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Artigo de método

Um Procedimento craneotomia Lateral Grande para Wide-campo Mesoscale imagens ópticas de atividade cerebral

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DOI:

10.3791/52642

⸱

7 de maio de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, University of Lethbridge

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método para a criação de um grande craniotomia unilateral sobre as regiões temporal e parietal do córtex cerebral do rato. Isto é especialmente útil para imagens em tempo real sobre uma área extensa de um hemisfério cortical.

Resumo

A craniotomia é um procedimento comum para expor o cérebro para experiências in vivo. Na pesquisa do mouse, a maioria dos laboratórios utilizam um pequeno craniotomia, tipicamente 3 mm x 3 mm. Este protocolo apresenta um método para a criação de uma janela craniana substancialmente maior 7 milímetros x 6 milímetros expondo mais de um hemisfério cerebral do rato ao longo dos córtices temporal e parietal (por exemplo, bregma 2,5-4,5 mm lateral, 0-6 mm). Para executar esta operação, a cabeça tem de ser inclinado cerca de 30 ° e a maior parte do músculo temporal deve ser retraída. Devido à grande quantidade de remoção de osso, este processo destina-se apenas para as experiências agudas com o animal anestesiado e a cirurgia em todo o experimento.

A principal vantagem deste inovador janela craniana grande lateral é para fornecer acesso simultâneo a ambas as zonas medial e lateral do córtex. Esta grande janela craniana unilateral pode ser utilizado para estudar a dinâmica neurais entre células,bem como entre diferentes áreas corticais pela combinação de registos electrofisiolicos multi-eléctrodos, imagiologia da actividade neuronal (por exemplo, imagiologia intrínseca ou extrínseca), e estimulação optogenetic. Além disso, este grande craniotomia também expõe uma grande área de vasos sanguíneos corticais, permitindo a manipulação directa da vasculatura cortical lateral.

Introdução

A craniotomia é um procedimento padrão utilizado por neurocientistas para revelar uma porção do cérebro. Desde o alvorecer da eletrofisiologia, a craniotomia tem permitido avanços sem precedentes no campo da neurociência. mapeamento densa do córtex cerebral com eléctrodos levou a testar hipóteses experimentos e teorias baseadas nestes mapas. Nós entraram recentemente uma nova era na qual a craniotomia está a ser utilizado para imagiologia in vivo de fluxo sanguíneo cortical 1, 2, 3 e 4 arquitectura neurovascular, possibilitando a visualização em tempo real da actividade cortical dentro das áreas expostas 5, 6, 7. Apesar de muitos estudos utilizam Craniotomias combinadas com técnicas de imagiologia óptica in vivo para o estudo da estrutura e função de neurónios corticais, células da glia, e CRvasculatura tical 8, 9, mais investigações são limitados por pequenas áreas do córtex exposto (mas ver 10).

O propósito deste protocolo é o de proporcionar um método para a criação de um grande craniotomia lateral, expondo o córtex cerebral a partir da linha média para o osso esquamosal, e que se estende para além da bregma e lambda. Esta grande craniotomia permite a visualização simultânea dos córtices de associação (retrosplico, cingulado, e parietal), o motor primário e secundário, sensoriais, visuais, e o córtex auditivo. Este método tem sido anteriormente acoplados com imagiologia tensão sensível corante (VSDI) para investigar a forma como várias áreas corticais interagir um com o outro durante a actividade espontânea e induzida por estímulo cortical 5, 11, 12. Os aspectos mais difíceis deste procedimento incluem o posicionamento da cabeçado animal, que fixa a placa de cabeça, hemorragia e evitando ao mesmo tempo separar o músculo temporal do osso parietal. Cuidados também devem ser tomadas durante os processos de perfuração e remoção do crânio como as curvas crânio com um ângulo oblíquo.

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Protocolo

O protocolo seguinte segue a Universidade do Comitê Animal Care Lethbridge (ACC) diretrizes, e é conduzido de acordo com as normas do Canadian Council on Animal Care (CCAC).

1. Preparação

  1. Para períodos prolongados de estudo, todos os fornecimentos autoclave cirúrgicas abertas e assegurar que a esterilidade seja mantida durante toda a cirurgia. Se múltiplas cirurgias são necessárias, autoclave entre cirurgias.
  2. Assegurar que existe uma abundância de memória intermédia cérebro na mão (pelo menos, 50 mL). A solução é composta de cloreto de 134 mM de sódio, de potássio 5,4 mM, cloreto de magnésio 1 mM de hexa-hidrato de cloreto de cálcio di-hidratado 1,8 mM e 5 mM de HEPES sódio, pH equilibrada para 7,4 com cloreto de 5 M de ácido clorídrico.
  3. Colocar o rato numa câmara de indução e anestesiar com 3-4% de isoflurano. Siga com 1,0-2,0% de isoflurano para manutenção durante a cirurgia. Reduzir ainda mais a tão baixo quanto 0,4-0,8% durante a imagiologias = "xref"> 5, 13, 14, 15, desde a anestesia adequada é mantida. Estes baixos níveis de anestesia requerem monitorização vigilantes e frequente do rato (cerca de 5 min cada) para garantir que permanece areflexic a estímulos dolorosos.
    NOTA: A desidratação pode se tornar problemática devido à alta superfície à relação do volume do mouse e exacerbada pelo uso prolongado de isoflurano.
    1. Utilizar injecções subcutâneas de solução salina, 0,1 ml por 10 g de peso corporal, a cada 1-2 h. Quando adequadamente hidratado, o rato vai urinar uma vez a cada 1-2 horas.
  4. acompanhar de perto o mouse para assegurar anestesia consistentes ao longo da cirurgia e de imagem. Não deixe o mouse sem vigilância e tomar cuidado para que ele nunca recupere a consciência.
  5. Transferir o rato anestesiado com a cabeça porta-set-up e lugar numa almofada de aquecimento-regulação térmica ajustada para 37 ° C. Fixar os teet superioresh em um suporte de dentes.
  6. Rodar a cabeça do rato para a esquerda aproximadamente 30 ° para expor a face lateral direita da cabeça e proteger a cabeça do rato com a extremidade romba de barras da orelha (Figura 1A).
  7. Aplicar pomada oftálmica para evitar a secagem da córnea.
  8. Para reduzir o edema cerebral, injectar dexametasona (4 mg / Kg) por via intramuscular.
  9. Limpar a pele sobre a área cirúrgica com cotonetes de algodão embebido em 4% de clorexidina (3 vezes) e 70% etanol (3 vezes). Use cada cotonete apenas uma vez.
  10. Don luvas cirúrgicas e cobrir o animal com filme plástico adesivo. Fornecer anestésico local por injecção de lidocaína (8-10 mg / kg; 2% de epinefrina) subcutaneamente sobre o local da craniectomia. Esperar 3-5 min para o fármaco a ser absorvido para dentro do tecido.

2. Remover a pele e retração do músculo do Crânio

  1. Executar quase todos estes procedimentos enquanto visualiza o crânio sob umamicroscópio de dissecação (por exemplo, 0,7 - 4.5X poder, dependendo da situação).
  2. Levante a pele 1 mm esquerda da linha média (atrás da orelha) com uma pinça e fazer uma pequena incisão horizontal com uma tesoura cirúrgica.
  3. Faça de 5 - 6 milímetros corte lateral, em direção à orelha direita, e depois cortar no final rostral da cabeça.
  4. No ponto de incisão inicial, inserir a tesoura e cortar 10 mm rostral.
  5. Cortar a pele ao redor da orelha direita e perto do olho direito para expor o lado direito do crânio e do músculo temporal. Assegure-se que a maior parte da área exposta é, pelo menos, 7 mm. Aparar a pele ainda mais se a área cirúrgica precisa ser estendido.
  6. Fixar a pele ao redor da incisão, colocando algumas gotas da cola de cianoacrilato butil entre o crânio e a pele. Assegurar o tecido ter sido previamente seca com aplicadores com ponta de algodão ou tecidos laminados para aumentar a eficácia do adesivo.
  7. Usando um cotonete, esfregue a superfícieDo crânio em um movimento circular para remover o periósteo do crânio. Certifique-se que nenhum permanece por secar o crânio completamente.
  8. Usando tesoura de mola e fórceps, separe o músculo temporal do crânio; Cortar e retrair o músculo lateralmente até atingir o osso squamosal ( Figura 1C ). Tome muito cuidado para não danificar a veia temporal superficial que corre ao longo do nível do osso squamosal perto do olho, caso contrário hemorragia pode ocorrer.
  9. Controle o sangramento com espuma gelada pré-embebida no tampão cerebral. Para hemorragia grave use um cauterizador de calor. Colocar cianoacrilato de butilo cola nos locais de sangramento após o tratamento com o cauterizador de calor. Certifique-se de que a área é previamente seca usando aplicadores com ponta de algodão ou tecidos enrolados para aumentar a eficácia do adesivo.

3. Craniotomia

NOTA: O cirurgião deve permanecer diligente durante a remoção do crânio edura para evitar complicações desnecessárias. solução de problemas etapas estão incluídas deve surgir complicações.

  1. Marca a localização da bregma, quer com um marcador de ponta fina ou cortar uma fita de pequeno pedaço triangular e indicar um canto no bregma (Figura 2A) para orientar as regiões do cérebro subjacentes.
  2. Antes de fixar a placa de cabeça garantir o crânio é completamente seco. O crânio irá rapidamente seco ao ar depois da aplicação da espuma de gel embebida em tampão de cérebro, se mais de secagem é necessário, usar cotonetes com ponta de algodão. Este passo é crucial para a cabeça de chapa de fixação (Figura 1B).
    NOTA: Se houver periósteo esquerda no crânio, ou se o crânio não está seco antes de colar na placa de cabeça, ele provavelmente vai separar. Se isso acontecer, remover suavemente a placa de cabeça e começar de novo. A hemorragia pode ocorrer durante o processo; aguarde alguns minutos para que a coagular, e depois remover suavemente. Este processo não é recomendado para ser repetido mais de duas vezes.
  3. Aplicar acetato de cola de cianoacrilato em torno da borda inferior da placa de cabeça 16, e cola a placa de cobertura sobre a área craniotomia (Figura 1D & Figura 2A).
  4. Encher o espaço de abertura entre a placa de crânio e cabeça com cimento dental deixando apenas a área da craniotomia exposta. Esperar para o cimento dental para secar e endurecer, tipicamente 5 - 10 min (Figura 2B).
    1. Uma vez que o cimento é definida, preencher brevemente o poço com tampão de cérebro e permitir a embeber durante 3-5 min. Usar um tecido laminados para remover o tampão de cérebro antes de perfurar (Figura 2C).
  5. Delinear a área cirúrgica marcando levemente a superfície do crânio com uma broca de dentista. Usar um martelo pneumático (ajustado para o máximo de 20 psi), com um FG ¼ da rebarba, e controlado com um pedal de velocidade variável.
  6. Suavemente traçar a perfuração ao longo da pontuação original para aprofundá-la, eARANTIR a broca não penetra através do crânio para o cérebro (Figura 2D). Faz transforma cada poucos minutos, entre a perfuração e esfregando a superfície do crânio com tecidos laminados humedecidos. Isto irá reduzir o aquecimento e secagem do crânio a partir de fricção mecânica e exposição prolongada.
    NOTA: O crânio irá rapidamente seco ao ar depois da aplicação da espuma de gel molhado. Se mais de secagem é necessário, use cotonetes de ponta de algodão.
    Cuidado: O crânio é desigual em espessura. Por exemplo, o cume parietal-temporal é a área mais espessa, enquanto as regiões crânio perto da linha média e marcos esquamosal são relativamente finas.
  7. Durante a perfuração, verifique periodicamente para flambagem do crânio delicadamente pressionando-o com uma pinça ou a broca não-movimento. Quando o osso começa a fivela, parar de perfuração e mergulhe toda a janela em tampão cérebro.
    NOTA: Se o sangue corre para fora de uma área, isso pode sugerir que a dura-máter foi danificado. Se este for o caso, coloque um semi-espuma molhada em gel sobre a área e tentar absorver o sangue durante a aplicação de pressão para suavemente a espuma de gel com um cotonete de ponta de algodão.
  8. Esperar durante pelo menos 5 minutos antes da remoção do crânio para amolecer o osso e para reduzir a possibilidade da dura-máter que adere ao osso, tornando o processo de remoção mais fácil do crânio.
  9. Executar o processo de remoção do crânio enquanto o crânio é submerso em tampão cérebro.
    NOTA: Se uma parte do crânio permanece teimosamente em anexo, uma lâmina de bisturi nº 11 pode ser usado para marcar suavemente o crânio. Tome muito cuidado para não perfurar a lâmina através do crânio e no cérebro.
  10. Começando a partir da borda anterior, com cuidado levante o crânio solto a partir da dura-máter com a pinça.
    NOTA: Se uma pequena quantidade de hemorragia ocorre durante o processo de remoção do crânio, remover o tampão com uma pipeta de transferência ou de uma seringa, e, em seguida, substituir com um novo tampão.
  11. Uma vez que o osso está solto e "flutuante" na dura-máter, segurar com firmeza o osso com uma pinça e levantar o ossoA dura-máter. Certifique-se de que o osso nunca penetra no cérebro.
  12. Para controlar o sangramento, role o canto de um tecido em um ponto e remova a maior parte do tampão do poço craniano. Aplique rapidamente a espuma do gel, pré-embebida no amortecedor, à área sangramento ao adicionar a pressão muito clara com um cotonete da ponta do algodão.
    NOTA: A hemorragia geralmente vem da borda do osso ou da superfície da dura-máter; Ambos os casos são normais eo sangramento irá parar rapidamente se nenhum vaso sanguíneo principal estiver danificado. Se o sangramento continuar, o sangue pode encher toda a janela, formando uma folha de coágulos sobre a área de imagem.
    1. Para remover a folha de coágulos, pegue com cuidado pedaços de sangue coagulado da área de imagem, deixando o coágulo de sangue intacto em torno da fonte do vaso sanguíneo rompido. Tome cuidado para não remover o coágulo de sangue da fonte de sangramento, pois isso pode causar ainda mais perda de sangue. Irrigar a superfície do cérebro com buffer cerebral para lavar qualquer sangue.
    2. Tome cuidado para não tocar nastecido cerebral delicada ou a adição de materiais estranhos para o cérebro; repetir até a hemorragia parou, durante aproximadamente 2-5 minutos (Figura 2E).
      NOTA: Neste ponto, a craniotomia está pronto para a preparação da janela do crânio (veja o passo 5). Se necessário, remover a dura-máter, antes da implantação da janela craniana (ver passo 4).

4. Remoção Dura

NOTA: a remoção Dura requer extremo cuidado e pode demorar mais de 15 min.

  1. Desenhar o excesso de tampão da craniotomia. Enquanto se mantinha uma superfície húmida, agarra um pequeno pedaço de dura-máter com uma pinça e suavemente rasgar a dura-máter.
  2. Use uma pinça e tesouras de mola para rasgar delicadamente e cortar a dura.
  3. Cair mais tampão cérebro na superfície do cérebro para flutuar a dura-máter e ajudar a separar a partir do cérebro. Continuar até que toda a dura-máter é removido a partir do local janela craniana. Quando realizada corretamente o cérebro parecem ser muito limpo, com bl distintavasos ood e sem manchas (comparar com a figura 2E com 2F).
    Cuidado: Algumas áreas da dura-máter estão associadas a pequenas arteriolas na superfície do cérebro (por exemplo, perto da linha média proximal para a área de associação parietal), e remoção de tais pode romper a arteríola. Em tais casos, pode ser melhor deixar um pequeno pedaço de dura-máter intacta ao longo do topo da arteríola. O CIV podem não penetrar nessa área pequena, mas esta é preferida para ter grandes hemorragias.
  4. Fixar a superfície do cérebro em agarose o mais rapidamente possível para minimizar o movimento de pulsação e para evitar o agravamento do inchaço (ver passo 5).

5. Preparação Cranial Janela

  1. Pulveriza-se a tampa de vidro com 70% de etanol e usar um reservatório de ar para a seco suavemente. Assegurar o vidro é completamente limpa sem manchas nem pó presente.
  2. Prepare 1,3% de agarose por aquecimento de 200 mg de pó de agarose dissolvidos em 15 mL de tampão de cérebro. Defina o micAve a alta e aqueça por 10-15 s de cada vez, mexendo suavemente entre elas, até que todo o ágar esteja dissolvido.
    Nota: Certifique-se de que não haja bolhas ou partículas presentes, pois estas interferirão com a imagem.
  3. Colocar um termómetro na agarose quente e arrefecer a agarose até pouco acima da temperatura de solidificação (~ 40 ° C).
    NOTA: A utilização de água fria sobre o exterior do recipiente de agarose pode acelerar o processo de arrefecimento. Agite suavemente continuamente para garantir que não haja bolhas ou partículas presentes.
  4. Imediatamente antes de aplicar o agar, remova o tampão cerebral do poço craniano. Desenhe a agarose com uma pipeta de transferência e solte a agarose diretamente no cérebro. Coloque rapidamente a cobertura sobre a superfície e aperte a tampa com gotas de agarose nos cantos.

6. Eutanásia

NOTA: Em nossa experiência, este procedimento leva cirurgiões experientes pelo menos 3-4 cirurgias de prática para atingir mais de 90%taxa de sucesso. Cirurgiões menos experientes pode exigir ainda mais prática. Durante a craniotomia ou durotomy, o cérebro pode sofrer danos, por exemplo, se os punções de perfuração através do osso para dentro do cérebro. Alguns pequenos danos na borda da craniotomia podem ser permitidas. No entanto, se o cérebro não parece "limpa" com os vasos sanguíneos vermelhos brilhantes não danificadas e córtex branco, o experimento pode ter de ser encerrado. Exemplos de preparações pobres incluem aqueles com vasos sanguíneos mortas, ou quando o córtex é marcado com vasos sanguíneos rasgados ou danificados. Se qualquer um destes sinais estão presentes, a experiência será improvável produzir dados de alta qualidade. Se a cirurgia / experiência foi bem sucedida ou não, humanamente eutanásia do rato na conclusão da experiência.

  1. Anestesiar profundamente com, pelo menos, 3,5% de isoflurano. Em seguida, dá uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio a 300 mg / kg. Idealmente, se a agulha é inserida no fígado, a morte será muito rápido (<1 minuto).
  2. Se a perfusão for necessário, verificar se o animal está profundamente anestesiado antes de prosseguir (veja o passo 1.3).
  3. Alternativamente, se a perfusão não é necessário, esperar durante um mínimo de 5 minutos e, em seguida, verificar que o rato está morto. Confirmar a ausência de respiração, batimento cardíaco, bem como uma falta de retirada da dor e dos reflexos da córnea. Além disso, para observar coloração pálida azul / branco de extremidades e escurecimento dos vasos sanguíneos ao longo do córtex.

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Resultados

Para estudar as interacções entre as áreas corticais dentro de um único hemisfério, foi utilizada uma grande craniotomia que se prolonga através do seio sagital e 5-6 mm lateral. Esta janela craniana incluído primário (motor, sensoriais, visuais, auditivos), secundário (motor e visual), e associação (retrosplico, cingulado, de associação parietal) córtices dos hemisférios cerebrais direito (Figura 3A). Para este trabalho utilizou-se imagiologia tensão ...

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Discussão

Este protocolo inovador para uma grande janela craniana permite imagiologia simultânea sobre as áreas temporal e parietal do córtex cerebral. Combinado com a imagiologia óptica, isso pode ajudar a revelar dinâmica neurais em áreas corticais durante a actividade espontânea e induzida por estímulo. Este craniotomia expansiva também expõe uma grande extensão da vasculatura rede cortical, incluindo a extremidade proximal da artéria cerebral média (MCA), permitindo que as imagens in vivo do fluxo sanguíneo ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) Descoberta Grant # 40352, Campus Alberta para a Inovação Programa Chair, Alberta Research Program Alzheimer para MHM, e NSERC CRIAR em BIF doutoramento e AIHS comunhão de pós-graduação para MK. Agradecemos Pu Min Wang para o desenvolvimento deste protocolo e de treinamento cirúrgico e Behroo Mirza Agha e Di Shao para pecuária.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Almofada de AquecimentoFHC40-90-2
Tesoura FinaFerramentas de CiênciaFina 14058-09
Fórceps Ferramentas Fine Science11251-352 ou mais pares são recomendados
Tesoura de molaFerramentas Fine Science15000-00, 15000-101 par deve ser designado para remoção de dura-máter 
Pó de sombra de dente de jatoLANGDental Jet Tooth Shade Powderpara ser misturado com o líquido de
sombra de dente JetLANG DentalJet Tooth Shade Líquidopara ser misturado com o Jet Powder 
Cabeças de broca - Brocas de carboneto FG 1/4 389Midwest Dental385201
Pó de agaroseSigma-AldrichA9793
GelfoamSinclair Dental CanadaPfizer Gelfoam
IsofluranoWestern Drug Distribution Centre Ltd124125
Lidocaína 2% EpinefrinaWestern Drug Distribution Centre Ltd125299
Dexametaszona 5 mg/mLWestern Drug Distribution Centre Ltd125231
cola de cianoacrilato de butila (VetBond)Western Drug Distribution Centre Ltd12612
Jet

Referências

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