É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Summary

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Abstract

Recentemente, foi demonstrado que a amplificação da polimerase recombinase (RPA), uma plataforma de amplificação isotérmica para detecção de patógenos, pode ser usada para quantificar a concentração de amostras de DNA usando uma curva padrão. Neste manuscrito, é fornecido um protocolo detalhado para desenvolver e implementar um ensaio de amplificação da polimerase recombinase quantitativa em tempo real (ensaio qRPA). Usando a quantificação do DNA do HIV-1 como exemplo, a montagem de reações de RPA em tempo real, o design de uma sequência de controle positivo interno (IPC) e a co-amplificação do IPC e do alvo de interesse são todos descritos. São fornecidas instruções e scripts de processamento de dados para a construção de uma curva padrão usando dados de vários experimentos, que podem ser usados para prever a concentração de amostras desconhecidas ou avaliar o desempenho do ensaio. Finalmente, é descrito um método alternativo para coletar dados de fluorescência em tempo real com um microscópio e um aquecedor de platina como um passo para o desenvolvimento de um ensaio qRPA no local de atendimento. O protocolo e os scripts fornecidos podem ser usados para o desenvolvimento de um ensaio qRPA para qualquer alvo de DNA de interesse.

Introduction

Quantitativo de amplificação de ácido nucleico é uma técnica importante para a detecção do meio ambiente, de origem alimentar, e agentes patogénicos de origem da água, bem como para diagnósticos clínicos. Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é o método padrão de ouro para a detecção sensível, específico, e quantitativa de ácidos nucleicos, por exemplo, para o HIV-1 de teste de carga virai, a detecção de agentes patogénicos bacterianos, e rastreio para muitos outros organismos ^{1 – 3.} Durante qPCR em tempo real, os iniciadores de amplificação de ADN patógeno em ciclos, e um sinal de fluorescência que é gerada é proporcional à quantidade de ADN amplificado na amostra em cada ciclo. Uma amostra contendo uma concentração desconhecida de DNA agente patogénico pode ser quantificada utilizando uma curva padrão que relaciona a concentração inicial de ADN de amostras padrão e a hora em que o sinal fluorescente atinge um determinado limiar (ou seja, o ciclo limiar, C ou _T).

<p class="Jove_content"> Porque qPCR em tempo real requer equipamento caro ciclos térmicos e várias horas, para receber os resultados de amplificação isotérmica técnicas alternativas, tais como a amplificação com polimerase recombinase (APR), têm sido desenvolvidos ^4. Estas plataformas geralmente proporcionar resultados mais rápidos e amplificar ácidos nucleicos em, uma única temperatura mais baixa, que pode ser realizada com equipamento menos dispendioso, mais simples. RPA, o que é particularmente atractivo para aplicações de ponto de cuidados, amplifica o DNA em minutos, exige uma temperatura baixa de amplificação (37 ° C), e permanece activa na presença de impurezas de ^5,6. Ensaios de RPA foram desenvolvidos para uma ampla gama de aplicações, incluindo a análise de alimentos, detecção de agentes patogénicos, o rastreio de fármacos do cancro, e a detecção de agentes biothreat ^7-12. No entanto, o uso de RPA para a quantificação de ácidos nucleicos tem sido limitada ^13,14.

Em trabalhos anteriores, foi shown que em tempo real quantitativo RPA (qRPA) é viável ^15. Aqui, um protocolo mais detalhada é fornecida para a utilização em tempo real para quantificar a RPA quantitativa amostras desconhecidas utilizando uma curva padrão, um método que é análogo à quantificação utilizando qPCR. Este protocolo descreve como realizar uma reacção de APR num termociclador para detectar ADN do VIH-1 como uma prova de conceito, bem como desenvolver um controlo positivo interno (IPC) para assegurar está a funcionar adequadamente no sistema. A coleta de dados usando um termociclador ou microscópio e análise de dados para a construção de uma curva padrão, utilizando dados de treinamento também é detalhado. Por fim, o método para quantificar amostras desconhecidas por meio de curva padrão com um script personalizado é demonstrada. Esta técnica permite qRPA quantificação de amostras com concentrações desconhecidas e tem muitas vantagens em relação a tempo real tradicional qPCR.

Protocol

1. Programe o termociclador em tempo real Reações qRPA

1. Criar um novo protocolo no software termociclador.
   1. Inserir um passo de pré-incubação: 39 ° C durante 1 min.
   2. Adicionar uma segunda etapa: 39 ° C durante 20 segundos seguido por uma placa de leitura.
   3. Finalmente, insira um "ir para" que se repete a segunda etapa 59 vezes mais.
   4. Salve o protocolo.
2. Criar uma nova placa na guia "editor placa" do software. Escolha poços na placa correspondentes às localizações das reacções RPA (aqui, o uso de poços A1, A4-A8, B1 e B4-B8).
   NOTA: Não é importante se o tipo de amostra dos poços (por exemplo, "Standard", "NTC") é especificado, como a análise de dados é feita através de um script personalizado.
   1. Para experiências contendo apenas HIV-1 DNA, selecione o fluorophore "HEX" para todos os poços. Para experiências contendo HIV-1 DNA e um co interna positivantrol, selecione ambos "HEX" e fluorophores "fam" para todos os poços. Guarde o prato.

2. Prepare-se para Experimentos HIV-1 qRPA

1. Montar reações RPA em um espaço de trabalho de pré-amplificação designada contendo pipetas designados, pontas de pipetas, vortexer e mini-centrífuga, como por qPCR. Como APR pode amplificar uma única cópia de DNA por tanto quanto dez ordens de grandeza (dados não mostrados), manusear e descartar os tubos que contêm os seus produtos amplificados de ADN em uma área de pós-amplificação designada.
   1. Evitar o contacto entre todos os reagentes pré-amplificação e produtos pós-amplificação. Spray de espaços de trabalho e equipamentos com 50% de alvejante de pré-amplificação antes e depois de todas as experiências. Use uma toalha de papel para enxugar o excesso de água sanitária.
2. Compra sequência primer forward 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'e reverter seqüência 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT GTT G-3 'a partir de sintetizadores de DNA comerciais. Comprar a sequência da sonda 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C-3 'a partir de fontes comerciais. Armazenar todos os iniciadores e sondas, a 4 ° C em alíquotas a uma concentração de 10 uM antes da utilização.
   NOTA: O ensaio qRPA amplifica um HIV-1 sequência única. Para este ensaio prova-de-conceito, usar o plasmídeo pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr descrito por Sutton et al., Que contém a sequência alvo ^16. Para as experiências de qRPA, o plasmídeo foi armazenado a 4 ° C em aliquotas contendo 1, 10, 10 ^2, 10 ^{3, 4} e 10 cópias por ul de um tampão contendo Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM a pH 8,0, e 1 ng / DNA genómico humano ul de suporte (360,486). Esta concentração de ADN transportador é equivalente à concentração de DNA obtidos a partir de conjuntos de extracção de ADN de soro comerciais utilizados para o diagnóstico de VIH-1 ^17. Estes HIV-1as diluições foram utilizados como moldes em reacções qRPA para construir uma curva padrão.

3. Monte uma qRPA curva padrão HIV-1

1. Antes de montar as reacções qRPA, preparar o espaço de trabalho pré-amplificação conforme descrito no passo 2.1.1. Coloque um bloco de 96 poços frio em armazenamento a 4 ° C.
2. Prepare reagentes para 12 reações:
   1. Mover o acetato de magnésio, o tampão de re-hidratação, e 12 pelotas de reacção RPA para o espaço de trabalho pré-amplificação.
   2. Descongelar o acetato de magnésio e o tampão de re-hidratação à temperatura ambiente.
   3. Aliquota de 32,5 mL de acetato de magnésio (2,5 ul por reacção) para um tubo de microcentrífuga.
   4. Prepare uma mistura 13x master. Adicionar 383,5 ul do tampão de reidratação (29,5 ul por reacção) para um tubo de microcentrífuga separados para a mistura principal. Adicionar 41,6 mL de água livre de nuclease (3,2 mL por reação) para a mistura principal. Vortex o mix master.
   5. Retorne o aceta magnésiote e tampão de reidratação para armazenamento a -20 ° C.
   6. Mova os primers e sonda alíquotas do frigorífico para a área de pré-amplificação, evitando a exposição a luz excessiva para minimizar a fotodegradação.
   7. Adicionar 27.3 ul de cada um dos 10 uM para a frente e iniciadores (2,1 ul por iniciador por reacção) para a mistura principal de inverter.
   8. Adicionar 7,8 uL de HIV-1 de sonda de ADN marcada com HEX 10 uM (0,6 ul por reacção) para a mistura principal.
   9. Retorno primers e sonda para armazenamento.
3. Igualando o layout da placa descrito na Seção 1.2, coloque 1 pellet enzima em cada um dos tubos mais à esquerda e um pellet enzima em cada um dos cinco tubos de extrema-direita de 2 low-rise 8 bem-tiras de tubos PCR.
4. Adiciona-se cuidadosamente 37,5 uL de mistura de base para cada tubo contendo um sedimento enzima, utilizando uma nova ponta de pipeta para cada tubo e agitou-se suavemente a mistura principal e o sedimento com a ponta até o pelete estar completamente dissolvido. Mexa delicadamente para evitar formati bolhana, e remover a ponta com cuidado para evitar qualquer perda de volume de reacção.
5. Depois de todas as pelotas de enzimas foram reidratadas com a mistura principal, recuperar o bloco de 96 poços frio de 4 ° C de armazenamento. Coloque as tiras de tubos PCR no bloco frio para esfriar a mistura principal.
6. Enquanto a mistura principal está esfriando, carregar o software termociclador com o protocolo e placa descrito na Seção 1.
7. Corte 2 tiras de adesivo micro-selo plástico transparente para ser um pouco mais largo do que os tubos de PCR, e recuperar dois planos de PCR tampas tira tubo.
8. Recuperar 6 aliquotas modelo de armazenamento (contendo 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^{3, 4} ou 10 cópias de HIV-1 de plasmídeo por microlitro).
9. Adicionam-se 10 ul de cada molde para os tubos designados para que a concentração do modelo. Utilize uma nova ponta de pipeta para cada tubo, mexendo suavemente a solução com a ponta para misturar o mix mestre e modelo. Certifique-se de adicionar o modelo para o local correto para match o layout da placa descrito na Seção 1.2.
10. Certifique-se de que um adaptador de bandas para tubos PCR para o microcentrifuge está no lugar.
11. Dispensar 2,5 ul de acetato de magnésio em cada tubo de tampa que vai ser colocado num tubo de reacção contendo um qRPA.
12. Suavemente colocar as tampas no topo dos tubos de PCR de tal modo que eles não são totalmente fechados e podem ser removidos. O acetato de magnésio vão aderir às tampas e ser claramente visível a partir de cima.
13. Insira cada tira tubo PCR com tampas em cada lado do suporte do tubo da PCR. Fechar a tampa do minifuge para girar o acetato de magnésio para fora das tampas e para a reacção RPA, iniciando a reacção RPA. Centrifuga-se até que todas as bolhas são eliminados e todo o líquido é recolhido na parte inferior de cada tubo (cerca de 10 sec).
14. Remover rapidamente as tiras de tubos PCR e devolvê-los ao bloco fria para interromper as reações qRPA.
15. Retire cuidadosamente as tampas para evitar a formação de aerossóis e selar cada tira tubo PCR com o cortepedaços de filme micro-selo transparente.
16. Andar rapidamente para o termociclador e carregar as duas tiras de tubos de PCR no ciclizador térmico nos locais correspondentes a disposição da placa (poços A1-B8). Feche a tampa do termociclador, clique em "Start Run", e designar um nome de arquivo para o experimento.
    NOTA: Embora o fabricante recomenda a agitação da amostra após 5 min de incubação, este passo não é necessário para este ensaio particular e pode ser omitido.
17. Após a corrida for concluída, selecione "Configurações", "base de referência", "nenhuma linha de base Subtração" para exibir os dados de fluorescência-primas. Exportar os dados para um programa de planilha selecionando "Exportar", "Exportar todas as Fichas de dados para o Excel." Um arquivo com a adenda "Resultados Quantificação de amplificação" será criado contendo os dados de fluorescência em tempo real matérias.

4. Desenvolver um controlo positivo interno

1. Seleccionar uma sequência de DNA de uma espécie que é improvável que seja encontrado na amostra alvo. A sequência precisa ser mais longo do que o amplicon de alvo, de modo que a geração da sequência alvo é favorecida.
   NOTA: Para este ensaio, Cryptosporidium parvum, um parasita intestinal, foi escolhido para servir como molde para a geração da sequência de IPC porque este organismo é improvável de ser encontrado no sangue e estava disponível no laboratório a partir de um outro projecto. Para gerar a sequência de IPC, extrair e purificar ADN de C. oocistos de Cryptosporidium parvum, tal como descrito noutro local ^18.
2. Adquira o para a frente (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') e para trás (5'CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA-3 ') iniciadores a partir de fontes comerciais. Os iniciadores de PCR IPC utilizados neste ensaio são mostrados na Figura 1 e contém uma região que é complementar ao molde IPC DNA (por exemplo, C. parvum, roxo na Figura 1) e uma região que é complementar para o organismo alvo (por exemplo, HIV-1, azul na Figura 1).
3. Executar PCR usando os iniciadores e o ADN molde IPC.
   1. Montar 50 reacções de PCR ul usando os reagentes Phusion-polimerase de alta fidelidade de ADN de acordo com as instruções do fabricante, excepto a polimerase. Utilizar 2 ul de molde de ADN e tampão de Phusion HF.
   2. Adicionar a polimerase Phusion para cada reacção após um arranque a quente a 98 ° C, seguido por 60 segundos a 98 ° C, seguido de 40 ciclos de 15 seg a 98 ° C, 30 seg a 62 ° C, e 30 seg a 72 ° C, com uma extensão final a 72 ° C durante 5 min. Depois de ciclos térmicos, mantenha as amostras a 4 ° C.
   3. Analisar as amostras por electroforese em gel num gel de 2% de agarose TAE, e, em seguida, extrair e purificar ADN, utilizando o Kit de extracção de Gel QIAquick de acordo com o protocolo incluído no microcentrífugao kit.
4. Peneirar os candidatos do IPC para a sua capacidade de amplificar usando qRPA.
   1. Prepare reações qRPA conforme descrito na Seção 3, usando HIV-1 primers, uma sonda marcada com FAM específicas para o IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A-3 '), e um total de 0, 10, 10, ^2, 10 ^3, 10 ^{4, 5} ou 10 cópias de cada candidato IPC por reação, testando todas as concentrações em duplicado.
   2. Escolha o candidato IPC que amplifica mais consistente e tem o menor limite-de-detecção.
5. Co-amplificação de HIV-1 e o IPC para determinar a concentração óptima de ADN IPC.
   1. Semelhante a Seção 3, combinar o seguinte em cada reacção de 50 ul: 29,5 mL de tampão de reidratação, 2,1 l de RPA de primer para a frente [10 mM], 2.1 l de RPA primário [10]? M reverso, 0,6 l de HIV-1 HEX sonda marcada com [10? M], 10 uldo HIV-1 de ADN a concentrações variáveis, 2,5 ul de acetato de magnésio, e um sedimento enzima. Em vez de adicionar 3,2 mL de água livre de nuclease como foi feito no passo 3.2.4, adicionar 0,6 mL de sonda IPC FAM marcado [10 mM], e 2,6 l de DNA IPC. Utilizar a concentração do IPC é que a detecção limite-de-(LOD) quando qRPA é realizada com ADN IPC sozinho (LOD definido como a concentração mais baixa, onde a quantidade de geração do sinal de fluorescência é maior do que a gerada pela fluorescência gerada pelas amostras com nenhum alvo DNA).
   2. Incubam-se as amostras utilizando o protocolo descrito na secção 1.1.
   3. Se o IPC não amplificar em cada amostra, considere repetindo o ensaio com uma concentração de IPC de uma ordem de grandeza mais elevada. A concentração óptima de ADN IPC para o ensaio de HIV-1 é de 10.000 cópias / mL. Embora as amostras são considerados válidos se há ou IPC ou o HIV-1 de amplificação de DNA, idealmente o IPC exibe amplificação detectável durantecada reacção.

5. Construir uma curva padrão a partir de experiências múltiplas

1. Verifique se os dados para cada experimento foi exportado para um programa de planilha, como descrito na Seção 3.13.
2. Abrir e executar o script "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Todas as entradas são automaticamente solicitado na janela de comando. Depois que o script é iniciado, o usuário é automaticamente solicitado para designar o "Número de arquivos de dados", utilizado para construir a curva padrão.
3. Na janela de comando, digite o número de arquivos a ser utilizado para a construção da curva padrão e pressione enter.
4. Escreva na janela de comando o número de amostras e do número de repetições em cada arquivo de treinamento (pressionando Enter após cada entrada).
   NOTA: No layout placa descrito na Seção 1.2, houve 6 amostras com diferentes concentrações e duas repetições de cada amostra).
5. Escreva na janela de comando o menor DNA concentração utilizada para construir a curva padrão (em log10 cópias) e pressione Enter (para o layout da placa descrito na Seção 1.2, a concentração de modelo menor é 'um' log 10 cópias).
6. Tipo na janela de comando a diferença de concentração entre cada padrão (em log10 cópias), em seguida, pressione enter (para o layout da placa descrito na Seção 1.2, o intervalo de concentração é 'um' log 10 cópias).
7. Depois de ser solicitado, digite o "limiar Slope" na janela de comando e pressione Enter.
8. Na janela de comando, digite o "Number (z) desvios padrão acima da de fundo para limiar positivo", e, em seguida, pressione enter. Os valores típicos para z gama de 1 a 5.
9. Especifique se os dados foram coletados utilizando o termociclador ('1'), * .tiff imagens de microscópio ('2'), ou * .jpg imagens de microscópio ('3'), digitando o número "1", "2", ou '3', e pressing entrar.
10. Escolha para definir um novo limiar IPC ou para usar um valor padrão para o limiar digitando 'y' ou 'n', respectivamente, quando solicitado.
11. Em seguida, selecione cada um dos arquivos de planilhas utilizadas para construir a curva padrão.
    NOTA: O script irá, em seguida, importar automaticamente os dados HEX e FAM fluorescência; determinar se cada reação foi válido (ou seja, se os sinais de fluorescência excedeu os limites para o HEX ou canais FAM); determinar o coeficiente r ² por um exponencial, linear, e de segunda ordem ajuste polinomial; plot "log10 cópias em relação ao limiar de ciclo" para cada amostra utilizada para a construção da curva padrão; e criar um arquivo de planilha contendo variáveis ​​essenciais para reconstruir a curva padrão para experimentos de validação sem que o usuário precise digitar novamente todos os parâmetros de entrada novamente.

6. Ensaio de Validação e quantificação de amostras desconhecidas Usandoa curva padrão

1. Use o script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" para estimar a precisão e exatidão do ensaio usando amostras com concentrações conhecidas ou usá-lo para quantificar amostras com concentrações desconhecidas.
   Nota: Como a pesquisa publicada anteriormente mostrou que um ajuste exponencial rendeu o melhor coeficiente de r-quadrado ^18, este script utiliza um ajuste exponencial para a curva padrão. Se um tipo diferente de ajuste é desejado, o script pode ser modificado em conformidade.
   1. Abrir e executar o script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Depois que o script é iniciada, o usuário é automaticamente solicitado a inserir todas as entradas para a janela de comando.
   2. Enter "1" para validar um ensaio utilizando uma curva padrão com concentrações conhecidas de amostra ou entrar '2' para quantificar as amostras desconhecidas.
   3. Quando solicitado, ou selecionar uma curva padrão salvo ou construir um novo, inserindo thinformação e que é automaticamente solicitado na janela de comando (a mesma informação que é necessária para o script "JoVE_qRPA_standard_curve.m" da Seção 5).
   4. Digite o número de experimentos (ou seja, arquivos de planilhas) para analisar a validação / quantificação.

7. Preparação para a Coleta de Dados Utilizando um microscópio de fluorescência e um Chip aquecida

1. Certifique-se de um microscópio de fluorescência tem um aquecedor palco e controlador de temperatura 1-Channel Precision alta Estabilidade no lugar.
2. Certifique-se de um microscópio de fluorescência tem um cubo de filtro para excitar e recolher fluorescência de cada fluoróforo. Excite e recolher a fluorescência FAM gerado durante a amplificação de DNA IPC através de um filtro GFP (excitação BP 470/40 nm, emissão BP 520/50 nm). Excitar e recolher a fluorescência HEX gerado durante o HIV-1 de amplificação de DNA através de um filtro HEX (excitação BP 530/30 nm, emissão BP 575/40 nm).
3. Use o microscópio software de edição de script para criar um algoritmo automatizado para replicar de coleta de dados sobre o termociclador.
   1. Primeiro inserir um "Settings" passo para fechar o obturador. Em seguida adicione uma "Exposição" passo para definir a exposição de 60 seg. Insira um "Snap" para executar o atraso de 60 segundos, que implementa o período de pré-incubação de 1 min. Adicionar um "ajuste" passo para mudar o grupo de trabalho para o filtro de GFP. Insira outro "Exposição" passo para ajustar a exposição para 200 ms. Todas as exposições que utilizam o GFP ou os filtros de cubos HEX será ajustada para 200 mseg.
   2. Após a etapa de "Exposição", adicione um "Snap" e especificar a câmera com a qual a imagem será capturada. Use outro "Definição" passo para fechar o obturador e um "Salvar imagem" passo para salvar a imagem para uma pasta temporária definida pelo usuário.
   3. Próxima mudança para o cubo filtro HEX usando outro "Configuração" passo e then adicionar uma "Exposição" em 200 ms, um "Snap," e um "Salvar imagem" passo.
   4. Repita esse processo 59 vezes com um atraso inicial de 20 segundos em vez de 60 (perto do obturador, espere 20 segundos, mude para cubo filtro GFP, uma exposição de 200 ms, pressão, perto do obturador, salvar, mude para o cubo filtro HEX, exposição definido para 200 ms, SNAP).
4. Criar um chip que vai realizar reações qRPA.
   1. Para experimentos usando o microscópio, use o arquivo JoVE_qRPA_base.ai para cortar uma base retangular de 40 x 15 mm a partir de uma folha de 1/8 "acrílico preto grosso usando um cortador de laser ajustada ao poder de 100%, velocidade de 10%.
   2. Use o arquivo JoVE_qRPA_well.ai cortar reação bem constituído por um quadrado de 10 x 10 mm, com um diâmetro do furo circular corte de 5 mm a partir de uma folha de 1,5 mm de espessura de acrílico transparente.
   3. Anexar até três poços a uma única base usando gel supercola.
   4. Overnight seco.

8. Coleta de Dados e Analysis Usando um microscópio de fluorescência

1. Prepare o microscópio para a coleta de dados através do carregamento do script automático de coleta de dados JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. Definir o aquecedor palco para 48 ° C e pré-aquecer o chip reação no aquecedor palco por cerca de 20 min. Um ajuste de temperatura de 48 ° C, mantém uma temperatura de 39 ° C na cavidade de reacção (dados não apresentados).
   2. Utilizando uma objectiva 10X de NA, 0,45, concentrar-se no topo do bordo interior da câmara de reacção com o filtro de GFP no local. As arestas de acrílico são autofluorescente após o corte a laser, podem ser facilmente visualizado. Depois de se concentrar, não ajuste a altura do estágio do microscópio até que todos os dados são coletados.
2. Montar o master mix qRPA numa área de trabalho pré-amplificação designada como descrito no passo 4.5.1. Para cada amostra, misturar uma pelota de enzima, a mistura principal, e do HIV-1 DNA molde em um tubo de microcentrífuga. Adicionar 2,5 mL de acetato de magnésio para o primeiro reaction e brevemente vórtex.
3. Transportar rapidamente o tubo de microcentrífuga contendo a amostra qRPA para o microscópio de fluorescência.
   1. Pipetagem cuidadosa de 30 ul da reacção para a reacção RPA bem sem a criação de bolhas. Colocar uma gota de óleo mineral de grau de PCR através da reacção de APR para evitar a evaporação.
   2. Posicione o bem diretamente abaixo da objetiva do microscópio, tendo o cuidado de imagem apenas o centro do poço, não qualquer uma das extremidades de acrílico auto-fluorescente. Depois do bem está posicionada, execute o script automático 7. O script gera uma imagem JPEG usando o uma imagem JPEG usando o cubo filtro HEX cada 20 seg cubo e filtro FAM.
4. Depois que o script for concluído, transferir essas imagens para fora da pasta de armazenamento temporário antes de executar amostras adicionais.
   1. Criar pastas 2: 1 para cada fluoróforo (isto é, 'HEX "e" FAM "). Guarde as duas pastas na mesma pasta pai. Em cada fluoróforopasta, criar uma pasta identificada com o número de cópias de DNA presentes na amostra (por exemplo, 0, 10, etc).
   2. Transferir todos os arquivos com o prefixo 'HEX' para a subpasta correspondente na pasta 'HEX'. Transferir todos os arquivos com o prefixo 'GFP' para a subpasta correspondente na pasta 'FAM'.
5. Repetir secções 8,2-8,4 para reacções qRPA com 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^{4, 5} e 10 cópias de HIV-1 de ADN.
6. Após a coleta dos dados para todas as amostras qRPA em um experimento, carregue o script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Quando solicitado pelo script, selecione a pasta pai que contém as duas pastas fluoróforo, que por sua vez contêm as imagens para cada concentração em subpastas.
   NOTA: O script irá gerar automaticamente um arquivo de planilha no diretório pai no qual os dados HEX fluorescentes podem ser salvos em um nam folhaed 'HEX', e os dados de fluorescência FAM será salvo em uma folha com o nome 'FAM'. Em cada folha, o número do ciclo está listado na coluna B, e os dados de fluorescência em tempo real para o aumento das concentrações de molde são dadas em colunas C, D, etc. Cada dado de fluorescência em tempo real, é a intensidade média de fluorescência da imagem capturada pelo que ponto de tempo.
7. Use a função de gráfico de dispersão padrão no programa de planilhas para traçar as células B2: H61 da 'HEX' e folhas 'FAM' para visualizar fluorescência em tempo real e gerar gráficos semelhantes aos de Figuras 2A, 2B, 3A, 3B e.
   NOTA: A folha de cálculo gerado na etapa 8.6, também podem ser utilizados nos scripts "JoVE_qRPA_standard_curve.m" e "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Representative Results

Discussion

A fim de obter dados de quantificação significativas usando o algoritmo MATLAB, o usuário deve selecionar os valores de entrada apropriados quando solicitado. Depois de iniciar cada script nos pontos 5 e 6, todas as variáveis ​​de entrada são automaticamente solicitado na janela de comandos e saídas são gerados automaticamente. Na Seção 5.7 o usuário é solicitado a selecionar um limite de inclinação. O valor do limiar de inclinação afecta o quadrado do coeficiente de correlação ^(r2) do encaixe. Ao usar dados de fluorescência matérias exportadas de um termociclador, valores entre 2,0 e 5,0 tendem a produzir um alto coeficiente r ^2. Na Seção 5.8, o usuário deve designar o número de desvios padrão acima do fundo para definir o limite positivo. Para marcar uma amostra de como positivo ou negativo, o script determina automaticamente a _amostra diferença Δ entre o máximo eo mínimo de fluorescência para cada amostra usando os dados de fluorescência-primas exportadas do Thermal reciclador. Ele calcula a diferença média Δ _fundo e padrão σ _fundo desvio para amostras de controle de todos os não-alvo. Uma amostra é considerada positiva se a _amostra Δ é mais do que z × _fundo σ acima Δ _fundo. No ponto 5.10 do usuário decide se quer usar o limite padrão ou definir um novo limite. Se o utilizador desejar definir um novo limiar, o novo limiar determinar experimentalmente através da realização de 3 experiências cada um contendo 12 Reacções RPA sem qualquer VIH-1 ADN presente. Definir o limite no aumento médio de intensidade de fluorescência a partir desses experimentos, mais 3 desvios-padrão. Depois de completar a Seção 6, o script JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m retorna automaticamente a concentração de DNA estimado para cada reação qRPA (em log 10 cópias). Se o script determina que nenhum ADN do VIH-1 estava presente na amostra, a concentração estimada está listado como "Negative para HIV "ou" inválido ", dependendo se o sinal de fluorescência para o controlo positivo interno excedido o limiar (z × _fundo σ + Δ _fundo). Se o utilizador está a validar a curva padrão com concentrações conhecidas de exemplo, o script também irá retornar uma tabela adicional semelhante à da Tabela 1.

A fim de desenvolver um ensaio de RPA em tempo real que proporciona a quantificação exacta, consistência experimental é crucial. Por exemplo, usar os mesmos iniciadores e sonda alíquotas para tanto a curva padrão e por ensaios de validação. Também evitar ciclos de congelamento-descongelamento, armazenando os iniciadores e sonda alíquotas a 4 ° C entre experiências em vez de -20 ° C. As alíquotas de modelo usados ​​para as experiências de curva padrão e de validação são armazenados da mesma forma. Pelotas de enzimas RPA e reagentes do mesmo lote são utilizados de acordo com as recomendações do fabricante. Por último, becausar RPA carece de verdadeiros "ciclos" de controlar com precisão a taxa de amplificação, padronização das etapas de usuário é absolutamente imperativo. Quando a montagem de reacções, o utilizador tem sempre os mesmos passos, na mesma ordem, gastando aproximadamente a mesma quantidade de tempo em cada passo. Reações deve sempre ser misturado delicadamente com uma nova ponteira, e bolhas sempre deve ser eliminada. Antes de amplificação, as reações devem ser mantidos a uma temperatura constante, e o termociclador ou software microscópio deve sempre estar preparado antes de colocar as reações de evitar qualquer amplificação em temperaturas sub-óptima que poderiam influenciar a quantificação. Qualquer variação nas condições de reação inicial pode levar a inconsistência nos resultados experimentais.

Ao usar um microscópio para coletar dados, variáveis ​​adicionais devem ser controladas para minimizar a variação na intensidade de fluorescência. Todas as reacções devem ser colocados na mesma região mais quente no estágio, e a microscope deve ser focado na mesma região do poço para cada amostra. Mesmo que essas práticas são seguidas, dados de fluorescência coletados em um microscópio pode apresentar variabilidade devido a manchas brilhantes locais que formam naturalmente durante as reações RPA, a formação de bolhas dentro das câmaras de reação, ou fotodegradação resultantes da exposição repetida à luz de excitação. A influência destas variáveis ​​é evidente nos dados de fluorescência obtidos no microscópio (Figuras 4A e 4B), os quais demonstram a variabilidade da linha de base, picos e depressões. Estas características estão ausentes a partir dos dados de fluorescência obtidos no termociclador (Figuras 3A e 3B). Em última análise, a coleta de dados sobre o microscópio é apenas para fins de prova de princípio e o ensaio final será implementado em um leitor de fluorescência operável-campo com geometria mais precisa e controle de software que minimiza essas variáveis.

Outra importanteaspectos do processo de desenvolvimento do ensaio qRPA é a consistência no processamento de dados. O protocolo descrito na seção de métodos utiliza scripts para processar dados de fluorescência em bruto (armazenados em um arquivo de planilha), coletados a partir de um termociclador ou microscópio. Todos os experimentos utilizados para construir a curva padrão deve ser formatado de forma idêntica. Quando se usa um termociclador para recolher dados, a mesma disposição da placa deve ser usado, e os dados a partir de poços que não contêm reacções RPA não deve ser exportado. Quando se utiliza um microscópio para recolher dados, o formato dos dados deve corresponder ao formato dos dados exportados automaticamente do termociclador. Por exemplo, os dados de controlo não-alvo deve ser em células C2: C61, e os dados para o aumento das concentrações da máscara deve estar presente nas células D2: D61, E2: E61, etc. Se houver várias repetições de cada concentração em uma experiência, a série de diluição ^2ª replicar devem ser encomendados esquerda para a direita de nenhum controle de destino (NTC) a maior concentração esalvo nas colunas imediatamente à direita ^do 1º replicar uma série de diluição. Por exemplo, no layout de placa utilizada na Seção 1.2 com duas repetições para cada amostra, os dados de fluorescência do 1º réplica de cada amostra da série de diluição deve ser guardado nas células C2: dados H61 e de fluorescência para a segunda réplica de cada amostra em a série de diluição deve ser guardado em células I2: N61. Para o layout da placa usada na Seção 1.2, esta é a formatação quando a exportação de dados do software termociclador para uma planilha padrão.

Os dados representativos fornecidos a partir de experiências de HIV-1 qRPA demonstrar suporte de prova de conceito de que a APR pode ser utilizada para a quantificação da concentração de ácido nucleico em amostras desconhecidas. Testes de HIV-1 clinicamente úteis de carga viral tem um intervalo clínico de pelo menos 4 ordens de grandeza, uma precisão de 0,5 log 10 cópias, e um limite de detecção de-de, pelo menos, 200 cópias ^19,20. O ensaio de DNA HIV-1 descrito atende a esses criteria e é mais precisa em baixas concentrações, como mostrado na Tabela 1. Por conseguinte, com a inclusão de um passo de transcriptase reversa, estes resultados sugerem que um ensaio de HIV-1 RT-APR pode ter o potencial para medir o HIV-1 na carga viral amostras clínicas. Ao desenvolver um ensaio qRPA, ajustando os parâmetros de algoritmo pode ajustar a gama dinâmica sensibilidade e linear, dependendo das necessidades clínicas. A Figura 6 mostra que o ajuste z (um parâmetro que determina o limiar de amostras positivas) pode influenciar a sensibilidade e precisão no de baixa e alta concentrações alvo. Além disso, pode ser possível aumentar a resolução e precisão da quantificação através da incubação de reacções a uma temperatura mais baixa ou menos utilizando acetato de magnésio, diminuindo desse modo a taxa de amplificação.

Esta prova de conceito qRPA ensaio pode ser utilizado para quantificar a concentração de amostras contendo ADN de HIV-1. O ensaio descrito no presente qRPA manuscript inclui instruções detalhadas sobre como montar reações RPA em tempo real, desenvolver e pesquisar uma IPC, e processar dados de fluorescência-primas para a construção de uma curva padrão que pode ser usado para quantificar amostras desconhecidas. Com as instruções detalhadas incluídos, este protocolo pode ser adaptado para quantificar a concentração de ADN numa ampla variedade de amostras.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI