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NOTA: Masculino camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) são de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) E manipulados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de CHU Sainte-Justine Animal Care. Rato explantes de tecido dos brônquios fornecer uma boa fonte de células epiteliais brônquicas primárias para investigar os efeitos pró-apoptóticos de LMPS em células epiteliais. Este protocolo descreve a geração in vitro de LMPS, bem como um método para detectar células apoptóticas epiteliais brônquicas em explantes de tecido tratados com LMPS. Este protocolo é composta de 3 seções.
1. LMPS produção e caracterização
NOTA: Para evitar a contaminação, garantir que todos os materiais utilizados no experimento são estéreis ou autoclavado. Execute todas as etapas na RT em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis, salvo indicação em contrário.
1.1) Estímulo e Recolha de MPs9
- Descongelar uma aliquota de 10 milhões de células T CEM em um banho de água a 37 ° C. Dilui-se em 10 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo, em um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 200 gx 5 min isento de soro. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de pré-aquecido.
- Transferência de células para um balão de cultura de tecidos T75 (para as células em suspensão) com 15 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo e incubar durante 4 dias numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após 4 dias, transferir todo o meio de cultura e as células para um balão de cultura de tecidos T175 contendo 100 ml de meio fresco. Continuar a incubação das células durante cerca de 72 horas sob as mesmas condições até terem crescido até uma densidade de 2 milhões de células / ml.
- Células uniformemente dividida entre quatro frascos T175 contendo cada um 150 ml de meio fresco e continuam até que as células de cultura de células foram cultivadas (aproximadamente 48 horas de incubação) a uma densidade de 2 milhões / ml.
- 6 células para um novo frasco T175 contendo 150 ml de meio fresco, para manter a 2 milhões / ml de densidade celular.
- Adicionar actinomicina D (dissolvido em DMSO a 2 mg / ml) ao meio, numa concentração final de 0,5 ug / ml e incubar durante 24 horas.
- Transferir todo o meio de cultura para tubos cónicos de 50 ml e girar para baixo as células a 750 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante para 50 ml tubos cónicos e centrifugar a 1500 xg por 15 min para remover fragmentos de células grandes.
- Transferir o sobrenadante para um frasco de 250 ml e ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Desprezar o sobrenadante e recolher pellets.
- Lavar peletes LMPS enriquecido com 40 ml de PBS estéril num tubo de 50 ml por centrifugação a 12.000 xg durante 50 min. Repita esta etapa duas vezes.
- Recolher o último sobrenadante da lavagem; ele será usado como controlo do veículo. Suspender as pastilhas em 1 LMPSml de PBS e transferir para um microtubo de 1.5 ml estéril. Alíquotas e armazenar LMPS isoladas a -80 ° C (para evitar múltiplos ciclos de livre-descongelamento).
1.2) Caracterização de MPs via Análise FACS 4
- Preparar 2 amostras de tampão de anexina, com uma e outra sem CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, mais ou menos 5 mM de CaCl2.
- Filtro de tampão de FACS e anexina fluxo do fluido do invólucro através de um filtro de 0,22 um para remover as partículas.
- Dilui-se 1 ul de LMPS em 44 ul de tampão de anexina com CaCl2 a 5 mM para um tubo de FACS. Preparar outro tubo com 1 ml de LMPS em 44 ul de tampão de anexina sem CaCl2 (controle negativo).
- Adiciona-se 5 ul de annexinV-Cy5 em cada tubo e misturar bem. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Parar a reacção por diluição da mistura com 400 ul de fluido de revestimento de fluxo FACS em cada tubo.
- Adicionam-se 10 ul (200000 pérolas), de 7 mm de contagem beasuspensão ds como padrão interno em cada tubo para se obter uma contagem absoluta.
- Estabelecer portas do tamanho relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) e granularidade relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de pontos no citômetro de fluxo utilizando partículas fluorescentes calibrado de tamanho de 1 mm (portão 1) e contando grânulos portão 7 mm (portão 2).
- Analisar a amostra LMPS em FSC-H enredo / SSC-H usando os portões estabelecidos e FL-4 canais para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de pontos, através da aquisição de um sinal de até 20 mil contas de contagem são alcançado em portão 2.
- Determinar os eventos positivos de annexinV LMPS em tampão de anexina contendo CaCl 2 e em seguida subtrair os eventos de LMPS em tampão de anexina sem CaCl2 (controle negativo).
- Calcula-se o número absoluto de MPs com base na seguinte equação:
1.3) Determinação do MP Protein Concentração (Ensaio de Bradford)
- Prepare a 5 diluições em série de um padrão de proteína 1,25-20 ug / ml. Pipetar 800 ul de cada solução padrão e amostra para um tubo de ensaio limpo em duplicado. Adicionar 200 ul de reagente corante de Bradford a cada tubo. Misture bem, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Medir a absorvância a 595 nm. Determinar a concentração de proteína de LMPS utilizando a regressão linear da curva padrão.
2. explantes tecido brônquico e Tratamento LMPS
NOTA: Preste atenção especial para o ambiente de trabalho estéril, e assepticamente preparar as soluções e médio utilizadas nos seguintes experimentos. Para preparar o meio de cura completa, adicionar 1 ml de tecido em cicatrização Médias Suplementos com Serum (descongeladas em gelo) a 100 ml Tissue Cura Médio e misture bem.
2.1) Preparação de explantes de tecidos bronquiais
- Antes de cultura, arranhar 6 áreas de 1 cm 2cada um na extremidade da superfície de cada 100 milímetros prato de cultura de tecidos com uma lâmina de bisturi. Casaco cada riscado 100 mm de prato de cultura de tecido com 2 ml da solução de revestimento de prato de cultura, e incuba-se a placa em uma incubadora de CO 2 humidificado O / N a 37 ° C. Vacuum aspirar a solução excedente e encher o prato com 15 ml de lavar roupa Tissue Medium.
- Eutanásia camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) por inalação de CO2 de acordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética do cuidado animal.
- Assepticamente dissecar tecido pulmonar com bisturi, Dumont super fino pinça e tesouras cirúrgicas. Remova cuidadosamente vasos do parênquima e do sangue. Coloque o tecido pulmonar em gelada Tissue lavar Médio para o transporte para o laboratório, se for o caso.
- Além disso dissecar brônquio submerso no meio de lavagem de tecidos e separar o brônquio com um diâmetro de 1 a 2,5 mm a partir de tecidos periféricos de pulmão. Fatia tecidos bronquiais em ~ 5 milímetros anéis brônquica grossas com um bisturi.
Use um movimento de escavar com as estéreis forceps microdissecting curvas para pegar os fragmentos dos brônquios e colocá-los para as áreas riscadas dos pratos. - Remover o meio de lavagem de tecidos, e os fragmentos incubar à temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que adiram aos pratos.
- Adicionar 10 ml de meio de cura completa para cada prato e coloque-os em uma atmosfera controlada câmara incubadora modular. Lave com a câmara de mistura de gás de alta O 2 (70% de O2, 25% de N2 e 5% de CO 2,). Coloque a câmara numa incubadora orbital de bancada e agite-o a 37 ° C. Agitar a câmara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que a forma de fluir de forma intermitente ao longo dos fragmentos.
- Após 24 horas de incubação, observar os explantes de tecido sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida. Selecione explantes brônquica, com completa, movimento cabelos finos e animada epitélio brônquico para tratamento LMPS subseqüente.
2.2) Tratamento LMPS
- Prepare meio de crescimento completo como se segue: Crescimento de degelo suplementos médias com soro e de fibroblastos inibidor sobre gelo. Adicionar 1 ml de meio de crescimento os suplementos com soro e 200 ul de inibidor de fibroblastos a 100 ml de meio de crescimento; homogeneizar. Aquecer o meio de crescimento completo a 37 ° C durante 10 min antes da utilização.
- Diluir LMPS isolados em um novo tubo eppendorf estéril com PBS para preparar um estoque LMPS a uma concentração de 800 ug / ml.
- Adicionar 0,5 ml de Meio Completo Crescimento para cada poço de uma placa de 12 poços de cultura de tecidos.
- Transferir os explantes brônquicas seleccionados com os fórceps microdissecting curvas do protocolo anterior (secção 2.1) a cada poço da placa de cultura de tecido.
- Rotular a placa de cultura de forma adequada para identificar LMPS poços de tratamento e poços de controlo. Adicionar 25 ul LMPS estoque em cada tratamento bem LMPS (para uma concentração final de 40 ug / ml) e 25 ul de veículo de controlo (ver LMP s produção) aos poços de controlo.
- Continuar a incubação num incubador modular câmara de atmosfera controlada a 37 ° C com agitação suave.
- Após 24 horas, lavar explantes 3 vezes com PBS e avançar para a (fixação paraformaldeído a 4% [PFA]) próximo passo.
3. exame histopatológico
3.1) Prepare as seguintes soluções antes de prosseguir para as próximas etapas
- Preparar tampão PBS 1x por mistura de NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,76 mM, KH 2 PO 4, pH 7,4.
- Para preparar PFA a 4%, dissolver 20 g de PFA em 400 ml de água, aquecida a 60 ° C com agitação; adicionar algumas gotas de NaOH 10 M para limpar a solução. Em seguida adicionar tampão de PBS 1x e ajustar o volume para 500 ml e o pH a 7,4. Filtrar e alíquota; armazenar a -20 ° C.
- Prepare os seguintes reagentes de desidratação ou de reidratação; 100%, 90%, 70%, etanol a 50% e xileno.
e_step "> 3.2) Explant Fixation e Tissue Seção desparafinização
- Colocar cada explante num tubo de microcentrífuga marcado com 1,5 ml de 4% de PFA e incubar O / N a 4 ° C. Lavar os explantes duas vezes com PBS 1x.
- Desidratar explantes através de uma série de álcoois (etanol a 70%: 3 vezes 30 minutos cada; etanol a 90%: 2 vezes 30 minutos cada; etanol a 100%: 3 vezes cada 30 min, em seguida, o xileno: 3 vezes 20 min cada). Execute todas as etapas na RT em um exaustor.
- Imbed explantes de tecido em parafina a 58 ° C num forno. Prepare 5 mm de espessura de tecido usando um micrótomo rotativo.
- Float as seções em um banho de água a 56 ° C, e em seguida, montar as secções em lâminas histológicas marcados. Colocar as lâminas em cavaletes de coloração manuais e seco a 65 ° C durante 1 h. Permitir que os slides para esfriar em temperatura ambiente.
- Mergulhe as prateleiras em 4 pratos mancha consecutivos contendo xileno por 10 min cada, para remover a parafina. Mergulhar as prateleiras em uma série de etanol para remover o xileno: 100%, depois 95%, thpt 80%, em seguida, 70%, em seguida etanol a 50% (5 minutos para cada etapa). Lavar as cremalheiras com água da torneira durante 5 minutos para remover o etanol.
3.3) Hematoxilina e Eosina (H & E) Coloração
- Continue trabalhando com os cortes de tecidos fixos; colocar o suporte para um prato de coloração com hematoxilina de Mayer durante 15 min. Lavar o rack com água da torneira para remover Hematoxilina para 20 min.
- Colocar em água destilada durante 30 sec.Place em etanol a 95% durante 30 seg. Coloque em Eosina Y coloração solução prato para 1 min. Desidratar através de duas mudanças de etanol a 95%, etanol a 100%, e de xileno durante 2 min cada.
- Realize uma verificação rápida sob um microscópio para garantir que o excesso de eosina é removido. Coloque 2 a 3 gotas de Meio de Suporte (Fisher SP15-100) em cada slide, em seguida, cubra com uma tampa de vidro.
3.4) In Situ celular Detecção de morte: TUNEL Assay
- Antes de começar, preparar a solução de trabalho de proteinase K: 20 ug / ml emTris 10 mM / HCl, pH 7,4.
- Repita os passos 1 a 5 da secção 3.2 (fixação Explant e tecido seção desparafinização). Lavar as lâminas com deionizada H 2 O.
- Mergulhar as lâminas com 1x PBS durante 10 min. Escorra o excesso de PBS. Incubar as secções de tecido, durante 30 min à temperatura ambiente com uma solução de proteinase K a trabalhar. Lavar as lâminas duas vezes com PBS 1x.
- Realize o ensaio TUNEL conforme descrito no manual de instruções do kit de detecção de morte celular. Montar usando meio de montagem, e lamela manualmente com lamelas de vidro.
- Analisar amostras sob um microscópio de luz. Use Imagem Pro 4.5 para analisar as células em apoptose na cor marrom.