Bioativa de Prussian Blue Nanopartículas para Multimodal Imagem Molecular Applications

Resumo

Este protocolo descreve a síntese de nanopartículas biofuncionalizadas de azul da Prússia e seu uso como agentes de imagem molecular multimodais. As nanopartículas têm um design de núcleo-casca onde os íons de gadolínio ou manganês dentro do núcleo da nanopartícula geram contraste de ressonância magnética. O invólucro biofuncional contém fluoróforos para imagens de fluorescência e ligantes de direcionamento para direcionamento molecular.

Resumo

Multimodal, imagiologia molecular permite a visualização de processos biológicos em resoluções celulares, subcelulares, e em nível molecular, utilizando várias técnicas de imagem, complementares. Esses agentes de imagiologia facilitar a avaliação em tempo real das vias e mecanismos in vivo, o que aumenta tanto a eficácia de diagnóstico e terapêutico. Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) - uma nova classe de agentes para a utilização em aplicações de imagem molecular multimodais. As modalidades de imagem incorporados no nanopartículas, imagens de fluorescência e imagem por ressonância magnética (MRI), têm características complementares. As NPs PB possui um desenho de núcleo-invólucro que o gadolínio e iões de manganês incorporados dentro dos espaços intersticiais do retículo PB gerar contraste para IRM, tanto em T ₁ e T ₂ sequências ponderadas. Os PB NPs são revestidas com avidina fluorescente usando eletrostática auto-comotagem, o que permite imagens de fluorescência. As nanopartículas revestidas com avidina são modificados com ligandos biotinilados que conferem capacidades de segmentação moleculares para as nanopartículas. A estabilidade e a toxicidade das nanopartículas são medidos, bem como os seus relaxividades MRI. Os recursos de imagens multimodais, moleculares destas PB NPs bioativa são então demonstrada, utilizando-os para imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular in vitro.

Introdução

A imagem molecular é a visualização não invasiva e direcionada de processos biológicos no celular, subcelular e níveis moleculares ^1. A imagem molecular permite um espécime a permanecer no seu microambiente nativa, enquanto as suas vias e mecanismos endógenos são avaliados em tempo real. Tipicamente, imagiologia molecular envolve a administração de um agente de imagiologia exógeno sob a forma de uma molécula pequena, macromolécula, ou nanopartículas para visualizar, alvo, e rastrear processos fisiológicos relevantes serem estudados ^2. As diversas modalidades de imagem que foram exploradas em imagem molecular incluem MRI, CT, PET, SPECT, ultra-som, photoacoustics, espectroscopia Raman, bioluminescência, fluorescência e microscopia intravital ^3. Imagiologia multimodal é a combinação de dois ou mais modalidades de imagem em que a combinação aumenta a capacidade de visualizar e caracterizar vários processos e eventos biológicos ^4. Multimodal imaging explora os pontos fortes das técnicas de imagem individuais, enquanto compensar suas limitações individuais ^3.

Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) - uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares. Os PB NPs são utilizados para geração de imagens de fluorescência e MRI molecular. OP é um pigmento que consiste de ferro (II) e (III) átomos de ferro alterno numa rede cúbica de face centrada (Figura 1). A estrutura é composta de PB ligandos lineares de cianeto de uma liga de Fe ^II - CN - Fe ^III ligação que incorpora catiões para equilibrar cargas da sua rede tridimensional ^5. A capacidade de PB para incorporar cátions em sua estrutura é explorada por carregar separadamente gadolínio e manganês nas NPs PB para o contraste de ressonância magnética.

A justificativa para perseguir um projeto de nanopartículas para o contraste MRI é por causa deas vantagens deste projeto oferece em relação a agentes de contraste MRI atuais. A grande maioria dos agentes de contraste de MRI e aprovado pelo FDA dos EUA são o gadolínio que são paramagnética na natureza e oferecem contraste positivo pelo spin-estrutura mecanismo de relaxamento ^6,7,8. Em comparação com um único gadolínio-quelato que proporciona uma baixa intensidade de sinal por si só, a incorporação de vários iões gadolínio dentro da estrutura PB das nanopartículas proporciona uma maior intensidade de sinal (contraste positivo) ^3,9. Além disso, a presença de vários iões gadolínio dentro da rede PB aumenta a densidade geral de rotação e a magnitude do paramagnetismo das nanoparticulas, o que perturba o campo magnético local na sua vizinhança, gerando assim contraste negativo pelo mecanismo de relaxação spin-spin. Assim, as nanopartículas contendo gadolínio funcionar tanto como _um T (positivo) e T ₂ (agentes de contraste negativo) ^10,11.

Num subgrupo de pacientes com insuficiência renal, a administração de agentes de contraste à base de gadolínio tem sido associada ao desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica ^{8,12, 13.} Esta observação levou a investigações sobre a utilização de iões paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por conseguinte, o desenho versátil das nanopartículas está adaptado para incorporar os iões de manganês dentro da rede PB. Semelhante a quelatos de gadolínio, manganês quelatos também são paramagnéticos e são normalmente utilizados para proporcionar a intensidade de sinal positivo em MRI ^7,14. Tal como acontece com gadolínicos PB PN, os contendo manganês PB PN também funcionar como _um T (positivo) e T _2, os agentes de contraste (negativo).

Para incorporar capacidades de imagem de fluorescência, as nanopartículas "núcleos" são revestidas com um invólucro "biofuncional" consistindo de avidina marcada fluorescentemente-glicoproteína (Figura 1). Avidina não apenas permite imagens de fluorescência, mas também serve como uma plataforma de acoplagem para ligandos biotinilados que alvejam as células e tecidos específicos. A ligação de avidina-biotina é uma das mais fortes conhecidas, ligações não-covalentes caracterizados por afinidade de ligação extremamente forte entre a avidina e a biotina ^15. A fixação de ligantes bioestanhados ao revestida com avidina PB NPs confere capacidades de segmentação moleculares para os PN PB.

A motivação para a prossecução de fluorescência e imagem latente usando PB NPs é porque estas modalidades de imagem possuem características complementares. Imagens de fluorescência é uma das técnicas de imagem molecular ópticos mais utilizado, e permite a visualização simultânea de vários objetos em altas sensibilidades ^1,16,17. Imagens de fluorescência é um cofre, modalidade não-invasivo, mas está associada a baixos profundidades de penetração e resoluções espaciais ^1,3,16. Por outro lado, a RM gera uma alta temporaisd resolução espacial de forma não invasiva e sem a necessidade de radiação ionizante ^1,3,16. No entanto MRI sofre de baixa sensibilidade. Portanto imagens de fluorescência e RM foram selecionados como as técnicas de imagem molecular, devido às suas características complementares de penetração em profundidade, sensibilidade e resolução espacial.

Este artigo apresenta o protocolo para a síntese e biofunctionalization das NPs PB, PB PN (GdPB), e contendo gadolínio PB PN (MnPB) ^10,11 contendo manganês. Os seguintes métodos são descritos: 1) de medição de tamanho, carga, e estabilidade temporal das nanopartículas, 2) avaliação da citotoxicidade das nanopartículas, 3) de medição de relaxamentos MRI, e 4) a utilização de nanopartículas para fluorescência e ressonância magnética molecular de uma população de células alvo in vitro. Estes resultados demonstram o potencial dos PN para utilização como agentes de imagem moleculares multimodais, in vivo.

Protocolo

1. Síntese de PB NPs, GdPB e MnPB

Síntese das nanopartículas (PB NPS GdPB, ou MnPB) é conseguido através de um esquema de síntese de um pote, executando as etapas descritas a seguir:

1. Preparar solução 'A' contendo 5 ml de 5 mM de hexacianoferrato de potássio (II) em água desionizada (DI) de água. Dependendo do tipo de nanopartículas ser sintetizado - PB NPs, GdPB, ou MnPB, preparar a solução 'B' como se segue:
   1. Para PB PN: preparar 10 ml de uma solução contendo 2,5 mM de ferro (III), cloreto de água DI.
   2. Para GdPB PN: preparar 10 ml de uma solução contendo 2,5 mM de cada um de gadolínio (III) e nitrato de ferro (III), cloreto de água Dl
   3. Para MnPB PN: preparar 10 ml de uma solução contendo 2,5 mM de cada um de manganês (II) e cloreto de ferro (III), cloreto de água DI.
2. Adicionar a solução 'B' para um balão de fundo redondo, e agita-se o conteúdo do balão à temperatura ambiente (RT) e1.000 rpm. Adicionar solução 'A' gota a gota para o round-bottom frasco contendo solução de 'B'. Controlar a taxa de fluxo para a adição de solução 'A' a 'B' por uma bomba peristáltica definido para dispensar aproximadamente 10 ml / h.
3. Continuar a agitar a 1000 rpm à temperatura ambiente durante 30 minutos adicionais após a adição de solução 'A' a 'B' é completa. Pare de mexer e recolher a mistura.
4. Transferir alíquotas da mistura para tubos de microcentrífuga para enxaguar as nanopartículas isentas de componentes que não reagiram. Adicionar NaCl 5 M (0,2 ml de NaCl a mistura de reacção / ml) a cada alíquota para ajudar na recolha de partículas por centrifugação.
5. Centrifugar cada alíquota de nanopartículas durante pelo menos 10 min a 20.000 x g. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante.
6. Ressuspender cada pellet de nanopartículas em 1 ml de água DI através de ultra-sons utilizando um microtip (pulso de ultra-sons on / off = 1/1 sec, amplitude = 50%, duração =5 segundos, o poder sonicator rating = 125 W) para quebrar o sedimento.
7. Repita os passos 1,4-1,6 pelo menos 3 × para assegurar que as nanopartículas são livres de componentes da reacção e os produtos secundários da reacção inicial. Após a centrifugação final, voltar a suspender as partículas em 1 ml de água Dl.

2. Biofunctionalization de PB NPs, GdPB e MnPB

Biofunctionalization das nanopartículas envolve o revestimento das nanopartículas "núcleos" com avidina e adição de ligandos biotinilados, conforme descrito abaixo:

1. O revestimento das nanopartículas com Avidina fluorescente
   O revestimento das nanopartículas com avidina fluorescente é conseguida utilizando a auto-montagem onde electrostático de carga positiva da avidina (pI ~ 10.5) é revestido sobre a nanopartículas carregadas negativamente como se segue ^18:
   1. Prepare suspensões dos PN PB, GdPB, ou MnPB em 1 ml de água DI. Filtre Alexa Fluor 488 marcado avidina (A488; reconstituída em água DI)através de um filtro de nylon de 0,2 um microcentrífuga a 14000 × g durante 10 min. Adicionar ≤0.2 mg avidina / mg nanopartículas. Juntar as filtrada de A488 separadamente às alíquotas de PB NPs, GdPB, ou MnPB.
   2. Contactar as nanopartículas com A488 durante 2-4 horas com agitação suave ou de rotação a 4 ° C. Proteja as amostras da luz usando papel alumínio.
      NOTA: Este A488 rendimentos passo revestido PB PN (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), e MnPB (MnPB-A488).
2. Penhora de Biotinylated Antibodies
   A ligação de anticorpos biotinilados dirigidos para as nanopartículas revestidas com avidina é conseguido usando interacções avidina-biotina como se segue:
   1. Prepare as suspensões dos avidina revestido nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, e MnPB-A488 em 1 ml de água DI. Filtro de anticorpo biotinilado (tal como é fornecido pelo fabricante) de microcentrífuga através de um filtro de nylon de 0,2 um a 14000 × g durante 10 min.
      NOTA: Aqui, o presente estudo utiliza Biotinylated-anti-glial neurónio antigénio 2 (ANG2) que tem como alvo NG2 overexpressed dentro de células e tecidos do sistema nervoso central e biotinilado eotaxina-3 anti-humano (Eot3) que tem como alvo receptores sobre-expressos em linhas de células de eosinófilos ou eosinofílicos.
   2. Adicionar cada alíquota filtrado do anticorpo biotinilado separadamente para as aliquotas das nanopartículas revestidas com avidina. Adicionar ≤0.05 mg nanopartículas de anticorpos / mg avidina-revestido biotinilado. Contactar as nanopartículas revestidas com avidina com os anticorpos biotinilados (Ang 2) ou Eot3 para 2-4 horas com agitação suave ou de rotação a 4 ° C. Proteja as amostras da luz usando papel alumínio.
      NOTA: Este anticorpo rendimentos passo nanopartículas revestidas (por exemplo GdPB-A488-Eot3 e MnPB-A488-Ang2).

3. Dimensionamento, Potencial Zeta, e Temporal Estabilidade das nanopartículas

A distribuição de tamanho, carga, e a estabilidade das nanopartículas são medidos usando dinâmicoespalhamento de luz (DLS) métodos conforme descrito abaixo:

1. Dimensionamento das nanopartículas
   O dimensionamento das nanopartículas é conseguido usando dispersão dinâmica de luz como se segue:
   1. Adicionam-se 10 ul da amostra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 ul de água desionizada numa cuvete de plástico descartável.
      NOTA: Este é um valor representativo para um sinal de DLS bom.
   2. Tapar o cuvete e vortex para misturar bem. Coloque a cuvete num sistema utilizado para analisar o tamanho das partículas, a fim de medir o tamanho das nanopartículas. Realizar análise de tamanho de partícula em um ângulo de medição de 173 °.
2. Potencial Zeta do Nanopartículas
   Potencial Zeta de nanopartículas é medido usando análise de fase de dispersão de luz como se segue:
   1. Adicionar 100 ul da amostra de nanopartículas (1 mg / ml) a 900 ul de água desionizada numa célula capilar de plástico descartável. Este valor é representativo para uma boa medição do potencial zeta.
   2. Coloque o capilary de células em um sistema utilizado para analisar o potencial zeta, a fim de medir o potencial zeta das nanopartículas utilizando parâmetros padrão a 25 ° C.
3. Temporal Estabilidade do Nanopartículas
   A estabilidade temporal das nanopartículas é medida usando dispersão dinâmica de luz como se segue:
   1. Avaliar a estabilidade das nanopartículas por medição dos tamanhos das nanopartículas em água Dl, bem como meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) como descrito na secção 3.1.
   2. Repita as medições de tamanho em água Dl e DMEM uma vez / dia, durante um período de 5 dias.

4. A citotoxicidade das nanopartículas

A citotoxicidade das nanopartículas é medida usando um ensaio de proliferação celular XTT como se segue:

1. Semente 10.000-15.000 células / poço de cada tipo de célula estudada (Neuro2A, BSG D10, EoL-1, e OE21) em uma placa de 96 poços. Certifique-se de que o volume total de células inoculadas não é um eXceed 0,2 ml / poço. Incubar as células semeadas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Entrando em contato com nanopartículas com as células:
   1. Incubar as células com concentrações variáveis ​​de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte a Tabela 1 como uma tabela representativa que descreve as quantidades de nanopartículas (em 50 ul) foi adicionado às células após a remoção de 50 mL de meio / poço.
      1. Para ter em conta qualquer absorvância de interferência das nanopartículas dentro do ensaio, adicionar um espaço em branco que consiste em uma concentração adequada de nanopartículas (0-0,5 mg / ml; em equivalência às quantidades adicionadas às células) para meio sem células.
   2. Incubar as células com nanopartículas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2. Meios de Aspirar cada cavidade e lavar com tampão de coloração composta por 5% de soro fetal bovino (FBS) em solução tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 100 ul de meio sem vermelho de fenol e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂para 16-18 hr.
3. Preparar a solução de trabalho de XTT celular Ensaio de Proliferação por mistura dos componentes do kit de reagente XTT (XTT e Activator) conforme as especificações do fabricante. Aspirar a mídia a partir dos poços e adicionar 100 ml de RPMI (RPMI w / o vermelho de fenol + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) ou meio apropriado para o tipo de célula estudado. Adicionar 50 ul de solução de trabalho de XTT a cada poço e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2-2,5 h.
4. Medir a absorvância a 490 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm para corrigir impressões digitais ou manchas. Calcule a absorção corrigido para cada poço (A ₄₉₀ -A ₆₃₀₎ e, em média, as leituras de repetições.
5. Subtraia as leituras em branco de cada valor bem para calcular os valores de absorção corrigidos finais. Calcula-se a percentagem de sobrevivência para cada amostra através da normalização da absorvância final corrigido para a de células não tratadas, sem nanoparticulas. Plot survival percentagem em função da concentração de nanopartículas.

5. MRI relaxividades dos PN PB, GdPB e MnPB

Relaxividade RM é medida usando T ₁ - T ₂ e sequências ponderadas por preparação de um "fantasma" MRI utilizando uma placa de 96 poços contendo nanopartículas, tal como descrito abaixo:

1. Preparação Fantasma
   1. Prepara-se uma placa de 96 poços com cada poço contendo nanopartículas 100 ul (PB NPs, ou GdPB MnPB) na concentração adequada. Começando com uma concentração de 0,4 mM para cada tipo de nanopartículas, diluir em série as nanopartículas 2 × utilizando água desionizada até uma concentração de 2,4 x 10 ^-5 M foi alcançada (o que requer 14 e diluições de 15 poços).
   2. Adicionar 100 ul de solução de agarose fundida a 1% em água desionizada a cada poço e misture bem. Deixar o gel solidificar a 4 ° C durante 12 h.
      NOTA: Isso produz um fantasma contendo diluições em série deas nanopartículas em agarose solidificada.
   3. Coloque o fantasma em um 3 ímã clínico horizontal T sob um bloco sólido de 2% agar (150 cm ^3). Prenda o fantasma e bloco de agar no centro de um 8-channel HD bobina cérebro. Medir tempos de relaxação utilizando 0,5 milímetros cortes coronais de espessura na meia altura da placa de 96 poços ^11.
2. T ₁ - e T ₂ ponderadas Sequências
   Use as seguintes configurações representativas para a aquisição das seqüências no ímã clínica.
   NOTA: Estes valores são otimizados para as nanopartículas utilizadas no presente estudo:
   1. Adquirir T ₁ imagens ponderadas (T1W) Senhor usando o seguinte recuperação fluido inversão atenuada (DOM) sequência: Echo trem (ET) = 8, tempo de repetição (TR) = 2.300 ms, tempo de eco (TE) = 24,4 ms, tamanho Matrix = 512 x 224, Campo de visão (FOV) = 16 x 16 ^cm2.
   2. Adquirir T ₂ imagens ponderadas (T2W) Senhor com a seguinte Relaxa rápidoção rápida sequência spin-echo (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 mseg; TE = 104 ms; Tamanho da matriz = 512 x 224; FOV = 16 x 16 ^cm2.
   3. Adquira imagens T1W e T2W MR em 127 MHz (3 T) com os seguintes tempos de inversão: 50, 177, 432, 942, 1.961 e 4.000 ms.
3. Medindo os relaxamentos de ressonância magnética
   1. Depois de adquirir T1W e em T2 imagens usando as sequências descritas na seção 5.2, medir a intensidade de sinal para cada poço usando ImageJ, doravante designada como a região de interesse (ROI), selecionando cada ROI utilizando o botão colheita oval localizado na barra de ferramentas principal, em seguida, selecionando Analisar> Medida.
      NOTA: Um pop-up deve exibir a intensidade do sinal média de cada ROI na coluna denominada "Média".
   2. Para cada ROI, plotar a intensidade do sinal medida contra o seu tempo de inversão específica. Se necessário, pontos invertidos (leituras) que geram uma "bolha" inicial ou discrepantes no início da trama (inversão menorvezes).
      NOTA: Estas leituras são gerados em períodos de baixa inversão porque MRI mede o valor magnitude ou absoluto das imagens, em vez de seu valor real (negativo), que precisa ser contabilizada / corrigido para ^19.
   3. Prepare um ajuste exponencial para cada lote de intensidade de sinal para o ROI (SI) vs. tempos de inversão (T _I), conforme descrito no item 5.2. Lote T _I no eixo-x, SI no eixo-y; ɑ e Δ são constantes determinadas por regressão, e T _1, T ₂ é a variável a ser resolvido:
      
      em que t = T _1, T _2.
   4. Resolver para T _1, T _2, utilizando a equação acima e traçar o inverso dos valores calculados (1 / T ₁ e 1 / T ₂₎ contra as concentrações das nanopartículas utilizadas em cada ROI.
   5. Calcular o declive do gráfico linear queproduz os relaxamentos de r ₁ e r _2.
      NOTA: A secção do protocolo seguinte descreve a aplicação das nanoparticulas de marcação fluorescente e a geração de contraste para IRM, em células alvo.

6. etiquetagem fluorescente de células alvo Usando o Nanopartículas - Microscopia Confocal

NOTA: As nanopartículas (PB NPs, GdPB, e MnPB) pode ser utilizado para marcar por fluorescência de uma população de células alvo (monitorizadas por microscopia confocal) como se segue:

1. Síntese do Nanopartículas fluorescente
   1. Sintetizar GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 para marcação fluorescente de uma população de células-alvo, seguindo os passos detalhados nas seções 1 e 2.
2. Preparação de células por fluorescência Segmentação
   1. Brasão não. 1,5 vidros de cobertura por micro mergulhando-os numa solução de 0.002% de poli (L-lisina) bromidrato durante 90 min. Remover os óculos de cobertura da solução e deixe secar por 24 horas.
   2. Sementes das células (por exemplo, EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) sobre os vidros de cobertura revestidas colocados numa placa de 6 poços e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante pelo menos 16 horas. Lavar as células com uma solução a 1 × PBS e (opcional) fixar com 10% de formaldeído em solução tampão neutro durante 15 min. Células mancha com 5 uM de corante célula-permeante vermelho-laranja em PBS a 37 ° C durante 30 min. Subsequentemente, lavar as células com PBS.
3. > Labeling fluorescentes de células-alvo
   1. Adicionar 1% de albumina de soro bovino (BSA; em água Dl) para as células para minimizar a ligação não específica sobre as células, e incuba-se a 37 ° C durante 1 h.
   2. Incubar as células com as nanopartículas em BSA a 1% durante 1 h. Para EoL-1: incubar com 0,2 mg / ml ou GdPB-A488-A488-GdPB Eot3; Para BSG D10 e SUDIPG1: incubar com 0,2 mg / ml MnPB-A488 ou MnPB-A488-ANG2. Lavar as células com PBS 3 × remover unbounanopartículas nd.
   3. Cuidadosamente, inverta a tampa de vidro (contendo células e nanopartículas) numa lâmina de microscópio, garantindo que não há bolhas de ar aprisionadas. Selar a borda entre a tampa de vidro e lâmina de microscópio, aplicando cuidadosamente clara unha polonês. Imagem as células usando um microscópio de varredura a laser confocal.

7. etiquetagem fluorescente de células alvo Usando o Nanopartículas - Citometria de Fluxo

As nanopartículas (PB NPs, GdPB e MnPB) pode ser utilizado para rótulo fluorescente uma população de células alvo (monitorizada por citometria de fluxo) como se segue:

1. Preparar suspensões de células a ser orientada em PBS. Para os estudos de culturas puras, as suspensões consistem de um único tipo de células (por exemplo, BSG D10); ressuspender um sedimento celular de células D10 BSG em PBS a 100.000 células / ml (10 ml total). Para os estudos de cultura mistas, as suspensões de composto de pelo menos dois tipos de células (por exemplo, EoL-1 e OE21); semelhante a D10 BSG, os sedimentos celulares ressuspender de EoL-1 e OE21 em PBS a 100.000 células / ml cada (10 mL no total).
   1. Prepare razões variáveis ​​de EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 mL de cada um de EoL-1 e OE21), 1: 3 (0,5 mL EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
2. Bloquear as células (suspensões puros e mistos) a ser alvejado por as nanopartículas com 2 ml de BSA a 5% para minimizar a ligação não específica.
3. Adicionar 1 ml (1 mg / ml) para as nanopartículas de células e incubar durante 1 h. Para BSG D10, incubar células com MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo controle), ou MnPB-A488-ANG2). Para as misturas de EoL-1 e OE21, incubar as misturas com uma quantidade fixa de GdPB-A488-Eot3.
4. Lavar as células livres de nanopartículas não ligadas por fiação para baixo as amostras a 1000 x g durante 5 minutos, pelo menos, 3 × para remover as partículas não ligadas. Ressuspender as células em 1 ml de PBS e fixar com 10% de formaldeído em PBS. Stain células por incubação com 10 ug / ml7-Aminoactinomytcin D em PBS em gelo durante 30 min. Lavar com PBS, em seguida, analisar 10.000 células fechadas a partir de cada amostra utilizando um citómetro de fluxo.

8. Generating MRI Contrast em células-alvo Usando nanopartículas

As nanopartículas (PB NPs, GdPB e MnPB) pode ser usado para gerar contraste para IRM (em ambos os T ₁ - T ₂ e sequências ponderadas) de uma população de células alvo como se segue:

1. Preparação Fantasma
   1. Cultivar células (por exemplo, BSG D10) em balões T75 até ~ 80% de confluência. Use médio e condições de crescimento adequado. Para BSG D10, crescer as células em DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep a 37 ° C e 5% de CO _2.
   2. Lavar as células livres do meio com 5 ml de PBS e bloquear as células com 5 ml de 1% de BSA em PBS durante 1 h para minimizar a ligação não específica. Adicionam-se 5 ml (0,5 mg / ml) para as nanopartículas de células. Para BSG D10, incubar as células com MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo controle), e MnPB-A488-ANG2 durante 1 h.
   3. Lavar as células 3 x com 5 ml de PBS para remover as nanopartículas não ligados. Tripsinizar as células por incubação das células com 2 ml de tripsina a 0,25% EDTA 1 × solução durante 5 minutos a 37 ° C e 5% de CO ₂ destacá-las a partir do frasco para a preparação fantasma. Adicione 8 ml de DMEM para saciar a tripsinização das células.
   4. Recolher as células por centrifugação a 1000 × g durante 5 min; Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de PBS e adicionar 1 ml de 10% de formaldeído em PBS, para fixar as células. Adicionar 100 uL de cada amostra a um poço separado de uma placa de 96 poços.
   5. Adicionar 100 ul de solução de agarose fundida a 1% em água desionizada a cada poço e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo. Deixar o gel solidificar a 4 ° C durante 12 h.
      NOTA: Isso produz um fantasma contendo células com nanopartículas anexados em agarose solidificada.
   6. Coloque o fantasma em um 3 ímã clínico horizontal T ao lado de um bloco sólido de 2% agar (150 cm ^11.
2. T ₁ - e T ₂ ponderadas Sequências
   Utilize as seguintes definições para a aquisição das sequências no ímã clínica MRI:
   1. Adquira imagens T1W MR com a seguinte rotação seqüência eco: Echo trem (ET) = 1, tempo de repetição (TR) = 650 ms, tempo de eco (TE) = 11 ms, tamanho Matrix = 320 x 256, Campo de visão (FOV) = 10 x 10 ^cm2.
   2. Adquira imagens T2W MR utilizando a seguinte sequência FRFSE: ET = 28; TR = 3000 mseg; TE = 101 ms; Tamanho da matriz = 384 x 288; FOV = 10 x 10 ^cm2.
3. Processamento pós-aquisição
   1. Para facilitar a leitura, converter as imagens originais em escala de cinza em uma imagem de escala de cores usando ImageJ: Selecione Imagem> Tipo> 8-Bit, para converter a imagem em escala de cinza.
   2. Calcular a intensidade normalizada para cada amostra após subtracção da contribuição de sinal a partir da solução de agarose.

Resultados

Usando o esquema de síntese de um pote, nanopartículas de PB PN (diâmetro médio de 78,8 nm, índice de polidispersão (PDI) = 0,230; calculado pelo instrumento de espalhamento de luz dinâmico), GdPB (diâmetro médio de 164,2 nm, PDI = 0,102), ou MnPB ( diâmetro médio de 122,4 nm, PDI = 0,124) que são monodispersas (como medido por DLS) pode ser sintetizado de forma consistente (Figura 2A). Os potenciais zeta medidos das partículas sintetizadas são menos do que -30 mV (Figura 2B), indicando...

Discussão

Este artigo apresentou os métodos para a síntese de uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares baseados em nanopartículas bioativa de azul da Prússia. As modalidades de imagem molecular incorporados nas nanopartículas são imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular, devido às suas características complementares. As nanopartículas azuis cobalto bioativa de ter um design core-shell. As principais etapas da síntese destas nanopartículas são: 1) one-pot síntese, que dá os núcleos que são co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hexacianoferrato de potássio (II) tri-hidratado (K4Fe(CN)6· 3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MnCl2· 4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
nitrato de gadolínio (III) hexa-hidratado (Gd(NO3)3· 6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl3· 6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Proteoglicano, Anticorpo Conjugado de Biotina	Millipore	AB5320
Biotinilado Anti-Eotaxina-3	Peprotech	500-P156GBT
Linha Celular	ATCC	CCL-131
Linha celular BSG D10	Estoque de laboratório	---
OE21 Linha celular	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neuroesferas	Estoque de laboratório	---
Linha celular Eol-1	Sigma-Aldrich	94042252
bromidrato de poli(L-lisina)	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomicina D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Centrífuga	Eppendorf	5424
Bomba Peristáltica	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Placa Quente/Agitador Magnético	VWR	97042-642
Folha de Alumínio Ultra Limpa	VWR	89107-732
Vortex Misturador	VWR	58816-121
Tubos de microcentrífuga cónicos de 1,7 ml	VWR	87003-295
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	VWR	21008-918
Suportes de tubos	VWR	82024-342
Cubetas de plástico descartáveis	VWR	7000-590 (/586)
Célula capilar Zetasizer	VWR	DTS1070
Filtros centrífugos, coluna giratória de 0,2 micrómetros	VWR	82031-356
Tabuleiro de cultura de células de 96 poços	VWR	29442-056
Tripsina EDTA 0,25% solução 1x	JR Scientific	82702
Cell Culture Grade PBS (1x)	Life Technologies	10010023
XTT Kit de Ensaio de Proliferação Celular	Trevigen	4891-025-K
T75 Flask	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Microscópio Confocal de Varredura a Laser Fluoview FV1200	Olympus	FV1200
Lâminas de Microscópio	Thermo Scientific	154534
Micro Cover Glasses, Quadrado, No. 1.5	VWR	48366-227
Lâminas de Microscópio	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Citômetro de Fluxo	BD Biosciences
3 T Ímã de Ressonância Magnética Clínica	GE Healthcare
Balão