Artigo de método

Protocolos para obtenção de embriões somáticos e Zygotic para estudar a regulação do desenvolvimento embrionário precoce no Modelo de leguminosas Medicago truncatula

DOI:

10.3791/52635

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9 de junho de 2015

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1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia

Neste artigo

Resumo

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O objetivo é ilustrar que a leguminosa modelo Medicago truncatula pode ser prontamente utilizada para investigar a regulação da embriogênese inicial da planta para complementar o modelo Arabidopsis não leguminoso. A morfologia do vagem está ligada aos estágios de embriogênese zigótica e um protocolo para coletar embriões usando cultura de tecidos também é fornecido.

Resumo

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No início da embriogênese a partir de uma única célula zigoto passa por rápida divisão celular e morfogênese, e é caracterizada morfologicamente por estágios de pré-globular, globulares, coração, torpedo e cotilédones. Esta evolução progressiva está sob a regulação apertada de uma rede molecular complexa. Colhendo embriões suficientes em um estágio similar de desenvolvimento é essencial para a investigação da regulação celular e molecular da embriogênese precoce. Isso não é simples, uma vez embriogênese sofre morfogênese rápido em um curto espaço de tempo por exemplo, oito dias para Medicago truncatula para chegar à fase de cotilédones cedo. Aqui, nós resolver a questão através de duas abordagens. O primeiro estabelece uma ligação entre o desenvolvimento do embrião e morfologia pod em ajudar indicar a etapa do embrião zigótico. Isto é particularmente com base no número de espirais e desenvolvimento das espinhas pod. Uma forma alternativa para complementar o s in vivotudies é através de cultura de explantes de folhas para produzir embriões somáticos. O meio inclui uma combinação de hormônio incomum - uma auxina (ácido 1-naftalenoacético), uma citocinina (6-benzilaminopurina), ácido abscísico e giberelina. As diferentes fases pode ser discernido que cresce fora do calo sem dissecção.

Introdução

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Legumes são a terceira maior família de plantas superiores com cerca de 20.000 espécies e da (ou Fabaceae) família Leguminosae são segundo para os cereais produzidos na área colhida e produção total de 1. A soja é a terceira maior safra cultivada. Leguminosas fornecer cerca de um terço da proteína da dieta e um terço de óleo vegetal para consumo humano 2. Legumes com a sua capacidade de fixação de N 2 também contribuir para sistemas agrícolas sustentáveis. Medicago truncatula, como soja, lojas de proteína e óleo nos cotilédones de suas sementes e é um modelo legume genética e genómica com consideráveis ​​recursos genéticos e ....

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Protocolo

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1. Desenvolvimento de Embriões Zygotic

  1. Material Vegetal
    1. Cresça o Medicago truncatula tipo selvagem Jemalong ou seu próximo isogênico, altamente re-generativas genótipo Jemalong 2HA 13 (conhecido como 2HA) em uma estufa com um fotoperíodo de 14 horas e 23 ° C / 19 ° C de temperatura dia / noite.
      1. Pierce a superfície do revestimento de semente (com uma agulha G 23) antes de semear a semente de modo que a água pode entrar a semente e embeber em água durante a noite. Adicionar água suficiente para cobrir integralmente a semente.
      2. Sow 3 sementes em cada vaso diâmetro 15 cm (total de 10 potes) em mistura de envasamen....

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Resultados

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Para diferentes estruturas de embriogénese pod zigóticos correspondentes às diferentes fases de embriões são mostrados na Figura 1A - F enquanto os diferentes estágios embrionários são mostrados na Figura 2A - F. Ao seleccionar vagens na mesma fase, as amostras de óvulos que são bastante uniforme pode ser obtida (Figura 3A). Usando RT-qPCR embrião genes específicos podem ser facilmente detectada e os estudos do curso de tempo avaliado <.......

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Discussão

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Os protocolos descritos são relativamente simples e permitir a investigação de embriogênese legume com toda a célula contemporânea e técnicas moleculares. Reconhecemos que há vantagens e desvantagens de ambos in vivo e in vitro abordagens. Ambos permitem mais foco na embriogênese inicial em relação à cultura de sementes imaturas 19.

No caso de estudos in vivo que é descrito é predominantemente o isolamento do óvulo da vagem que é adequado para muitos estudos do e.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Australian Research Council grant CEO348212 e pela University of Newcastle. A assistência do Dr. Sam Zhang é reconhecida.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
P4 meioSigma-AldrichChemicals ou outro fornecedor de grau analítico
Sais principais Sais
Vitaminas
ÁgarBacto Laboratories214010Ágar Bacto
Hormônios
1- Ácido naftalenoacéticoSigma-AldrichN0640Dissolver em pequena quantidade de 1 M NaOH
Ácido abscísicoSigma-AldrichA1049Dissolver em pequena quantidade de 1 M NaOH
6-BenzilaminopurinaSigma-AldrichB3274Dissolver em água MQ com aquecimento e algumas gotas 1N HCl
Ácido giberélicoSigma-AldrichG7645Dissolver em pequena quantidade de etanol
Equipamento
Microscópio de dissecação estéreoLeicaMZFLIIIOu similar
Microscópio ópticoZeissAxiophotOu similar, com ótica adequada
Câmera digitalZeissAxioCam HRcOu similar
Folhas esterilizantes Recipiente
policarbonato com tampa de rosca de 250 mL com tampa de polipropilenoSARSTEDT75.9922.519Autoclavável
Use Sigma-Aldrich menoresvegetais de

Referências

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  1. Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
  2. Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importanc....

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