O objetivo deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária. Com esta técnica, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. Um protocolo de extração pulmonar está incluído para estudar metástases pulmonares. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo do embrião de camundongo está incluído.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na tumorigênese mamária, o estágio metastático da doença representa a maior ameaça para o indivíduo afetado. Células mamárias normais com genótipos alterados agora possuem a capacidade de invadir e sobreviver em outros tecidos. Neste protocolo, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. As células isoladas deste procedimento estão então disponíveis para experimentos de perfil genético. Para uma metástase bem-sucedida, essas células devem ser capazes de intravasar, sobreviver em circulação, extravasar para órgãos distantes e sobreviver nesse novo sistema de órgãos. Os pulmões são o alvo típico da metástase do câncer de mama. Foi descoberto um conjunto de genes que medeia a seletividade da metástase para o pulmão. Aqui descrevemos um método de estudo de metástase pulmonar a partir de um modelo de camundongo geneticamente modificado. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) do embrião de camundongo está incluído. As células MEF do mesmo tipo animal fornecem uma pista da expressão gênica de células não cancerígenas. Juntas, essas técnicas são úteis no estudo da tumorigênese mamária de camundongos, seus mecanismos de sinalização associados e vias das anormalidades em embriões.
Introdução
A metástase é a etapa final na progressão do câncer de mama 1. Envolve uma série de etapas nas quais as células malignas são liberadas do tumor primário e disseminadas para outros órgãos 2. As células devem ser capazes de intravasar, sobreviver em circulação, extravasar para órgãos distantes e sobreviver nesse novo sistema de órgãos 3. Cada etapa da tumorigênese é rigidamente controlada pelas células por meio de várias alterações genéticas e epigenéticas 4. Para estudar os mecanismos da tumorigênese do câncer de mama, sistemas de modelos de camundongos têm sido utilizados devido à sua curta vida útil, tamanho pequeno e rápid....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os experimentos foram realizados em ratos de acordo com protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso (IACUC) da LSU School of Medicine. Todos os instrumentos devem ser autoclavados antes da dissecção.
1. Preparação de células primárias de tumores de mama mouse
- Use um modelo de camundongo que foi geneticamente modificada com o mouse mamária Tumor poliomav�us Oriente T-Antigen (mouse MMTV-PyMT-transgênica), que se desenvolvem espontaneamente tumores como descrito anteriormente 6.
- Sacrificar os ratinhos com isoflurano (99,9%) e pulverizar etanol 75% para assegurar um ambiente estéril (Figu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A fase de progressão do tumor em que a sacrificar o animal depende do estudo particular e orientações IACUC. Na Figura 1A, um velho C57BL / 6 do mouse 100 dias com o mouse mamária Tumor poliomav�us Oriente T-Antigen (MMTV-PyMT) foi sacrificado em três meses. A pele foi aberta a partir da área do orifício uretral para o pescoço com as tesouras e a pele foi fixado para baixo para permitir o fácil acesso a órgãos como mostrado na Figura 1B. Isto permitiu um fácil acesso ao tumor que foi .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo é para isolar células primárias de um tumor fresco mouse. Os lisados preparados a partir de este método são úteis para a proteína, ADN e análise de ARN. As células cancerosas de tumor da mama primário frequentemente metastizar para o cérebro, pulmão e osso 1. Inclui-se uma técnica para extrair o pulmão para a detecção de metástases. A coloração do pulmão com uma mancha de tinta vai permitir a visualização dos nódulos tumorais como pode ser visto na Figura 2B. Que fixa os pulm.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao NIH, LACaTS e à fundação clínica Ochsner pelo apoio financeiro.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Armazenar em 4 ° C |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Tecnologias de vida | 25300-062 | Armazene em – 20 & deg; C |
| Colagenase Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Loja em – 20 ° C |
| Hialuronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Loja em – 20 ° |
| C Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Loja a 4 & deg; C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Armazene em – 80 ° C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store na RT |
| India Ink | Yasutomo | Store na RT | |
| AERRANE (Isoflurano) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store na RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store na RT |
Referências
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
