Artigo de método

Lepr

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DOI:

10.3791/52632

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11 de maio de 2015

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

Neste artigo

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Resumo

A diabetes tipo 2 é uma doença crónica que afecta 382 milhões de pessoas em 2013, e espera-se aumentar para 592 milhões até 2035 1. Durante as últimas duas décadas, o papel da disfunção da célula beta em diabetes tipo 2 tem sido claramente estabelecida 2. O progresso da pesquisa tem necessários métodos para o isolamento de ilhéus pancreáticos. O protocolo de isolamento de ilhotas apresentado aqui compartilha muitos passos comuns com protocolos de outros grupos, com algumas modificações para melhorar o rendimento e qualidade de ilhotas isoladas, tanto do tipo selvagem e db Lepr diabético (db / db) camundongos. Uma célula-vivo método de imagem 2-fótons é então apresentado que possa ser usado para investigar o controlo da secreção de insulina dentro de ilhotas.

Introdução

O papel da disfunção da célula beta em doenças tem sido amplamente reconhecida 3,4. As linhas celulares tais como o MIN6 e INS-1 são ferramentas úteis para compreender a biologia do comportamento das células beta. No entanto, o controlo fisiológico da secreção de insulina tem lugar dentro das ilhotas de Langerhans. Estas ilhotas conter milhares de células beta embaladas apertadamente, assim como os vasos sanguíneos e outros tipos de células endócrinas. Este ambiente dentro do ilhéu influencia a secreção de insulina e é provável que seja importante na diabetes. Portanto, para compreender o controlo fisiológico da secreção de insulina, e a patofisiologia da doença, que é essencial para estudar ilhotas intactas.

Isolamento de ilhotas

Ilhotas humanos vivos e, em particular, ilhotas humanas de pacientes com diabetes tipo 2 são difíceis de obter. Além disso, ilhotas humanos têm possibilidades limitadas de manipulação molecular experimental. Os investigadores têm, por conseguinte, é empreguepermite que a partir de animais e em modelos animais de diabetes do tipo 2. Um modelo de doença, tais é o rato db / db. Esta é uma mutação espontânea que os modelos de diabetes tipo 2 com uma progressão fenótipo que se aproxima bastante doença humana 5,6. O protocolo apresentado aqui para isolamento de ilhotas de ratos db / db diabéticos tem muitas etapas em comum com outros grupos com alguns refinamentos para melhor rendimento, purificação e aumento da sobrevida das ilhotas.

Imaging dois fótons

A célula de ensaio directo de 2-fótons descrito aqui permite aos investigadores para quantificar o número e avaliar as características de grânulos individuais contendo insulina a partir de células de muitos diabéticos do tipo selvagem e 7 ilhotas 8,9.

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Protocolo

NOTA: Todos os presentes experimentos foram realizados de acordo com procedimentos de ética de animais locais da Universidade de Queensland (aprovados pela Universidade de Queensland, Comitê de Ética Biociências anatômica).

1. Isolamento Islet

  1. Preparação de reagentes
    1. Mistura de enzimas
      1. Para a digestão pancreática, utilizar uma mistura de Liberase e colagenase tipo IV. Diluir TL Liberase (termolisina baixo) 1 frasco de 5 mg com 26 ml de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
      2. Prepare a colagenase de tipo IV, em tampão de Hank com uma concentração de 0,5 mg / mL, suplementada com 5mM de HEPES, 0,5 mM de CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNase e 1 mg / ml de albumina de soro bovino.
      3. Misturar o TL Liberase e soluções de colagenase em uma proporção de 4: 1 (em volume), ou seja, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenase. Alíquota da mistura de enzimas para cada 2,5 ml e armazenar a -20 ° C.
        NOTA: Os tempos de incubação tecido vary um pouco entre os lotes de enzima (30 s a 1 min diferença). Portanto, um lote de ensaio pode ser necessária.
    2. RPMI Isolamento de mídia
      1. Dissolve-se um frasco de meio RPMI 1640 em pó em 1 litro de água à temperatura ambiente e completar com 2 g de NaHCO3, 4,02 g de HEPES.
      2. Combinar a meios de isolamento RPMI num grande frasco cónico, misture com agitador magnético, ajustar o pH a 7,4 com NaOH, filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C.
    3. RPMI Meios de Cultura
    4. Utilizar o meio de cultura RPMI, com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (isto é, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 ug / ml).
  2. A cultura e isolamento de ilhotas
    1. Sacrifício de Animais
      1. Sacrifique ratos por deslocamento cervical ou asfixia com CO2 de acordo com procedimentos de ética da instituição local. Pulverizar o corpo do rato cuidadosamente com etanol a 70%.
    2. Perfusão pâncreas
      1. VOCÊse duas longas cortes lateralmente através da pele abdominal e do peritoneu para fazer uma aba em forma de V. Puxe a aba da pele até descobrir toda a cavidade abdominal, pôr de lado o intestino e manter o fígado no lugar por um lenço de papel dobrado para revelar o ducto biliar comum (Figuras 1 e 2). Coloque o animal de modo que a cabeça na direção do cirurgião e da cauda longe do cirurgião.
      2. Aplicar uma pinça vascular na ampola na parede do duodeno para bloquear as enzimas injectados de entrar no duodeno (Figura 1).
        NOTA: Este é um passo importante, pois determina se as enzimas injetadas vai para o ducto pancreático e perfundir o pâncreas ou refluxo no local da injecção (mais de pinça) ou ir para o duodeno (sob braçadeira).
      3. Canular do ducto biliar comum com uma agulha G 31 perto da junção do ducto hepático comum e ducto cístico (Figura 1) e deixar espaço para uma segunda injecção se the pâncreas não para perfundir a primeira vez. Lentamente (mais de ~ 10 seg) injetar cerca de 2 ml de mistura de enzimas frio para o rato do ducto biliar comum.
        NOTA: Os pâncreas perfundido será rapidamente se a braçadeira está na posição direita.
      4. Ajuste a posição da braçadeira se a agulha está dentro do ducto biliar comum, mas não pode perfundir o pâncreas (ie., Mover para cima a braçadeira um pouco longe do fígado se sobre apertada ou movê-lo um pouco para baixo para o fígado se sob apertada).
        NOTA: A agulha, por vezes, vai para dentro da cápsula, em vez de em torno do lúmen da conduta. Um sinal útil para verificar se a agulha está dentro do ducto biliar comum é a dilatação do duto, aquando da injecção. Se falhar o pâncreas para perfundir, uma alternativa é a mistura de enzimas pode ser injectado para múltiplos sítios do pâncreas com menor rendimento esperado. A perfusão do local esquerda do pâncreas (lóbulo esplénica) é importante para a maximização do rendimento da ilhota.
      5. Depois do pâncreas é perfused, remover rapidamente o pâncreas, colocá-lo em um frasco (~ 20 ml, vidro) e incubar durante ~ 19 min num banho de água a 37 ° C.
        NOTA: O tempo de incubação pode variar um pouco dependendo da estirpe do mouse e idade.
      6. Após o tempo de incubação, parar o processo de digestão por adição de ~ 20 mL de meio de isolamento frio. Agitar suavemente o frasco para interromper o pâncreas e derramá-lo através de um peneiro normal chá (diâmetro de poro de 1 mm) em um tubo estéril de 50 ml. Encher o tubo com meios de isolamento e centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora.
      7. Dissolve-se o sedimento no meio de isolamento e transferir novamente para dois tubos de 15 ml, em seguida, centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora. Após a aspiração do sobrenadante, misturar as duas pelotas bem com 6 ml de meio de separação celular gradiente de densidade (Histopaque 1077 solução) por tubo em vórtice ou pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicionar suavemente ~ 6 ml do meio de isolamento para o lado do tubo na parte superior deos meios de separação por gradiente de densidade e centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C com freio fora.
      8. Recolhe-se o sobrenadante no (meio de isolamento) superior, média e inferior (densidade meios de separação de células gradiente) camada em três pratos separados. Handpick as ilhotas nestes três pratos, com uma pipeta sob um microscópio de dissecação.
        NOTA: A camada do meio contém a maioria dos ilhéus. As ilhotas são reconhecidos como estruturas compactas de ~ 50 a 500 um de tamanho (Figura 3). Obtemos ~ 200 ilhotas em camundongos WT e entre 300 e <100 ilhotas em ratinhos db / db.
    3. A cultura ilhéu
      1. Para ajudar as ilhotas recuperar a partir da digestão enzimática, grupos de cultura de 40 ilhéus em 25 cm de placa de Petri com 6 ml de RPMI meio de cultura (10 mM de glucose) a 37 ° C, 5% / 95% de CO2 / O2 durante 2 dias antes vivo -cell imaging dois fótons. Alterar o meio de cultura diária.

2. Vivo celular 2-Photon Imagens

  1. Preparação do Reagente
    1. Tampão extracelular
      1. Preparar o tampão de sódio extracelular rico para o ensaio de 2-fótons com 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de NaHCO3 e 10 mM de HEPES.
    2. Extracelular Dye
      1. Para o ensaio de 2-fótons, preparar estoque SRB 8 mM em tampão extracelular, alíquota em pequenos tubos e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a SRB estoque 1:10 em tampão extracelular fresco para obter uma concentração de trabalho de 0,8 mM.
  2. Photon Imagens
    1. Em primeiro lugar, pré-incubar 2 dias em cultura ilhotas em tampão extracelular de glucose 3 mM durante 30 min.
      NOTA: Nós usamos ilhotas entre 2 e 5 dias de cultura.
    2. Em seguida, colocar uma lâmina de vidro para a câmara de controlo térmico montado na platina do microscópio. Use massa para evitar o vazamento de uma solução.
    3. Cubra a câmara com 500 mL de extracelulartampão ular contendo 0,8 mM SRB com diferentes concentrações de glicose (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mM de glicose).
    4. Em seguida, colocar a ilhota pré-incubados no meio da câmara, e se concentrar em 3-4 camadas de células na ilhota onde, nas ilhotas de roedores, a imunocoloração para a insulina mostra que a maioria das células são células beta.
      NOTA: O SRB vai delinear toda a membrana da célula da ilhota rapidamente e a ilhota está pronto para a imagem.
    5. Usar um microscópio 2-fótons com uma objectiva 60X de imersão em óleo (1,42 NA) e software de imagem (por exemplo., Scanimage 11). A Figura 4 ilustra uma disposição típica de microscopia. Imagem eventos exocíticas usando SRB como uma membrana extracelular marcador fluorescente impermeant excitados por pulsos de laser de femtossegundos a 880 nm, com fluorescência detectada em 550-650 nm. Grave as respostas à estimulação de ilhotas.
    6. Identificar eventos exocíticas único pela súbita aparição de uma pequena mancha fluorescente (resolução de 10 pixels /1; m) e confirme a fase de rápido crescimento do sinal fluorescente sobre uma região de interesse (~ 0,78 mm 2).

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Resultados

Islet rendimento e purificação

Para um rato normal de tipo selvagem, são esperados cerca de 200 ilhotas. Ilhotas saudáveis ​​olhar brilhante, em forma redonda e tem uma borda lisa. Um lote de isolamento over-digerido tem geralmente pequenas e difusas ilhotas enquanto um lote digerido-under tem menos ilhotas e ilhéus celulares ligados acinares (Figura 3). Para ratinhos db / db diabéticos, o rendimento da ilhota e aparência depende da progressão da doença com melhores ratos gl...

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Discussão

O factor mais importante no isolamento de ilhotas é a perfusão inicial do pâncreas; sob um pâncreas perfundido resultados com um rendimento de ilhotas consideravelmente inferior. Outros factores também afectam a qualidade de isolamento, tais como o tempo de digestão e o nível de agitação que pode compensar parcialmente o nível de perfusão. Por exemplo, um pâncreas perfundido totalmente terá de ser incubadas a 37 ° C durante ~ 18 min 30 seg, agitando suavemente, em contraste sob uma digerido pâncreas pode necessitar de ~...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um Australian Research Council Grant DP110100642 (para PT) e National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 e APP1059426 (para PT e HYG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Liberase TL 5 mgRoche-5401020001
Colagenase tipo IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Médio (10x) 1LSigma AldrichR1383para preparar meios de isolamento
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076para preparar meios de cultura
Penicilina-Estreptomicina 100 mlGibco-Life Technologies15140-122para preparar meios de cultura 
Soro fetal bovino 500 mlGibco-Life Technologies10099-141para preparar meio de cultura
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco-Life Technologies11966-025para diluir o programa metamorfo liberase
Molecular Devices, EUApara analisar as imagens de 2 fótons

Referências

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
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