Artigo de método

Response malha trabecular para elevação de pressão na Vida Olho Humano

DOI:

10.3791/52611

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20 de junho de 2015

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1Department of Ophthalmology, UPMC Eye Center, Eye and Ear Institute, Ophthalmology and Visual Science Research Center, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, Swanson School of Engineering, University of Pittsburgh, 3The McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Deptartment of Biostatistics, Graduate School of Public Health, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rede trabecular (TM) de migração para o espaço do canal de Schlemm pode ser induzida por elevação da pressão aguda por ophthalmodynamometer, e observado por tomografia domínio espectral de coerência óptica. O objetivo deste método é o de quantificar a resposta morfométricas da via de saída vivendo a elevação da pressão aguda em tecidos vivos in situ.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As características mecânicas da malha trabecular (TM) está ligada à resistência de escoamento e a pressão intra-ocular (PIO) a regulação. A lógica por trás dessa técnica é a observação direta da resposta mecânica da TM para o aumento da PIO aguda. Antes da digitalização, a PIO é medido no início e durante a elevação da PIO. O limbo é digitalizado por espectral-domain tomografia de coerência óptica no início e durante a elevação da PIO (ophthalmodynamometer (ODM), aplicada em 30 g vigor). Scans são processados ​​para melhorar a visualização da via humor drenagem do humor aquoso usando ImageJ. Marcos vasculares são usados ​​para identificar locais correspondentes na linha de base e da PIO volumes de verificação de elevação. Schlemm canal área (SC) transversal (SC-CSA) e comprimento SC de anterior para posterior ao longo do eixo longas são medidos manualmente em 10 locais dentro de um segmento de 1 mm da SC. Significa a distância interior da parede exterior (comprimento do eixo curto) é calculada como a área de SC dividido pelo seucomprimento do eixo longo. Para examinar a contribuição de tecidos adjacentes ao efeito elevações da PIO, as medições são repetidas, sem e com o relaxamento do músculo liso com instilação de tropicamida. TM migração em SC é resistido por TM rigidez, mas é reforçada pelo apoio da sua fixação ao músculo liso adjacente dentro do corpo ciliar. Esta técnica é o primeiro a medir a resposta humana viva TM para elevação da pressão in situ sob condições fisiológicas dentro do olho humano.

Introdução

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O glaucoma é a segunda principal causa mundial de cegueira irreversível 1. Pressão intra-ocular (PIO) elevada é um fator de risco causal para a presença ea progressão do glaucoma 2-7.   PIO é regulada pelo equilíbrio entre a formação e escoamento do humor aquoso 8. Os locais de maior resistência ao escoamento do tecido são juxtacanicular e a parede interna do canal de Schlemm (CS), a interface entre SC e a malha trabecular (TM) 9-11. Enquanto TM rigidez pode contribuir para a prevenção de colapso SC em face da elevação da PIO, Overby 12 et ai. Demonstraram recentemente que a expressão do gene no glaucoma é alterada, o que resulta num aumento da rigidez SC endotelial, impedindo a formação de poros, levando a elevação da pressão intra- olhos glaucomatosos 13. TM morfologia e rigidez correlacionam-se com facilidade de drenagem 14,15, enfatizando tele precisa medir suas características biomecânicas.

Medições de microscopia de força atômica da TM mostrar rigidez elevada nos olhos doados por pacientes de glaucoma (81 kPa), em comparação com os olhos de doadores sem glaucoma (4,0 kPa) 16, mas essas medições foram feitas em ex vivo tecidos dissecados. O TM posterior é ancorada no músculo ciliar através tendões anteriores das células musculares longitudinais que são inseridos no exterior lamelares e cribiforme 17 TM. Ciliar músculo (CM) atividade pode aumentar TM tautness, imitando elevada rigidez TM 17. A capacidade de observar alterações na resistência ao colapso SC induzidas por perturbações do músculo liso tem sido demonstrado em modelos animais 18. Nós demonstramos a capacidade de imagem não-invasiva do sistema aquoso primário humor saída em olhos humanos vivendo distal e incluindo SC usando espectral domínio tomografia de coerência óptica (OCT) 19-21. Usando esta técnica, que têm demonstrado a capacidade de quantificar a resposta morfométricas da TM e SC para o aumento da PIO aguda 22.

O objetivo geral do método aqui descrito foi quantificar a resposta morfométricas da via de saída vivendo a elevação da PIO aguda em tecidos vivos in situ. Esta técnica tem a vantagem de o exame da TM sob condições fisiológicas, que inclui contribuições de ambos actividade fibra contrátil dentro da TM TM e CM para rigidez, em comparação com as medições feitas publicados em tecidos dissecados. A lógica por trás de aplicar esta técnica para observação da resposta TM mecânica é que ela nos proporciona conhecimentos de outra forma indisponíveis para o comportamento mecânico do TM, que agora sabemos ser ligada diretamente a resistência de saída e regulação IOP 13. Para discernir a contribuição de tecidos contráteis a rigidez geral, uma pequena cohort de indivíduos foi examinado sem e com supressão da atividade do músculo liso pela administração de tropicamida.

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Protocolo

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Declaração de Ética: A aprovação foi obtida a partir da análise da Diretoria da Universidade de Pittsburgh School of Medicine Institucional antes de recrutamento assunto começou. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado antes da participação no estudo.

1. Aquisição de Dados

  1. Elevação de Pressão
    1. Tome as medições da linha de base (PIO e outubro medições) por incutir uma queda de 0,5% proparacaina no olho. Esperar 3 min para eficácia.
    2. Gentilmente aplicar pressão para a esclerótica temporal com o ophthalmodynamometer, 30 g na coorte 1, e 5 e, em seguida, 10 g de coorte 2. Em seguida, tomar as medidas desejadas (PIO e outubro) como segue
      1. Medidas da PIO
        1. Medir PIO basal. Elevar a pressão como descrito na seção 1.1.
        2. Na coorte 1 instilar uma gota de proparacaína a 0,5%, 3 minutos para permitir que a eficácia, e aplicam-se 30 g de pressão à esclerótica. Enquanto a pressão está sendo aplicada, medir a PIO utilizando o tonômetro seguinte cturerinstruções de cturer.
        3. Na coorte 2, instilar uma gota de proparacaína a 0,5%, 3 minutos para permitir que a eficácia, e aplicam-se 5 g de pressão usando uma ophthalmodynamometer escleral. Medir a PIO durante a elevação da pressão utilizando as instruções do fabricante tonômetro seguinte a.
          1. Esperar 5 minutos após a medição 5 g.
          2. Aplicar 10 g de pressão escleral por ophthalmodynamometer, e medir a PIO durante a elevação da pressão usando o tonômetro de acordo com as instruções do fabricante. Grave a PIO e condição (ou seja, linha de base ou 10 g) no registo de estudo.
      2. Outubro de digitalização
        1. Assente o assunto no scanner de outubro. Digite os dados demográficos do paciente para novos temas, ou recolha de dados demográficos do banco de dados outubro para assuntos previamente digitalizados.
        2. Selecione o segmento anterior protocolo 512 x 128 digitalização. Centralize o olho na janela de imagem de vídeo. Diminuir a distância entre o scannere olho até que a imagem córnea transversal aparece na janela de digitalização
        3. Usando os comandos verbais posicionar o limbo temporal com o centro da janela de digitalização, orientando olhar paciente na direcção nasal
        4. Adquirir a varredura de linha de base, e rever a verificação de qualidade. Se for aceitável, salvar, e se não for aceitável, repita este passo.
          1. Aceitar varreduras se não houver pisca, e o ângulo é visualizado em todo o volume sem deriva fora da borda da imagem ou virar na parte superior.
        5. Incutir uma queda de 0,5% proparacaína, permitir que 3 min para a eficácia, e repita os passos 1.3.2 através de 1.3.5.
        6. Para coorte 1, aplicam-se 30 g de pressão de esclerótica por ophthalmodynamometer, e adquirir o varrimento enquanto a pressão está a ser aplicada. Retire a pressão e avaliar a verificação de qualidade. Se for aceitável, salvar, e se não for aceitável, repita este passo.
        7. Para coorte 2, aplicam-se 5 g de pressão escleral por ophthalmodynamometer, e adquirir o varrimento enquanto a pressão está a ser aplicada. Retire a pressão e avaliar a verificação de qualidade. Se for aceitável, salvar, e se não for aceitável, repita este passo.
        8. Espere 5 minutos, permitindo que o olho para se recuperar do 5 g perturbação pressão.
        9. Para coorte 2, aplicam-se 10 g de pressão de esclerótica por ophthalmodynamometer, e adquirir o varrimento enquanto a pressão está a ser aplicada. Retire a pressão e avaliar a verificação de qualidade. Se for aceitável, salvar, e se não for aceitável, repita este passo.
        10. Grave o tempo de varredura, condição (ie, linha de base ou 10 g) e localização no registo de estudo.

2. Processamento de Dados

  1. Conecte um dispositivo de armazenamento USB de alta capacidade para a outubro Selecione "Exportar" no menu Registros sobre a outubro Designar um local de arquivo para arquivos exportados na unidade USB. De-selecione a opção ".zip". Digite o nome do paciente para scans a ser exportado e selecione os exames a serem exportados. Inicie a exportação.
  2. Quando a exportação for concluída, desmontar a unidade USB e retire do PTU. Conecte o drive USB de alta capacidade que contém as imagens exportadas para a estação de trabalho de processamento de imagem.
  3. Inicie o programa de processamento de imagem neste caso ImageJ.
  4. Importe os dados de imagem em bruto; selecione "File -> Importar -> Raw" no menu arquivo. Selecione o arquivo com terminando em "_cube_raw.img" para ser processado a partir da unidade USB.
  5. Salve o arquivo importado usando um novo nome, de modo que os dados da imagem original é salvo inalterado (http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages).
  6. Digite os parâmetros de importação da seguinte forma, de tipo de imagem: 8 bit, Largura: 512, altura: 1024, Offset: 0; Número de imagens: 128.
  7. Selecione "Plugins -> R direito de inscrição -> StackReg" no menu de plugins. E, em seguida, selecione a opção "Corpo Rígido"Opção. Em seguida, selecione "File -> Salvar como -> TIFF" para salvar a pilha alinhados.
  8. Selecione "Processo -> Filtros -> A média de 3D" no menu de processo. Digite os parâmetros X = 1, Y = 1, e Z = 1 como as opções de filtro. Repita esta etapa duas vezes.
  9. Selecione "Arquivo -> Salvar como -> TIFF" para salvar a pilha média. Girar a roda do mouse para mover-se para o quadro 1 da pilha ativa.
  10. Selecione "Processo -> melhorar o contraste local (CLAHE)" no menu Processamento. Utilize o tamanho de bloco de parâmetros: 31, barras do histograma: 256, inclinação máxima: 5, Máscara: nenhum, e marque a opção "fast". Use a tecla seta para a direita para avançar para o próximo quadro.
  11. Mover-se para o quadro 2 da pilha ativa e repita o Process-> melhorar o contraste local (CLAHE). Repetir até todos os quadros tiveram contraste melhorado.
  12. Selecione "Arquivo -> Salvar como -> TIFF"; para economizar a pilha de realce. Em seguida, selecione "Imagem -> Ajuste -> Size" no menu Imagem. Desmarque a opção "Restringir Proporções", em seguida, insira Largura: 2.048 e altura: 1.024 valores.
  13. Selecione "Imagem -> Transform -> Inverter Verticalmente" no menu Imagem. Em seguida, selecione "Analisar -> Set Scale" no menu Analisar. Digite Distância em pixels: 2.048, distância Conhecido: 4.000, e Pixel Aspect Ratio: 1 e clique em OK. Selecione "Arquivo -> Salvar como -> TIFF" para salvar a 1 calibrado: uma relação de aspecto de pilha.
  14. Lentamente girar a roda do mouse para examinar visualmente as varreduras para identificar um cruzamento embarcação distintivo para servir como um ponto de referência dentro de varreduras. Anote o número da imagem e número de referência do quadro na planilha de análise.
  15. Pressione a seta para a esquerda chave 15 vezes para ir para o primeiro quadro de medição. Selecione a opção "SelectionsR Freehand21; ferramenta a partir da barra de ferramentas.
  16. Posicione o mouse no centro de SC e pressione a seta para cima. Repita este passo até SC enche a tela.
  17. Manualmente segmento SC circundando a fronteira com o mouse. Segure a tecla Control (Ctrl) e aperte D para o quadro actual da imagem. Segure a tecla Ctrl e pressione M. Transcrever a medição da SC área transversal e número do quadro de medição para a planilha de análise. De-selecione a área delineada. Pressione a seta para direita chave 3 vezes. Repita este passo até SC foi medido em 10 quadros.
  18. Pressione a seta para a esquerda chave 30 vezes para voltar para o primeiro quadro de medição.
  19. Selecione a ferramenta segmento em linha reta da barra de ferramentas.
  20. Desenhar uma linha reta desde o ântero-posterior mais para a maioria dos locais no-SC. Segure a tecla Ctrl e pressione D para somente o quadro atual. Segure a tecla Ctrl e pressione comprimento M. Transcribe SC eo número do quadro para a planilha de análise. De-selecione a área delineada. Pressione a tecla seta para a direitaTrês vezes. Repita este procedimento até comprimento SC foi medida nos mesmos 10 quadros como área transversal a SC.
  21. Inserir a equação IOWD SC-length = SC-CSA / axial na planilha de análise para calcular média SC interior da parede com a distância da parede exterior (SC-IOWD) dividindo-se as medições da área pelas medições de comprimento.
  22. Pressione a seta para a esquerda chave 30 vezes para voltar para o primeiro quadro de medição.
  23. Selecione a ferramenta segmento em linha reta da barra de ferramentas.
  24. Desenhar uma linha reta desde o anterior-mais em SC para a fronteira da malha trabecular e câmara anterior. Certifique-se de que a linha é perpendicular à fronteira. Segure Ctrl e pressione D, em seguida, M.
  25. Desenhar uma linha a partir do posterior-most localização do SC e da fronteira da TM e da câmara anterior. Certifique-se de que a linha perpendicular à fronteira. Hold Control e pressione D, em seguida, M.
  26. Desenhar uma linha do centro de SC e da fronteira da TM e da câmara anterior. Certifique-se de que a line perpendicular à fronteira. Segure a tecla Ctrl e pressione D para somente o quadro atual.
  27. Transcrever as três medições de espessura TM e número do quadro para a planilha de análise. Para fazer isso pressione a seta para direita chave 3 vezes. Repita este passo até espessura TM foi medida nos mesmos 10 quadros como área transversal a SC.

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Resultados

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Utilizando essas técnicas de aquisição de dados e análise de imagem, são obtidos os efeitos de pequenas e grandes alterações na pressão intra-ocular em vias de saída parâmetros morfológicos, tais como SC área em corte transversal (Figura 1). Podemos ver que altos níveis de aumento da PIO produzir um colapso observável de SC, como representado por uma grande redução na área transversal. O olho parece ser capaz de acomodar pequenos aumentos na pressão intra-ocular, tal como evidenciado pela ausência de al...

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Discussão

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A presente técnica aproveita observação não invasivo da resposta mecânica do tecido macio para quantificar colapso SC. Os trabalhos futuros usando cadáveres olhos humanos é necessário para calibrar desvios de tecido rigidez tecidual real após a dissecação. Mas, esses estudos vão sofrer as mesmas limitações dos modelos de escoamento anteriores; especificamente, que as contribuições de músculo vivendo a tensão do tecido não estará presente. Além disso calibração num modelo de olho do mamífero vivo pode permitir a calibraç...

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Divulgações

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Dr. Schuman recebeu royalties por propriedade intelectual licenciada pelo Instituto de Tecnologia de Massachusetts e Massachusetts Eye and Ear Infirmary para Zeiss, Inc.

Agradecimentos

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Apoiado em parte pelos contratos R01-EY13178 e P30-EY08098 do Instituto Nacional de Saúde (Bethesda, MD), pela Eye and Ear Foundation (Pittsburgh, PA) e bolsas irrestritas da Research to Prevent Blindness (Nova York, NY).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
de trabalho de imagem
Programa de Processamento de Imagens de Nova York, NY
rsb.info.nih.gov/ijImageJ, FIJI
Estação Spectral Domain OCT Zeiss Cirrus Apple iMac Oftalmodinamômetro Baillairt Matalene Ophthalmodynamometer, Instrumentos cirúrgicos CO., Inc.

Referências

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