Method Article

Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

DOI:

10.3791/52643

⸱

March 25th, 2015

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, é descrito um método que permite a preparação rápida, eficiente e barata de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. O método não requer nenhum equipamento especializado e pode ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa. Seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Abstract

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Atualmente, a maior parte da pesquisa celular in vitro é realizada em poliestireno rígido de cultura de tecidos (~ 1 GPa), enquanto a maioria das células do corpo está ligada a uma matriz elástica e muito mais macia (0,1 - 100 kPa). Uma vez que essa incompatibilidade de rigidez afeta muito as respostas celulares, há um forte interesse no desenvolvimento de materiais de hidrogel que abranjam uma ampla gama de rigidez para servir como substratos celulares. Os géis de poliacrilamida, que são baratos e cobrem a faixa de rigidez de todos os tecidos moles do corpo, são o hidrogel preferido de muitos grupos de pesquisa. No entanto, a preparação do gel de poliacrilamida é demorada, tediosa e adequada apenas para pequenos lotes. Aqui, descrevemos um ensaio que, utilizando um filme plástico flexível permanente como suporte estrutural para os géis, permite a preparação de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. A técnica é mais rápida, mais eficiente e menos dispendiosa do que os métodos atuais e permite a preparação de géis de tamanhos personalizados não disponíveis de outra forma. Como não requer nenhum equipamento especializado, o método poderia ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa e seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Introduction

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A maioria dos tecidos do corpo são materiais viscoelásticos moles com um módulo de Young na gama de 0,1 kPa para o cérebro a 100 kPa durante cartilagem mole, ainda, a maior parte da investigação de células in vitro é realizada em culturas de tecidos de poliestireno (TCP), que tem um módulo de ~ 1 GPa . 1 Esse descompasso rigidez afeta significativamente a forma como as células respondem ao seu meio ambiente. Um crescente corpo de pesquisa é, assim, dedicado a elucidar o efeito de rigidez do substrato sobre o destino de vários tipos de células, incluindo células estaminais 2,3 4 Como resultado., Vários hidrogéis têm sido desenvolvidos para auxiliar no entendimento de células dependente de rigidez biologia incluindo poliacrilamida (PA), 5-7 polietileno glicol (PEG), 8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), 10 e 11 de alginato. Embora a evidência de que a rigidez substrato tem um impacto substancial sobre o destino celular está crescendo, a maioria dos estudos são realizados em uma pequena escala com um pequeno número de samples. Multidimensionais, estudos sistemáticos sobre o efeito da rigidez substrato para uma variedade de tipos de células ou condições ambientais são raros. 12

Várias tecnologias de hidrogel de alto rendimento promissoras foram desenvolvidas, incluindo microarranjos baseados em PEG, 13 dispositivos microfluídicos para a produção de microesferas de agarose de hidrogel, 14 ou micro e nano-hastes onde rigidez é modulada pelo diâmetro e altura das microrods. 15 No entanto , as tecnologias para preparar tais substratos são sofisticados e disponível para um número limitado de laboratórios. Muita pesquisa envolvendo rigidez modulado respostas das células utiliza poliacrilamida (PA) géis que não só são baratos e simples de implementar, mas também exibem uma gama fisiologicamente relevante de módulo de Young, a saber, 0,3 -. 300 kPa 16-22 No entanto, os métodos existentes para fabricar PA géis para cultura de células são intensivos de trabalho e, consequentemente, prepared em pequenos lotes. Algumas das dificuldades associadas com a preparação de géis PA como substratos de células-tronco a partir da exigência de que os géis tem que estar preparado: 1) na ausência de oxigênio para permitir a polimerização completa, 2) com uma superfície plana e lisa para permitir a célula uniforme ligação e de espalhamento, e 3) fixada permanentemente na parte inferior da placa de cultura de células para prevenir flutuação.

Diversos grupos tentaram produzir géis PA para cultura de células em grandes lotes. Semler et al., Folhas de espessura preparados de géis de PA, que foram depois "cortado" com um furador e colocadas em placas de 96 poços. 23 No entanto, este método está limitado a géis mais duras, ou seja,> 1 kPa no módulo de Young, porque mais suave géis são "pegajoso", difícil de cortar, e facilmente danificada. Mih et ai. Desenvolveram uma técnica mais sofisticado que permite que os géis a ser polimerizado directamente em uma placa com múltiplas cavidades com fundo de vidro. 6 Isto foi conseguido através de derramamento as soluções de gel em placas com fundo de vidro funcionalizados e formando géis por "imprensando-los" com uma matriz lamela personalizado. 6 embora muito promissores, efeitos ligeira vantagem ainda foram observados com esta técnica. Além disso, a técnica requer uma matriz de design personalizado não imediatamente acessível para muitos laboratórios, bem como placas com múltiplas cavidades com fundo de vidro caros.

Este artigo descreve uma maneira simples e barata para montar géis PA em um prato com vários poços que poderiam ser facilmente adotado por qualquer laboratório. Aqui, um suporte de plástico flexível é utilizado, que tem dois lados - um um hidrofóbico, que é repelente para géis de PA, e um uma hidrofílica, que liga covalentemente o gel PA sobre deposição. Uma vez que as folhas de gel de PA são depositados e permanentemente fixo ao suporte de plástico flexível, que permite manipular géis de qualquer espessura ou rigidez e cortando-os em qualquer forma desejada. Este aproxoach não só produz personalizados lamelas '' plásticas em tamanhos não anteriormente disponíveis no mercado, mas também elimina a necessidade de superfícies de vidro-tratamento pré, quer lamelas de vidro ou os poços de placas de múltiplos poços com fundo de vidro caros, com uma solução de ligação PA, que é uma tediosa e um passo consumidor de tempo. Finalmente, as folhas de geles uniformes PA pode ser preparado em grandes lotes e armazenados de-hidratado durante vários meses.

Em resumo, o ensaio aqui apresentado constitui uma melhoria em relação aos métodos existentes em vários aspectos. Em primeiro lugar, o processo de montagem de placa de poços múltiplos é eficaz, e o custo global dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os hidrogéis são produzidas em grandes lotes de um único filme em gel homogénea. Finalmente, apenas os materiais que se encontram comercialmente disponíveis são necessários. A utilidade do ensaio é ilustrada a explorar o efeito da rigidez do substrato na morfologia celular e a área de difusão.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de Soluções de Hidrogel Alíquotas e associadas

  1. Preparação da solução precursora de gel de poliacrilamida.
    1. Preparar solução precursora em gel de poliacrilamida através da mistura de acrilamida (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), a bisacrilamida reticulador (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), e de- água ionizada nos percentuais de volume especificados na Tabela 1.
      NOTA: Estas soluções podem ser preparadas em grandes lotes e guardadas a 4 ° C durante até vários meses.
      1. ATENÇÃO: A acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente, quando em forma de pó: assim, de preferência, utilizar 40% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (<23 ° C, área bem ventilada).
      2. CUIDADO: bis-acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente,quando na forma de pó: assim, utilizar de preferência 2% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (<4 ° C, área bem ventilada).
  2. Preparação e utilização de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) alíquotas. CUIDADO: Sulfo- SANPAH causa irritação ocular grave; lidar com luvas e adequada para os olhos ou a protecção face. Armazenar a -20 ° C após o recebimento e antes de alíquotas.
    1. Para armazenar sulfo-SANPAH: dissolver Sulfo-SANPAH em dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alíquota da solução estoque em tubos de centrífuga de 50 micro de 20 ul por tubo. Congelamento flash em gelo seco ou em azoto líquido (um passo opcional, mas preferido para preservar a máxima eficiência reticulador) e armazenar a -80 ° C.
      NOTA: As alíquotas can ser armazenados durante vários meses.
    2. Para utilizar sulfo-SANPAH: descongelar o brevemente aliquota e diluída em 480 ul de água desionizada. Use imediatamente. Sulfo- SANPAH hidrolisa rapidamente em água; por isso tome cuidado para realizar todas as etapas acima rapidamente.
  3. Preparação de persulfato de amónio (Mr 228,18 g / mol) alíquotas.
    NOTA: persulfato de amónio causa dos olhos, pele e irritação das vias respiratórias. Use equipamento de proteção individual adequados ao manusear. Pega de persulfato de amónio em pó em um exaustor química. Pó Armazenar em local seco, bem ventilado. Uma vez aliquotas, a solução diluída pode ser utilizada na bancada de trabalho.
    1. Dissolve-se o persulfato de amónio em água desionizada para se obter uma concentração final de persulfato de amónio de 10% w / v. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Descongelar imediatamente antes da utilização.
  4. Preparação de colágeno tipo I solução.
    1. Preparar solução de colagénio a 0,2 mg / ml por diluição do stock assimlução em 1x tampão fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Guarde em breve gelo ou usar imediatamente após a diluição.

2. Preparação Hidrogel (Veja a Figura 1)

  1. Preparação das lâminas de vidro hidrofóbicas.
    1. Coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e usar papel de seda para se espalhar por toda a superfície. Deixe o ar seco e limpe com um lenço de papel novamente para uniformizar o revestimento hidrofóbico.
      NOTA: Loja solução hidrofóbica em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Use equipamento de proteção individual ao manusear. Trabalhar em uma área bem ventilada.
  2. Preparação do suporte de plástico flexível.
    1. Cortar o suporte de plástico flexível para corresponder ao tamanho da placa de vidro com revestimento hidrofóbico.
    2. Marcar o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível, arranhando a superfície levemente com uma ferramenta afiada, como um bisturi.
      NOTA: Uma vez que o gel - que é totalmente transparente - Seca, As marcas de arranhões vai ajudar a distinguir de que lado o apoio de plástico flexível contém o gel.
      NOTA: O suporte de plástico flexível tem um lado hidrofóbico e um hidrofílico. Uma vez depositado, poliacrilamida adere permanentemente ao lado hidrofílica do suporte de plástico que facilita o manuseio fácil hidrogel subseqüente.
  3. Preparação de Gel (exemplo volumes são dados para 5 ml de soluções precursoras de gel).
    NOTA: 5 ml seria suficiente para produzir 40 ~ géis quando a espessura inicial de gel é de 0,5 mm. Mais géis podem ser produzidos, se a espessura do gel é reduzida.
    1. Colocar 4972,5 ul de solução precursora de poliacrilamida de concentração final desejada (Tabela 1) para um tubo de 50 ml. Colocar em uma câmara de desgaseificação durante 30 minutos, com a tampa aberta.
      NOTA: O oxigênio age como uma armadilha de radicais livres e, quando presente, ele inibe a polimerização.
    2. Adicionar 25 ul de 10% w / v de persulfato de amónio (ver ponto 1.3) para alcançar a solução definitivapersulfato de amónio concentração de 0,05%.
    3. Adicionar 2,5 mL de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED, M r 116,24 g / mol) para a solução de gel desgaseificado para obter uma concentração de TEMED final de 0,5%.
      NOTA: Loja TEMED em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Manusear de um fume hood química quando vestindo equipamentos de proteção individual adequados. Manter hermeticamente fechada sob um gás inerte, uma vez que é altamente sensível à humidade e ar.
    4. Misture a solução suavemente por pipetagem cima e para baixo 3-5 vezes. Não vórtice para evitar a difusão do oxigênio na solução precursor gel.
    5. Pipeta a solução de gel para o lado hidrofílica do suporte de plástico flexível e sanduíche com hidrofóbica revestido lâmina de vidro. Separa-se as duas lâminas com espaçadores de silicone de espessura desejada (por exemplo, 0,5 mm). Deixar um pequena quantidade (~ 100 mL) de solução de precursor de polímero no tubo de 50 ml para usar como um indicador de gelificação.
      NOTA:Qualquer espaçador pode ser utilizado. Por exemplo, uma única tira de Parafilm dá uma espessura de gel inchado definitiva entre 100 - 120 um.
    6. Coloque outra placa de vidro em cima do sanduíche apoio / gel de plástico flexível para averiguar uma superfície uniforme hidrogel após polimerização.
    7. Deixe o gel polimerizar durante 45 minutos, embora menos tempo pode ser usado para géis de maior% em peso, se desejado. Para verificar se o gel tenha polimerizado, observar a solução restante no tubo de 50 ml; se a solução restante foi gelificada, então é provável que a gelificação na placa de vidro ter sido iniciado assim. No entanto, note que a abertura prematura do molde vai evitar a polimerização completa.
    8. Uma vez formado o gel, retire o suporte de plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente ligado no topo, e do lado do gel de definir-se secar ao ar.
      NOTA: convecção de calor ou de secagem também podem ser utilizados para acelerar este passo. Depois secou-se sobre o suporte de plástico flexível, o gel pode ser lojad indefinidamente.
      1. Marcar algum ponto desencapado do suporte de plástico flexível, onde géis de poliacrilamida não formam devido a bolhas. Mark, enquanto o gel ainda é hidratado, pois isso vai misturar-se com o apoio de plástico flexível, uma vez que o gel é seco.

3. Assembléia Multiwell Plate, Collagen Coating, e Esterilização

  1. Conjunto da placa Multiwell.
    1. Uma vez seca, cortada géis PA nas formas desejadas.
      1. Para uma placa de 96 poços, usar um furador pesado com um diâmetro de ~ 6 mm. Use um cortador de papel pesados ​​para cortar géis em formas quadradas ou retangulares. Como alternativa, use uma tesoura.
    2. Prepare a cerca de 500 ul de PDMS por placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Para os geles de cola para a parte inferior de uma placa com múltiplas cavidades, colocar uma pequena gota (~ 5 mL) de polidimetilsiloxano (PDMS) no centro de cada poço a. Utilizando uma pinça, coloque uma poliacrilamidae gel em cada lado de suporte de plástico bem, flexível para baixo. Para permitir que o PDMS para curar, deixar a placa montada a 37 ° C durante um mínimo de 4 h.
  2. Revestimento de colagénio de géis de poliacrilamida.
    1. Com uma pipeta de transferência, coloque uma pequena quantidade (7-8 ul) de sulfo-SANPAH (vide ponto 1.2.2) em cada poço e redemoinho de lado a lado para revestir a superfície do gel uniformemente. Trabalhe rapidamente desde sulfo-SANPAH não é estável em água.
    2. Colocar a placa bem sob uma lâmpada de UV de alta intensidade (intensidade = 37 mW, λ = 302-365 nm) durante 5 min. Lavar os géis com PBS para remover o excesso de sulfo-SANPAH.
    3. Pipetar 50 ul de 0,2 mg / ml de colagénio tipo I solução (ver ponto 1.4) em cada poço. Deixar a placa coberta à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas ou O / N a 4 ° C.
      NOTA: Para acelerar o processo de revestimento de colagénio, uma pipeta de transferência pode ser usado para adicionar a solução de colagénio. Tipicamente, 1-2 gotas da solução deve ser suficiente para completarly cobrir a superfície do gel.
    4. Deixar a placa com cavidades à temperatura ambiente durante pelo menos 2 h, para permitir a ligação do colagénio.
    5. Lavar com PBS para remover o excesso de solução de colagénio e esterilizar sob UV (λ = 200 nm) num capuz de cultura de tecido durante 2 horas.
    6. Mergulhe os géis em meio completo (veja seção 4.1 para médias composição) O / N para hidratar e equilibrar. Use para celular semear imediatamente ou guarde na geladeira por até 2 dias.

4. Sementeira celular no PA Rigidez Assay

NOTA: Embora típico para linhas de células de mamíferos comuns, o protocolo apresentado nesta seção é usado especificamente com o câncer de mama linha de células MDA-MB-231 (ver Figuras 4 e 5).

  1. Recolher as células a partir de frascos de cultura de tecidos por exposição a 5% de tripsina / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cada cm 2 de área garrafa de cultura; por exemplo, utilizar 2 ml de tripsina / EDTA fora T25 frasco de cultura de células. Re-suspender as células recolhidas em meio completo suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma concentração celular final desejado. Tendo em conta o tempo de duplicação celular, bem como a duração do tempo as células serão semeadas no ensaio, escolher uma concentração de células sub-confluente apropriado. Certifique-se de que o meio adicionado é o suficiente para submergir completamente os hidrogéis.
    NOTA: Uma vez que os hidrogéis foram pré-equilibrada em mídia (consulte a etapa 3.2.6) 100 mL de volume deve ser suficiente. Os volumes médios típicos usados ​​para placas com múltiplas cavidades deve ser suficiente uma vez que os geles tenham sido pré-equilibrada em meios na etapa anterior.
    NOTA: O ensaio seria adequado para qualquer tipo de célula dependente de fixação.
    1. Contar o número de células em microscópio invertido usando um hemocitômetro. Carga de 10 ul de suspensão de células em cada porta de hemacitómetro e a média da contagem de células a partir de, pelo menos, 8 quadrantes. Para obter oconcentração celular final, multiplicar o número de células por 10 4.
      NOTA: Os melhores resultados de contagem de células são obtidos quando o número de células em cada quadrante hemacit�etro é 20-50.
  2. Cultura das células para o ensaio de rigidez PA em um incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Recolher as células, quando necessário por exposição a 5% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cm2 de garrafa de cultura de tecidos. Durante todas as etapas de manipulação celular, ter um cuidado especial para não perturbar a superfície do hidrogel: aspirado ou médio pipeta ligeiramente derrubando a placa com vários poços de lado e tocar a ponta da pipeta na parede lateral de cada bem, ao contrário de tocar o hidrogel.
    NOTA: Com excepção para tomar especial cuidado para não danificar a superfície do hidrogel durante a manipulação padrão de cultura de tecidos, as células semearam-se sobre o ensaio de rigidez podem ser manipulados da mesma maneira como se eles foram semeadas sobrepara uma placa com múltiplas cavidades regulares.

5. imagens de células semeadas em PA Rigidez Assay

  1. Células de imagem diretamente sobre o ensaio de rigidez PA.
    NOTA: Qualquer microscópio - invertido, fluorescente, ou confocal, pode ser usado para imagens de células.
    NOTA: O suporte de plástico flexível utilizado para construir o ensaio de rigidez é totalmente transparente e não autofluoresce ou interferir com imagens de células. No entanto, apesar de o próprio suporte de plástico flexível é transparente, capacidades de imagem será limitada pela distância de trabalho do objectivo. O suporte de plástico flexível tem uma espessura de 0,23 mm e uma distância de trabalho típico de uma objectiva 10X é ~ a 4 mm, para diminuir acentuadamente maiores ampliações.
    1. Para imagens de células vivas, a posição de ensaio de rigidez PA no suporte da placa de microscópio e imagem. Mantenha as sessões de imagem com menos de 2 horas, ou usar um microscópio equipado com uma câmara ambiental para tempos mais longos de imagem.
    2. Quando estou de células vivasenvelhecimento não é o objetivo, corrigir as células em solução de formaldeído 4% suplementado com 0,1% de detergente. Soak células em fixador à temperatura ambiente durante um mínimo de 2 horas. Enxágüe com PBS duas vezes. Descarte de resíduos fixador em um recipiente de resíduos designada.
      NOTA: As células podem ser visualizados de imediato ou armazenados submersa em PBS a 4 ° C durante até 2 semanas. CUIDADO: O formaldeído é tóxico por inalação e contato. Manusear com luvas em uma coifa química.
      NOTA: protocolo de fixação celular tem que ser escolhido com base nos coloração celular e manipulação de protocolos posteriores, porque certos fixadores danificar algumas proteínas celulares.
    3. No caso da imagiologia fluorescente, mancha células com coloração de células desejada directamente na placa com múltiplas cavidades fixo. Imagem imediatamente.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poliacrilamida (PA) hidrogéis são amplamente usadas para testar as respostas celulares dependentes de rigidez. 17,24 por mistura de várias concentrações de acrilamida (A) e bis-acrilamida (B) pode-se fazer géis PA que abrangem a gama de rigidez da maioria dos tecidos moles em o corpo - 0,3 -.. 300 módulo de kPa Jovem 1 No entanto, a preparação de géis de poliacrilamida é tedioso e demorado, muitas vezes limitando a sua utilidade em aplicações "high-throughput", como para a seleção exemplo droga

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geles de poliacrilamida, originalmente desenvolvidos para electroforese, 28 são rotineiramente utilizados como substratos de cultura celular para estudar os efeitos de rigidez do substrato sobre a morfologia celular, motilidade, 3,24,29 e comunicação entre outras características celulares. Poliacrilamida permite a manipulação de rigidez do substrato para abranger a rigidez de todos os tecidos moles do corpo (0,3-300 kPa) 1 com uma simples mudança na concentração de precursor de polímero ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya Zustiak pela Universidade de Saint Louis, bem como por uma bolsa do Fundo de Pesquisa do Presidente (PRF) concedida à Dra. Silviya Zustiak pela Universidade de Saint Louis. Agradecemos a Naveed Ahmed e Keval Shah pela assistência técnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
40% AcrilamidaBio-Rad161-0140
2% Bis-acrilamidaBio-Rad161-0142
Persulfato de AmônioBio-Rad161-07000
TEMEDSigma AldrichT9281
Sulfo-SANPAHThermo Scientific22589
Colágeno Tipo 1, de cauda de rato, 3,68 mg/mlBD Biosciences354236
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher ScientificBP231-100
Solução hidrofóbica — Repel SilaneGE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4HyCloneSH30256.01
Polidimesilsiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Slygard 182]Adesivos Elsworth3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)Sigma Aldrich44174
RPMI-1640 Médio (1x)HyCloneSH30027-02
Soro bovino fetalHyCloneSH30073-03
Penicilina estreptomicinaMP Biomedicals1670046
Detergente: Triton-XSigma AldrichT8787
Solução de formaldeído a 37%Sigma AldrichF1635
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichA2153
Kit de bloqueio de adesão celular baseado em BSA — Kit de Matriz de Adesão de Células ECMChemicon InternationalECM540
Equipamento de laboratório descartável
suporte de plástico flexível — Filme GelBond PAG para Géis de PoliacrilamidaGE Healthcare Bio-Sciences309819
Placas de VidroSlumpysGBS4100SFSL
tubos cônicos de 50 mlFisher Scientific3181345107
tubos cônicos de 15 mlFALCON352097
Tubos de microcentrífugaFisher Scientific2 ml: 02681258
placa de 96 poços (fundo plano)PipetasDescartáveis 12565501
Scientific (1  ml, 2  ml, 5  ml, 10  ml, 25  ml, 50  ml)Fisher Scientific1 ml: 13-678-11B, 2  ml: 05214038, 5  ml (FALCÃO): 357529, 10  ml: 13-678-11E, 25  ML: 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
Pipetas de Transferência de VidroFisher Scientific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pontas de Pipeta (1-200  μ l, 101-1000  μ l)Pipetas
Fisher ScientificParafilm
PARAFILM PARAFILM PM992
Luvas de exame sem póQuest92897
Espaçadores de silicone — Folha de silicone, 0,5 mm de espessura/13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0,5
Equipamento de laboratório grande/não descartável
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)Zeiss3820005619
Microscope SoftwareZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Forno UVUVITRONUV1080
Câmara de vácuo/desgaseificadorBelArt999320237
Bomba de vácuo para desgaseificadorKNF Lab5097482
Capa de cultura de tecidosNUAIRENU-425-600
Capela-exaustão químicaKEWAUNEE99151
Microscópio invertido (Axiovert 25)Zeiss663526
IncubadoraNUAIRENU-8500
Auxiliar de pipetaDrummond Scientific Co.P-76864
HemacitômetroBright-Line383684
Fisher de Transferência Descartáveis Padrão de Plástico 2707509

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929(2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107(2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905(2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

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