utilizados para caracterizar o campo de fluxo de cerca de biofilmes. Campo de fluxo em torno de biofilmes pode ser calculado a partir das observações de séries temporais de posições partículas usando software de monitoramento de partículas velocimetria. Os resultados aqui apresentados foram obtidos com o Streams 2,02 software pacote de ¹⁶ (download de software e manual do utilizador disponível em http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

1. Dilui-se as microesferas fluorescentes (diâmetro de ~ 1 um) em água esterilizada a uma concentração de sólidos final de 0,2% e um volume final de 0,5 ml. Vortex para se certificar de que as microesferassão bem dispersa.
2. Injectar e entregar as microesferas fluorescentes diluídas na célula de fluxo de acordo com procedimentos de passos 3.3 a 3.5. Para permitir um acompanhamento preciso do caminho partícula, use uma taxa relativamente baixa de fluxo (0,01 ml / h para os resultados de rastreamento de partículas neste artigo).
3. Mudar configurações confocal modo para XYT para acompanhar o movimento de partículas em um z-slice e tomar imagens de séries temporais. (A taxa de quadros de 1 Hz foi utilizado para os resultados representativos apresentados no presente relatório.) Repita a injeção de partículas e imagem em diferentes locais z para gerar fluxo de campo 3-D.
4. Pré-processo o tempo-series imagens confocal subtraindo-se o sinal de fluorescência de fundo (o sinal na primeira imagem obtida do conjunto imagem) usando ImageJ (download de software e manual disponível em http://imagej.nih.gov/ij/ ) ou outros programas.
5. Em ImageJ, abra a primeira imagem de um conjunto de imagens e depois importar o conjunto de imagens. Em Processo de Imagem / Calculator, subtrair a primeira imagem do conjunto imagem. Salve o pré-processado conjunto imagem.
6. Para calcular vetores de fluxo, de importação de séries temporais de imagens confocal em Streams 2,02. No âmbito da "visão de processo Open", selecionar e executar "Identificar partículas". Use limiar adequado para identificar partículas. Use 0,5 e 5 m como limites mínimos e diâmetro máximo de 1 mm partículas.
7. Em seguida, em "view processo Open", selecionar e executar "PTV análise pipeline" para gerar caminhos de partículas. Confira os caminhos de partículas para ver se eles representam o movimento de partículas. Finalmente, selecionar e executar "Criar campo de velocidade" para gerar um mapa do vetor fluxo.

Resultados

A célula de fluxo microfluidico dupla via de entrada permite a observação do crescimento do biofilme sob um gradiente de química bem definida formada pela mistura de duas soluções no interior da câmara de fluxo. O gradiente químico resultante foi anteriormente observado por injeção de corante e caracterizados em detalhe por Song et al. ^14. Gradientes de concentração lisas foram formados na direcção transversal, tal como mostrado na Figura 1. O perfil de concentração foi íngreme perto...

Discussão

Nós demonstramos um conjunto de métodos para caracterizar três importantes interações biofilme-ambientais: resposta biofilme para gradientes químicos, efeitos do crescimento do biofilme sobre o microambiente fluxo envolvente, e heterogeneidade biofilme resultante de limitações de transporte interno.

Nós mostramos pela primeira vez o uso de uma nova célula de fluxo de microfluidos para impor um gradiente de química bem definida para o desenvolvimento do biofilme. Para criar um gradiente de qu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba Peristáltica	Gilson	Miniplus 3	Configuração e inoculação de células de fluxo
Tubulação da bomba 0.50  mm OVC, Laranja/Amarelo		Gilson F117934	Configuração e inoculação de células
de fluxo Torneira de três vias com Giratório Macho Luer lock	Smiths Medical	Configuração	e inoculação de células de fluxo
Encapsulamento de células solares Sylgard 184 para fazer painéis solares	ML Solar LLC		Configuração e inoculação de células de fluxo
Garrafa média Pyrex, 1  L, GL45	VWR	16157-191	Configuração e inoculação da célula de fluxo
Tubulação C-FLEX	Cole-Parmer	06422-02	Configuração e inoculação da célula de fluxo 1
ml TB Seringa	BD	309659	Configuração e inoculação da célula de fluxo
Tubulação de polímero	IDEX	1520G	Configuração e inoculação da célula de fluxo
Adaptador de Stub Luer Intramédico Estéril	Clay Adams	427564	Configuração e inoculação de células de fluxo
Agulha PrecisionGlide	BD	305195	Configuração e inoculação de células de fluxo
Espectrofotômetro	HACH		Configuração e inoculação de células de fluxo
Filtros de seringa - estéreis (0,2 μ m)	Fisherbrand	09-719A Configuração e	inoculação da célula de fluxo
MAXQ Shaker	Thermo Scientific		Configuração e inoculação da célula de fluxo
Sulfato de amônio	Sigma Aldrich	A4418	Meio de crescimento
Fosfato de sódio dibásico anidro	Sigma Aldrich	RES20908-A7	Meio de crescimento
Fosfato de potássio monobásico	Sigma Aldrich	P5655	Meio de crescimento
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S7653	Meio de crescimento
Cloreto de magnisium	Sigma Aldrich	M8266	Meio de crescimento
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	C5670	Meio de crescimento
Sulfato de cálcio di-hidratado	Sigma Aldrich	C3771	Meio de crescimento
Sulfato de ferro (II) heptahidratado	Sigma Aldrich	215422	Meio de crescimento
Sulfato de manganês (II) monohidratado	Sigma Aldrich	M7634	Meio de crescimento
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	451657	Meio de crescimento
Sulfato de zinco heptahidratado	Sigma Aldrich	Z0251	Meio de crescimento
Sulfato de cobalto (II) heptahidratado	Sigma Aldrich	C6768	Meio de crescimento
Molibdato de sódio	Sigma Aldrich	243655	Meio de crescimento
Ácido bórico	Sigma Aldrich	B6768	Meio de crescimento
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Meio de crescimento
Luria Bertani Caldo	Sigma Aldrich	L3022	Meio de crescimento
TCS SP2 Microscopia Confocal	Leica		Imagem fluorescente
SYTO 62	Life Technology	S11344	Imagem fluorescente
Cy5	GE Healthcare Life Sciences	PA15100	Imagem fluorescente
Fluorescente vermelha (580/605) FluoSphere	Life Technology	F-8801	Imagem fluorescente
BioSPA	Packman Lab		Processamento de imagem
ImageJ	NIH		Processamento de imagem
Volocidade	PerkinElmer		Image Processing
Streams 2.02	Processamento de imagens da Universidade de Cantebury