Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

Resumo

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Resumo

Recentemente, foi demonstrado que a amplificação da polimerase recombinase (RPA), uma plataforma de amplificação isotérmica para detecção de patógenos, pode ser usada para quantificar a concentração de amostras de DNA usando uma curva padrão. Neste manuscrito, é fornecido um protocolo detalhado para desenvolver e implementar um ensaio de amplificação da polimerase recombinase quantitativa em tempo real (ensaio qRPA). Usando a quantificação do DNA do HIV-1 como exemplo, a montagem de reações de RPA em tempo real, o design de uma sequência de controle positivo interno (IPC) e a co-amplificação do IPC e do alvo de interesse são todos descritos. São fornecidas instruções e scripts de processamento de dados para a construção de uma curva padrão usando dados de vários experimentos, que podem ser usados para prever a concentração de amostras desconhecidas ou avaliar o desempenho do ensaio. Finalmente, é descrito um método alternativo para coletar dados de fluorescência em tempo real com um microscópio e um aquecedor de platina como um passo para o desenvolvimento de um ensaio qRPA no local de atendimento. O protocolo e os scripts fornecidos podem ser usados para o desenvolvimento de um ensaio qRPA para qualquer alvo de DNA de interesse.

Introdução

Quantitativo de amplificação de ácido nucleico é uma técnica importante para a detecção do meio ambiente, de origem alimentar, e agentes patogénicos de origem da água, bem como para diagnósticos clínicos. Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é o método padrão de ouro para a detecção sensível, específico, e quantitativa de ácidos nucleicos, por exemplo, para o HIV-1 de teste de carga virai, a detecção de agentes patogénicos bacterianos, e rastreio para muitos outros organismos ^{1 - 3.} Durante qPCR em tempo real, os iniciadores de amplificação de ADN patógeno em ciclos, e um sinal de fluorescência que é gerada é propor....

Protocolo

1. Programe o termociclador em tempo real Reações qRPA

1. Criar um novo protocolo no software termociclador.
   1. Inserir um passo de pré-incubação: 39 ° C durante 1 min.
   2. Adicionar uma segunda etapa: 39 ° C durante 20 segundos seguido por uma placa de leitura.
   3. Finalmente, insira um "ir para" que se repete a segunda etapa 59 vezes mais.
   4. Salve o protocolo.
2. Criar uma nova placa na guia "editor placa" do software. Escolha poços na placa correspondentes às localizações das reacções RPA (aqui, o uso de poços A1, A4-A8, B1 e B4-B8).
   NOTA: Não é importante se o tipo de amostra dos poços (por exemplo,

Resultados

Antes de escolher uma sequência para servir como o IPC em experiências com qRPA alvo (HIV-1) de ADN, de controlo positivo interno (IPC) candidatos são gerados e rastreados quanto à sua capacidade para amplificar em reacções qRPA sem VIH-1 ADN presente. Candidatos IPC são mais longos do que o alvo (HIV-1) para impedir a formação de ADN de IPC competindo com o HIV-1 formação de amplicão. Como mostrado na Figura 2A, a geração de duas C. candidatos parvum IPC foi verificada pela presença d.......

Discussão

A fim de obter dados de quantificação significativas usando o algoritmo MATLAB, o usuário deve selecionar os valores de entrada apropriados quando solicitado. Depois de iniciar cada script nos pontos 5 e 6, todas as variáveis ​​de entrada são automaticamente solicitado na janela de comandos e saídas são gerados automaticamente. Na Seção 5.7 o usuário é solicitado a selecionar um limite de inclinação. O valor do limiar de inclinação afecta o quadrado do coeficiente de correlação ^(r2) do encaixe. Ao usar dados .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			qRPA
HIV-1 primer avançado	Tecnologias de DNA integradas	oligos de DNA personalizados	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'
Oligos feitos sob encomenda	ADN das tecnologias integradas do ADN das tecnologias	VIH-1	CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 '
Sonda HIV-1	BioSearch Technologies	oligos de DNA personalizados	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'
Sonda IPC	BioSearch Technologies	oligos de DNA personalizados	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
Reagentes exo RPA (pellets, tampão de reidratação, acetato de magnésio	TwistDx	TwistAmp exo
Tiras de tubo PCR	BioRad	TLS0801
PCR tiras de tubo de tampa plana	BioRad	TCS0803
Adesivo Micro-selo	BioRad	558/MJ
Alvo do HIV-1 (pHIV-IRES- eYFPΔ EnvΔ VifΔ Vpr)			plasmídeo personalizado, ver: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caracterização e detecção de lentivírus competente para replicação artificial de gama de hospedeiros alterada. Terapia Molecular 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
O ADN genómico masculino humano	aplicou Biosystems	360486
o frio-bloco de 96 poços	Cole Parmer	EW-36700-48
Termociclador	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tampão de Tris 1,0 M, pH 8,0	EMD Millipore	648314
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Promega	V4321
Água livre de nuclease	Ambion	AM9937
IPC Desenvolvimento
Cryptosporidium parvum Modelo IPC	Waterborne Inc	P102C	Também é possível solicitar um alvo sintético de fita dupla da IDT se o usuário não estiver equipado para trabalhar com C. parvum (um agente infeccioso BSL-2). Os primers PCR e RPA para C. parvum foram projetados usando o número de acesso GenBank AF115377.1
PCR long forward primer	DNA Technologies	oligos de DNA personalizados	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
PCR longo reverso primer	DNA Technologies	personalizado DNA oligos	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion High-Fidelty DNA Polimerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma	Aldrich A9539
Microscópio Experimentos
Microscópio de fluorescência vertical	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Aquecedor de palco	Ferramentas de biociência	TC-GSH
1 canal Precisão Controlador de temperatura de alta estabilidade	Ferramentas de biociência	TC-1100S
FAM / GFP cubo de filtro	Zeiss	conjunto de filtros 38 (000000-1031-346)	excitação BP 470/40 nm, emissão BP 520/50 nm
cubo de filtro HEX	Chroma	49014	excitação BP 530/30 nm, emissão BP 575/40 nm
Cortador a laser	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" acrílico preto	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm acrílico transparente	McMaster Carr	PD-72268940
Super cola	Office Depot	Duro super cola
Óleo mineral de grau PCR	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Análise de
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB MATLAB
script MATLAB: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"	Incluído no script SI
MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	Incluído no script SI
MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	Incluído no SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Incluído no SI
JoVE_qRPA_base.ai	Incluído no SI
Software AxioVision	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Incluído no SI

Ensaio 5' do do - Integrated Integrated Kit de extração de gel Dados