A identificação luminescente de elementos funcionais em regiões 3' não traduzidas (3'UTRs) (3'LIFE) é uma técnica para identificar a regulação funcional em 3'UTRs por miRNAs ou outros fatores regulatórios. Este protocolo utiliza metodologia de alto rendimento, como transfecção de 96 poços e ensaios de luciferase, para rastrear centenas de interações putativas quanto à repressão funcional.
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Artigo de método
Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3'LIFE
Neste artigo
Resumo
Resumo
Luminescente Identificação de elementos funcionais em 3'UTRs (3'LIFE) permite a rápida identificação de alvos de miRNAs específicos dentro de uma matriz de centenas de 3'UTRs consultados. Identificação do alvo baseia-se no ensaio de luciferase dupla, que detecta a ligação ao nível do ARNm por medição da produção de translação, dando uma leitura funcional de miARN alvo. 3'LIFE usa buffers não-proprietários e reagentes, e bibliotecas repórter publicamente disponíveis, tornando as telas do genoma viável e rentável. 3'LIFE pode ser realizada quer num ambiente de laboratório padrão ou ampliados usando robôs de manipulação de líquidos e outros instrumentos de alto rendimento. Nós ilustrar a abordagem que utiliza um conjunto de dados de 3'UTRs humanos clonados em placas de 96 alvéolos, e duas miARNs de teste, deixa-7c e miR-10b. Nós demonstramos como realizar a preparação de DNA, transfecção, cultura de células e ensaios de luciferase em formato de 96 poços, e fornecer ferramentas para dadosanálise. Em conclusão 3'LIFE é altamente reprodutível, rápida, sistemática e identifica alvos elevados de confiança.
Introdução
O objetivo geral deste método é detectar e mapear precisamente microRNA (miRNA) em alvos de alto rendimento. MiRNAs são ARNs endógeno não-codificantes ~ 22 nucleótidos de comprimento. Após a transcrição e processamento, miARNs maduros são incorporadas num complexo proteína chamada o ARN de silenciamento induzido complexo (RISC). Cada miRNA orienta o RISC de elementos localizados principalmente nas regiões 3'untranslated (3'UTRs) de RNA mensageiro (mRNA) alvo, resultando em repressão ou tradução ou clivagem mRNA 1. Mirna reconhecer sites de destino com base no padrão de Watson-Crick e G: U oscilar base emparelhamento, e são degenerados na natureza, ....
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Protocolo
1. Cultura celular (24-48 h antes da transfecção)
- 24-48 h antes da transfecção as sementes uma quantidade suficiente de células HEK293T com base no número de placas de 96 poços a ser transfectada.
NOTA: Para transfecções consistentes, as células em placas a uma densidade suficiente para favorecer a divisão rápida, ainda não estar em mais do que 70-90% de confluência no momento da transfecção. - Cada placa de 96 poços requer 9 x 10 6 células (75.000 células por poço, e 120 poços por placa para ter em conta o uso de reservatório e pipeta multicanal). Calcular o tempo de duplicação de células HEK293 (tipicamente ~ 20 h), e seme....
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Resultados
O arquivo de saída lumin�etro contém medidas brutos para ambas as proteínas vaga-lume e Renilla luciferase. Este formato bruto é compatível com o "3'LIFE - análise de placa única" e "3'LIFE - análise multiplate" planilhas disponíveis no site do laboratório Mangone ( www.mangonelab.com ). A única planilha análise placa calcula automaticamente vaga-lume rácio / Renilla, normaliza cada miRNA para o controlo negativo adequado, e normaliz.......
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Discussão
O ensaio 3'LIFE identifica alvos miRNA funcionais em 3'UTRs em high-throughput. Este ensaio é útil para investigadores que desejam identificar experimentalmente um grande número de possíveis alvos para a sua miARN de interesse. O ensaio 3'LIFE é uma abordagem poderosa para consultar 3'UTR regulação accionado, em que o ensaio fornece uma medida funcional de miARN direccionamento, e o teste de binário de um único repórter :: 3'UTR contra um único miARN pode confiantemente tratar o estado de direccionam.......
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Divulgações
Este trabalho é apoiado por fundos da Faculdade de Artes e Ciências Liberais e do Instituto de Biodesign da Universidade Estadual do Arizona e da Bolsa de Pesquisa Exploratória/de Desenvolvimento do NIH 1R21CA179144-01A1.
Agradecimentos
Agradecemos a Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer pelos conselhos e discussões. Karen Anderson, John Chaput e Josh LaBaer por compartilhar reagentes e instrumentação, Michael Gaskin e Andrea Throop por aconselhamento técnico e protocolos. Justin Wolter é um estudioso de Maher e agradece à família Maher por seu generoso apoio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| glicilglicina | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferina | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazina | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilina/Estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| de T2600000 | Tripsina | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| Placa de minipreparação de 96 poços | Pall | 8032 | |
| Placas de transporte de 96 poços | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instrumentos | |||
| Leitor de placas GloMax de 96 poços | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Robô manipulador de líquidos | Beckmann | A31842 | |
| Unidade central 4D-Nucleofector | Lonza | AAF-1001 | |
| Sistema de transporte de 96 poços | Lonza | AAM-1001 | |
| Contador de células Condessa | Invitrogen | C10227 |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (680....
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Reimpressões e permissões
