Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Resumo

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Resumo

Analisando as respostas fisiológicas de neurônios olfatórios (OSN) quando estimulados com ligantes específicos é fundamental para compreender a base dos comportamentos olfativos-driven e sua modulação. Estas propriedades de codificação dependem muito da interação inicial entre as moléculas de odor e do receptor olfativo (OR) expressa nas ORS. A identidade, especificidade e ligando espectro da expressa ou são críticos. A probabilidade de encontrar o ligando do ou expresso em um OSN escolhido aleatoriamente dentro do epitélio é muito baixo. Para responder a este desafio, este protocolo utiliza ratinhos geneticamente marcadas que expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de RUP definidos. ORS estão localizadas no epitélio apertado e organizada que reveste a cavidade nasal, com as células vizinhas influenciar a sua maturação e função. Aqui nós descrevemos um método para isolar um epitélio olfativo intacta e gravar através de gravações de patch-clamp as propriedades de ORS expressing receptores olfativos definidos. O protocolo permite que um para caracterizar as propriedades de membrana OSN, mantendo a influência do tecido vizinho. A análise dos resultados de patch-clamp produz uma quantificação precisa de ligando / ou interações, vias de transdução e farmacologia, propriedades de codificação 'ORS e sua modulação em nível da membrana.

Introdução

Neurônios olfatórios (OSN) representam o primeiro passo de percepção olfativa. Localizado no epitélio olfativo que reveste a cavidade nasal nos roedores, eles transformam a informação química dos odores em potenciais de ação enviadas através do seu axônio para o cérebro. Para compreender melhor os mecanismos de codificação olfativas, é necessário caracterizar as propriedades de transdução de membrana e de ORS. Até recentemente, a maioria das técnicas usadas para caracterizar as propriedades de ORS de mamífero foram realizadas em dissociado ORS ^1-4. O processo de dissociação usa vários (ou seja, enzimas) processos mecânicos e químicos para libertar os ORS de seu ambiente. Estes processos induzem um baixo número de células disponíveis para as gravações. Este número baixo pode ser ainda mais crítica no caso de células GFP rotulados. Dissociação também remove as interações locais célula-a-célula entre ORS e outras células do epitélio olfactivo, que pode melhorar survival e modulação das propriedades "ORS. A fim de evitar o procedimento de dissociação, uma preparação intacta foi desenvolvido ^5.

Cada OSN expressa um receptor olfativo (OR) seleccionados a partir de uma grande família multigene ^6. Há ~ 1000 RUP expressos no epitélio olfatório principal no mouse. Devido ao grande número de, ou em animais de tipo selvagem, as possibilidades para gravar ORS que expressam o mesmo ou são muito baixos. Para superar estas limitações, os ratinhos alvo do gene estão disponíveis em todas as ORS que expressam um identificado ou estão marcados com uma proteína fluorescente ^7-9. Estes ORS marcadas foram usadas para fazer análise funcional em preparações dissociadas ^7,10,11 com os inconvenientes mencionados anteriormente. Uma preparação epitélio intacto ⁵ de camundongos geneticamente marcadas, portanto, contorna essas questões. Ele permite o monitoramento da atividade de ORS expressam RUP definidos com precisão em um ambiente tão perto no vivo possível. Além disso, gravações de patch-clamp de ORS também permitir uma análise precisa das propriedades da membrana, via de transdução de farmacologia, ligando / ou interações. Todos estes tópicos dificilmente podem ser analisadas usando gravações extracelular. Nós usamos essa técnica para monitorar as respostas dos ORS que expressam os receptores olfativos SR1 e MOR23 ^12,13. A viabilidade da técnica foi confirmada por outros grupos em MOR23 expressam ORS ^14, bem como em outras RUP neurónios que expressam ^15,16. O controlo de uma população definida de ORS pode levar à análise das suas propriedades em muitos contextos diferentes, tais como o desenvolvimento ^{14, 17} envelhecimento, odorante induzida plasticidade ^18, e o papel de variações na sequência do receptor olfactivo, em odor de codificação ^15. Este protocolo proporciona assim uma ferramenta poderosa para monitorizar as propriedades funcionais de ORS definidas ao nível da membrana.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Université de Bourgogne e foi aprovado pelo comitê de ética Université de Bourgogne.

1. Os animais

1. Use geneticamente camundongos OR-IRES-tauGFP disponíveis no Laboratório Jackson. Estes murganhos foram desenvolvidos no laboratório Dr. Peter Mombaerts ', a fim de analisar a segmentação do axónio e desenvolvimento do sistema olfactivo ^19. Por exemplo, a linha MOR23-IRES-tauGFP, o número de ações 006.643, leva o nome oficial estirpe B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; Da mesma forma, a linha SR1-IRES-tauGFP, número de estoque 6717 leva o nome oficial B6; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. Em relação à idade dos animais: para um melhor resultado do protocolo, utilizar animais entre 2 e 4 semanas de idade. Nesta faixa etária, a dissecção é mais fácil (ossos mais macios, mais firme do epitélio olfatório) e os botões dendríticas são bigger comparar com animais mais velhos.

2. Preparação de eletrodos e Soluções

1. Para as pipetas estimulantes: compra prepulled estimulando pipetas. Caso contrário, prepará-los manualmente.
   1. Usando uma chama, dobrar um milímetro seis pipetas de vidro em cerca de 1 cm da ponta. Insira estes seis pipetas além de uma linha reta 7 ^th em 1,5 centímetros de calor encolher tubulação fortalecer por um orifício.
   2. Calor encolher o tubo para manter os barris ligados juntos. Anexar um tubo de calor psiquiatra adicional para a outra extremidade dos barris. Puxe este pipeta estimulante, com um puxador de multi-barril.
   3. Adicione um pouco de cola líquida branca à volta do orifício para fortalecer as pontas dobradas. Deixe secar O / N.
2. Prepare 1 ou 2 L de solução de Ringer extracelular normal (em mM: NaCl 124, KCl 3, _MgSO4 1,3, _CaCl2 2, _NaHCO3 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, glicose 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Mantenha a 4 ° Caté à sua utilização.
3. Preparar a solução estoque intracelular (em mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanossulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sacarose; pH 7,2 (KOH) e 310 mOsm. Manter a 4 ° C até à sua utilização. Bom para várias semanas.
4. Preparar a solução intracelular de gravação com nistatina extemporaneamente (no último minuto) antes de experimento.
   1. Pesar 3 mg de nistatina, adicionar 50 ul de DMSO; vortex 20 seg depois sonicar 2-3 minutos até completamente diluída.
   2. Adicionar 20 ul de solução de DMSO-de nistatina em 5 ml de solução de reserva intracelular. Vortex 20 seg, depois sonicar 3 min. Conservar esta solução a 4 ° C e proteger da luz direta, nistatina é sensível à luz. Esta solução pode ser utilizada por algumas horas. Substituir todos os dias.
   3. Uma vez que a preparação epitélio olfativo é sob o microscópio, tirar um pouco dessa solução em uma seringa de 1 ml com uma ponta amarela alongado-chama para preencher os eletrodos; proteger da luz direta. Uma vez que, à TA, a solução nistatinanão é estável; substituir a solução na seringa de 1 mL a cada hora ou mantê-lo em gelo.
5. Puxe eléctrodos de registo com um puxador de obter longo pescoço e uma pequena ponta (~ 2 mm) com uma resistência de 15-20 mohms com a solução de nistatina interno.
6. Preparar a solução odorante em 0,5 M em DMSO sob exaustor; aliquota e manter a -20 ° C até à sua utilização. Diluir odorante em solução de Ringer, até à concentração desejada. Encha a pipeta estimulante.

3. Preparação de epitélio olfatório

Nota: os ratos OR-IRES-tauGFP expressar o tauGFP sob o controlo do promotor OU. Nesses camundongos, todos os neurônios que expressam o OR de interesse são marcadas com GFP. Este protocolo é adaptado para as RUP expressos em todas as zonas. No entanto, dissecções e gravações são mais fáceis para as RUP expressas na zona dorsal.

1. Anestesiar os animais por injecção de uma mistura de cetamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg BODy de peso, respectivamente). Decapitação pode ser realizada com uma tesoura afiada para ratos jovens ou com uma guilhotina roedor mantido adequadamente para ratos mais velhos.
   1. Usando anel tesouras de dissecção fazer uma incisão medial longitudinal através da pele dorsal. Retire a pele, puxando-o para além. Usando a tesoura, corte as mandíbulas inferiores na articulação da mandíbula. Remover os dentes frontais superiores por um corte coronal paralelo aos dentes.
   2. Faça um corte coronal da cabeça atrás dos olhos e manter apenas a parte anterior da cabeça. Mergulhá-lo em solução de Ringer gelada para a dissecação sob o âmbito de aplicação.
2. Dissecar no âmbito: no lado ventral, faça um corte longitudinal ao longo do maxilar superior / os dentes. Cortar os ossos dorsais longitudinalmente, seguindo o lado dorso-lateral da cavidade nasal. Remover a maioria dos ossos e paladar; transferir o septo e o epitélio ligado a ele em oxigenado Ringer a RT.
3. Para a dissecção final: Logo antes de iniciar a gravaçãosessão, descascar o epitélio do septo subjacente com uma pinça. Retire o epitélio com uma pinça e com dois cortes 4-5 mm de tesoura (uso microvannas tesoura) na parte anterior do septo onde a adesão é mais forte.
   1. Retire cuidadosamente o órgão vomeronasal, cortando-a ao longo da sua ligação ao epitélio dorsal do septo. Transferir o epitélio para uma câmara de registo com a camada da mucosa voltada para cima; mantê-lo liso na câmara com uma harpa.
4. Câmara de instalar sob um microscópio vertical equipado com óptica de fluorescência e uma câmera sensível. Visualize a preparação na tela do computador com alta ampliação de 40X através de um objetivo de imersão em água (abertura numérica 0,8) e uma ampliação de 2X ou 4X adicional conseguido por uma lente de aumento. Perfundir continuamente oxigenado com Ringer a RT (1-2 mL / min).

4. A gravação da sessão

1. Procurar célula fluorescente: excitar a preparação em 480nm para EGFP, que emite luz no intervalo de 530-550 nm; alvo um botão dendrítica que é fiável visível na fluorescência e sob campo claro.
2. Preencha eléctrodo com solução intracelular com nistatina; remover as bolhas batendo suavemente sobre o eletrodo.
3. Insira eletrodo no suporte do eléctrodo, aplique pressão positiva na pipeta; A resistência deve ser de 15-20 mohms.
4. Traga eletrodo perto do celular; uma vez que a resistência atinge ~ 40 mohms, libere pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para chegar a um gigaseal.
5. Uma vez que o selo é atingido, definir o potencial de membrana a cerca de -75 mV;
6. Uma vez que a célula se abre, prosseguir com protocolos de estimulação, tratamentos farmacológicos. Para medir a resposta a uma única estimulação odorante, 200-500 ms ficha de actividade espontânea, para estimular a 500 ms e medir a resposta da célula para até 10 seg ^13. Para tratamentos farmacológicos, perfundir os agentes farmacológicos naa concentração desejada ^{de 20.}

Análise 5. Dados

1. Analisar as correntes induzidas por estimulação odorante como se segue: a amplitude máxima, o tempo de subida (tempo necessário para atingir 90% da amplitude máxima, em mseg), a corrente total (área sob a curva em Pas), a hora a 50% (tempo entre o início e o deslocamento da resposta a 50% da amplitude máxima, em mseg).
   1. Usando as correntes de pico de transdução (amplitude máxima atingida), em diferentes concentrações, desenhar e ajustar uma curva de resposta à dose utilizando a equação de Hill: Imax = I / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^n), em que I representa a corrente de pico , Imax a resposta máxima nas concentrações saturantes, K1 / 2 a concentração para a qual metade da resposta máxima foi alcançada, C a concentração do odorante e n o coeficiente de Hill.
2. Analisar gravações de potencial de membrana em pinça de corrente para a despolarização máxima, o total potencial provocada (área sob a curva em mVsec); registro de atividade spiking espontânea longo de 30 s para um mínimo de gravações; excitabilidade registro através picos gerado pela injeção de correntes (10/05 PA).

Resultados

O resultado deste protocolo depende da qualidade da dissecção. A dissecção passos deve ser curto (menos do que 10 a 15 min) e preciso (isto é, para evitar danos do epitélio). A figura 1 ilustra como uma preparação ideal parece em diferentes níveis de ampliação. Numa ampliação baixa sob condições de campo brilhante os diferentes tipos de células (tais como botões de células ORS, apoiando) são distinguíveis (Figura 1A). Ao mais alto nível de ampliação, normalmente 80X a 160X, em ...

Discussão

A capacidade deste protocolo para monitorar corretamente as propriedades de ORS saudáveis ​​depende muito da qualidade da preparação. Por conseguinte, os passos de dissecação são críticos. Em primeiro lugar, é fundamental prestar atenção à qualidade (pH, osmolaridade), oxigenação e temperatura (gelo-frio, mas não congelado) do meio de dissecção. Em segundo lugar, a manipulação do epitélio com ferramentas de dissecação deve ser tão limitada quanto possível, para evitar danos. Finalmente, é essencial para se obter uma pre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
mesa vibratória com gaiola de Faraday	TMC	63-500 SERIES	necessária: isola o sistema de gravação das vibrações induzidas pelo ambiente (movimentos do experimentador, vibrações de equipamentos como ventiladores para resfriamento de computadores, etc); também pode ser adquirido com uma gaiola de Faraday, ou equipado com uma gaiola de Faraday feita sob medida; esta gaiola é recomendada para evitar ruídos elétricos da
ótica
do ambientemicroscópio	Olympus	BX51WI	microcope vertical equipado com epifluorescência; platina fixa ou móvel, dependendo da preferência do usuário
objetivos	Olympus	LUMPLFL40XW	pelo menos 2 objetivos necessários: um 4X ou 10X para abordagem grosseira da célula; e um exemplo de imersão de 40X a longa distância Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM
lupa	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTAMENTE NECESSÁRIO: colocado no caminho da luz entre a objetiva e a câmera; permite ampliar a imagem na tela, a fim de alcançar precisamente o botão com a câmera de eletrodo de gravação
	Olympus	DP72	uma boa câmera é necessária para ver os neurônios em fluorescência, bem como em campo claro; o software de controle é simples e permite tirar fotos e fazer imagens da câmera ao vivo para monitorar a aproximação do eletrodo à célula. Uma câmera ultrassensível não é necessária
para filtrar	Olympus/Chroma		dependendo da proteína fluorescente usada nos camundongos; exemplo para GFP: excitação: BP460-490: emissão: amplificador HQ530/50m
	HEKA	EPC10 USB	monitora as correntes que fluem através do eletrodo de gravação e também controla o sopro enviando um sinal TTL para o spritzer; a configuração do EPC10 é controlada por
software	de computadorHEKA	Patchmaster	controla o amplificador durante o experimento
micromanipulador	Sutter	MP225	micromanipulador de precisão, permite movimentos precisos até 1/10 de um micrômetro; este modelo é muito estável; evite manipuladores hidráulicos que podem derivar
extrator de eletrodo	Sutter	P97	com um filamento de calha largo FT345-B;   preparar pipetas de gravação de cerca de 2 e micro; m de diâmetro com ponta longa para alcançar as células; a resistência deve ser de 15 a 20Mohm com vidro de solução de braçadeira de remendo perfurado
	Sutter	BF120-69-10	em nossas condições de gravação, este vidro é ideal para gravar pipetas
câmara de gravação	Warner Instruments	RC-26G	uma câmara é necessária para definir a preparação sob o microscópio. Para manter a preparação no centro da câmara, deve-se usar uma rede/âncora
			de estimulação
	WPI	TW100F-4	anexado em grupos de 7, estas pipetas são usadas para preparar pipetas estimulantes pré-puxadas
extrator multibarril	MDI	PMP-107-Z	por associação de puxar e torcer, este extrator nos permite preparar eletrodos de sopro com
injetor de pressão de precisão de 7 barris	Toohey Company	P/N T25-1-900 Canal Único	este injetor de pressão de precisão controla a pressão ejetada no extrator multibarril; é controlado manualmente ou pelo amplificador por um 5V  O
micromanipulador	Narishige	YOU-1	um manipulador grosseiro é suficiente para aproximar o eletrodo de sopro das tubulações do local de gravação
	Tubulação tygon N/A		para trazer a pressão do soprador para a pipeta de sopro
soluções/perfusão/produtos químicos
bomba de vácuo	gardner denver	série	300uma bomba de membrana vibratória é mais silenciosa e eficiente do que outros tipos de bombas
sistema de perfusão	N/A	N/A	sistema de perfusão por gravidade com tubulação de polietileno para trazer para dentro e para fora a solução externa da câmara de registro
nistatina	Sigma-Aldrich	N3503	obrigatória para perpare solução interna para patch clamp perfurado
DIMETIL SULFÓXIDO Sigma-Aldrich		D5879	usado para dissolver a nistatina para solução interna para adesivo perfurado;
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9625	solução extracelular
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P4504	solução intracelular/extracelular
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma-Aldrich	C7902	solução extracelular
Fosfato de sódio monobásico mono-hidratado (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	solução extracelular
Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	solução extracelular
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	solução extracelular
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6297	solução
extracelularEGTA (Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetracético)	Sigma-Aldrich	E3889	solução interna
Hidróxido de potássio	Sigma-Aldrich	P1767	solução interna
Metilsulfóxido	Sigma-Aldrich	W387509	solução intracelular
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	solução intracelular
intracelular	sacarose	Sigma-Aldrich	S0389