Artigo de método

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 de maio de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.

Resumo

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O adenovírus serotipo 5 (Ad5) tem sido extensivamente modificado com métodos tradicionais de transgenes para o desenvolvimento de vacinas. As eficiências reduzidas destes vectores Ad5 tradicionalmente modificados em ensaios clínicos que se correlacionam principalmente com Ad5 imunidade pré-existente (PEI) entre a maioria da população. Para promover o desenvolvimento da vacina vetorizada-Ad5, resolvendo a preocupação de Ad5 PEI, tem sido utilizada a inovadora estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Por mérito desta estratégia, Ad5-vectored que primeiro construiu o shuttle hexon plasmídeo HVR1-Seus Kwas-HVR5-6 / pH5S por subclonagem da região hipervariável (HVR) 1 de hexon num plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S, que tinha Sua 6 tag incorporada no HVR5. Este fragmento de DNA contendo um epitopo HVR1 ELDKWAS HIV foi sintetizado. 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-se então linearizado e co-transformada com o plasmídeo linearizado pAd5 backbone / ΔH5 (GL),para recombinação homóloga. Este plasmídeo recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His foi transfectado em células para gerar o vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Este vector foi validado para ter aptidão qualitativa indicado pelo título viral física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) e correspondente rácio / IP VP. Tanto o epitopo HIV e Sua 6 tag foram sobre a cápside de Ad5 expostos à superfície, e manteve-epítopo específico antigenicidade da sua própria. Um ensaio de neutralização indicada a capacidade deste vector para contornar divalente de neutralização pelo soro de Ad5-positiva, in vitro. A imunização de camundongos demonstraram a geração de robusta imunidade humoral específica para o epitopo HIV e Sua 6. Este estudo de prova de princípio sugerido que o protocolo associado com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação poderia ser viável utilizado para a geração de vacinas de Ad5-vectored diferentes, modificando as proteínas da cápside. Este protocolo poderia até ser futros modificado para a geração de rara do serotipo vacinas em vector-adenovírus.

Introdução

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Adenovírus humano (Ad) é, um vírus de tamanho médio não encapsulado com uma nucleocápside icosaédrica que contém um genoma de ADN de cadeia dupla. Ad pertence à família Adenoviridae, com uma classificação em sete grupos (A a G). Cada grupo contém vírus de diferentes serótipos. Dos quais, adenovírus serotipo 5 (Ad5) do grupo C tem sido o mais extensamente estudado e o mais amplamente aplicado para abordagens vectored como terapia genética e vacinação.

A estratégia transgene tradicional tem sido desenvolvido e aplicado para modificações de Ad5, que se caracteriza por o deslocamento dos genes precoces do vírus com um gene de interesse, e a expressão do gene focado de interesse num hospedeiro. Exemplos são a construção de pENV9 / Ad5hrΔE3 por substituição do gene inicial 3 (E3) com o gene rev de Simian Vírus da Imunodeficiência 1, a construção de AdCMVGag através da substituição do gene precoce 1 (E1) com o gene gag de Imunodeficiência HumanaVirus (HIV) 2, e a construção de lac Z por Ad substituindo E1 com o gene lac Z 3. A ampla aplicação da estratégia tradicional transgene em Ad5 depende dos seguintes méritos: a ampla gama de hospedeiros para Ad5, a engenharia genética viável sobre o vírus e propagação de vírus, o grande alojamento de inserção de genes estranhos ea segurança de Ad5 4,5. No entanto, as eficiências reduzidas de terapias clínicas Ad5-vectored por utilização desta estratégia tem sido um importante ponto de estrangulamento, que tem sido mapeada para ser associado principalmente com Ad5 PEI, uma vez que o Ad5 é tão prevalente entre a maioria de crianças e adultos 4,6.

Para vencer o principal estrangulamento de Ad5, o objetivo principal é desenvolver uma estratégia alternativa contornar Ad5 PEI. A imunidade inata 7, a imunidade adaptativa, tais como anticorpos neutralizantes (NAbs) 8-10 e CD8 + T respostas de células 10 contra Ad5 têm sido mostrados para contribute ao Ad5 PEI, com Ad5 NAbs aparecendo para desempenhar o papel dominante nas contribuições para Ad5 PEI 10,11. Além disso, Ad5 NABS epítopos alvo situadas em proteínas do capsídeo, incluindo o principal hexon proteínas, fibras e base penton. Dos quais, hexon é o principal alvo de Ad5 NAbs 8,11-13. Com base nestes resultados, uma estratégia de incorporação de antigénio da cápside inovadora foi introduzida. Esta nova estratégia destaca a substituição ou incorporação de proteínas-de-juros sobre proteínas do capsídeo de Ad5, que desloca ou mascara os epítopos neutralizantes Ad5, levando à diminuição do reconhecimento pelo NAbs e eficientes administrações vetor Ad5. É de salientar que esta estratégia é competitivo, porque ele também pode ajudar anfitriões provocar imunidade humoral robusta e imunidade celular potente diretamente por apresentar antígenos de interesse para o sistema imunológico 4,14,15. Com base nesta estratégia, a clonagem molecular e salvamento recombinante Ad vetor viral pode ser estruturalmente divididaem quatro etapas principais: (a) a preparação de fragmento do gene de interesse por qualquer reação em cadeia da polimerase (PCR) ou síntese; (B) a ligação do fragmento do gene num plasmídeo de transporte que contém o fragmento do gene de interesse e os braços homólogas a uma espinha dorsal adenovírus; (C) a recombinação homóloga por co-transformação do plasmideo de transporte contendo o fragmento do gene de interesse com a espinha dorsal do plasmídeo linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) a transfecção de plasmídeo linearizado adenovírus recombinante para resgatar o vector Ad recombinante incorporado com antigénios-de-interesse.

O nosso grupo e alguns outros já estendeu essa estratégia alternativa incorporação anúncio para Ad desenvolvimento da vacina vetorizada contra diferentes agentes infecciosos. Nós relataram a geração de um vector Ad recombinantes Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 por incorporação de um marcada com His de HIV-1 de antigénio para a região V3 de Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Este vector gerado desencadeada strong resposta imunitária humoral específica para o epítopo V3 4. Também relatou o desenvolvimento de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 através da incorporação de HIV-1 de membrana região ectodom�io proximal (MPER) na localidade de HVR2 hexon5 2. Além disso, o grupo do Dr. Zhou utilizou os benefícios desta estratégia de incorporação de anúncios para desenvolver serotipo ad 3 (Ad3) vacinas vetoriais, isto é., A geração do vector viral R1SP70A3 por incorporação de um epitopo neutralizante de SP70 Enterovírus 71 na HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gerado NAbs fortes e produção de IFN-γ específicos para o epitopo SP70, que levam à alta taxa de protecção contra o desafio 15 71 Enterovírus.

Para efeitos de referência técnica, nosso estudo se aproveitou da estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação qualitativa para se concentrar na geração de um bivalente Ad5 vetor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, incorporando um antígeno HIV-1 em HVR1 umda sua tag em HVR5 de hexon5. O vector viral gerada foi também avaliada imunologicamente. A estratégia de antigénio da cápside-A incorporação pode ser utilizada para o desenvolvimento de abordagens de vacinação contra o Ad5-vectored doenças infecciosas diferentes.

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Protocolo

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A Universidade de Alabama em Birmingham Institucional Uso de Animais e Cuidados Comissão aprovou o uso de ratos como aqui descrito sob o número de protocolo aprovado 101.109.272.

1. Genético Construção de um plasmídeo modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 com a Estratégia Capsid-Incorporação Antigen

  1. Construção do plasmídeo de transporte 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-
    1. Peça um plasmídeo contendo a sequência de ADN sintetizada HVR1-Kwas entre a locais de enzimas de restrição Agel para Accl do gene hexon5.
    2. Digerir 6 ug do fragmento sintetizado (HVR1-Kwas) com as enzimas de AgeI (6 unidades) e Accl (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C. Resolver o fragmento digerido em um 2% de gel de agarose por electroforese, e purifica-se o fragmento com um kit de extracção de gel de ADN de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Com base na razão molar de inserto para vector a 3: 1, utilizar ligase de ADN T4 e ligase de bpode ser prejudicado para ligar 12 ng do fragmento (HVR1-Kwas) em 100 ng de um plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S 17 num volume de 10 ul à temperatura ambiente durante 2 horas, através dos locais de AgeI e Accl.
    4. Transformar 1 ul dos 10 ul do produto de ligação em 50 ul de células DH5a electrocompetentes num electroporador (a 1800 V). Adicionar 950 ul de meio SOC para as células DH5a transformadas e incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C, com 300 rpm. Espalhe 100-200 ul da mistura de 1 mL de ágar Luria-Bertani (LB) contendo canamicina e incubar O / N a 37 ° C.
      1. À tela ~ 10 colônias por PCR visando o fragmento HVR1-Kwas, misturar o iniciador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT), primário (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) e uma única colônia DH5ct reverter em uma solução de mistura principal PCR (de acordo com o protocolo do fabricante). Amostras em um termociclador executado por referindo-se ao manual fornecido com a solução de PCR mistura principal.
      2. Use o primer forward (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para sequenciar o fragmento HVR1-Kwas nos clones selecionados na seção 1.1.4.1.
  2. Construção do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His
    1. Digest 6 ug de HVR1-Kwas HVR5-His-6 / pH5S com as enzimas EcoRI (6 unidades) e PmeI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C, e purifica-se o fragmento contendo braços de recombinação homóloga e o gene modificado hexon5 dupla, tal como indicado no passo 1.1.2. Linearizar o plasmídeo backbone pAd5 / ΔH5 (GL) com 16 SwaI.
    2. A co-transformar a 100 ng do fragmento de alvo a partir do plasmídeo de transporte e 100 ng do esqueleto linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) em 50 ul de células BJ5183 electrocompetentes para a recombinação homóloga num electroporador (a 1800 V). Adicionar 950 ul de meio SOC para as células transformadas e incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C, 300 rpm. Espalhe 100-200 uL da mistura de 1 mLno agar LB contendo canamicina (Final 50 ug / ml) de O / N incubação a 37 ° C.
      1. Escolha ~ 10 pequenas colónias em 3 ml de LB líquido contendo canamicina (final de 50 ug / ml) de O / N a incubação num agitador (250 rpm, 37 ° C). Extrair plasmídeos a partir da cultura. Use análise de PCR para rastrear as 10 colónias por alvo o fragmento HVR1-Kwas, como ilustrado no passo 1.1.4.1.
      2. Para rastrear os mesmos colónias por análise de PCR para o fragmento pIX do genoma espinha dorsal, misturar o iniciador directo (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), iniciador inverso (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) e uma única colónia BJ5183 em uma solução de mistura principal de PCR (de acordo com o protocolo do fabricante). Amostras executado em um termociclador, referindo-se o manual fornecido com a solução de mistura principal PCR.
      3. Designar as colônias de PCR duplo-positivas como pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    3. Transformar 100 ng do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 nopara células DH5a tal como ilustrado no passo 1.1.4.
      1. Use a análise PCR para rastrear ~ 10 colônias visando o fragmento HVR1-Kwas, conforme ilustrado na etapa 1.1.4.1.
      2. Use análise de PCR para rastrear os mesmos colónias por alvo o fragmento pIX do genoma de espinha dorsal, como ilustrado no passo 1.2.2.2.
      3. Use o primer forward (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para sequenciar o fragmento HVR1-Kwas em pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.

2. Preparação de modificação Ad5 Viral Vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6

  1. Constituem o meio completo por adição de FBS (final de 10%), 100X não-aminoácidos essenciais (final de 0,1 mM), 200 mM de L-glutamina (final 2 mM) e penicilina / estreptomicina solução (final de 1%) em DMEM com glucose elevada . Manter rim embrionário (HEK293) células humanas em meio completo numa incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificadas a 85%).
  2. Resgate de viral vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Semente de 3,0 x 10 6 de células HEK293 em um frasco T-25 contendo 5 ml de meio completo e a cultura O / N para obter uma monocamada com 80% de confluência.
    2. Linearizar 15 ug de pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His num volume de 100 ul com a enzima de restrição PacI (15 unidades) a 37 ° C durante 3 horas.
      1. Extrair linearizado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por centrifugação a reacção duas vezes (10.000 x g durante 1 min) com um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (rácio a 25: 24: 1) numa hotte , e por centrifugação sequencial (10.000 xg durante 10 min) com uma solução mista (300 ul de etanol a 100% e 10 ul de acetato de sódio) e 700 ul de etanol a 70%. Elimine o sobrenadante em cada etapa de centrifugação.
    3. Ressuspender o plasmídeo purificado em ~ 40 mL de água destilada ou de Tris-EDTA (TE) de tampão. Quantificar o ADN de plasmídeo por medição da óptica density (OD) a 260 nm.
    4. Transfectar 3 ug do plasmídeo linearizado com reagente de transfecção lipossómica comercial no frasco T-25, de acordo com o manual do fabricante. Alterar o meio de transfecção com meio completo a 6 horas após a transfecção e incubação subsequente na incubadora cultura. Manter as células transfectadas, substituindo meio completo a cada dois a três dias, até à formação de placas virais individuais.
    5. Ao desenvolver placas para efeito citopático total (ECP), raspar as células restantes fora do balão num hote estéril, e lisado celular colheita por centrifugação meio a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suspende-se o sedimento celular em ~ 1 ml de meio contendo 2% de FBS, e romper as células por congelamento-descongelamento de quatro vezes. Recolhe-se o sobrenadante contendo vírus resgatados após centrifugação lisado a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  3. Propagação em larga escala do vetor viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Propagar the vírus num frasco T-75 contendo células HEK293 na capa estéril através da infecção com 1/3 de lisado total do frasco T-25. Permitir CPE completo para desenvolver dentro de dois a três dias na incubadora cultura. Colher o sobrenadante ligado como indicado na etapa 2.2.5.
    2. Propagar o vírus em 1-3 frascos T-175 do capuz estéril através da infecção com 1/2 de lisado total do frasco T-75, de acordo com as condições de propagação do vírus. Permitir CPE completo para desenvolver dentro de dois a três dias na incubadora cultura. Colher o sobrenadante ligado como indicado na etapa 2.2.5.
    3. Propagar o vírus em uma dúzia ou mais frascos T-175 na capa estéril através da infecção com 1/2 de lisado total do frasco T-175 (s) anterior. Determinar a quantidade de utilização balão com base nas condições de propagação de vírus e a quantidade de vírus em necessidade. Colheita do sobrenadante lisado como indicado no passo 2.2.5 CPE completo quando ocorre dentro de dois a três dias no incubador de cultura.
  4. Purificação de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por cloreto de césio
    1. Prepare duas densidades de soluções de CsCl em HEPES 5 mM: 1,33 g / ml e 1,45 g / ml, evitando ao mesmo tempo o contacto com CsCl.
    2. Carga de 4 ml de CsCl (1,33 g / ml) em um tubo de ultracentrífuga estéril, e carregar suavemente 4 ml de CsCl (1,45 g / ml) contra o fundo do tubo. Carga de 4 ml de sobrenadante lisado lentamente na parte superior dos gradientes na hote estéril.
    3. Centrifuga-se o tubo a 110.000 xg durante 3 horas a 4 ° C para separar a banda de vírus maduro / inferior da banda de vírus defeituoso / superior. Recolha a banda inferior usando uma seringa de 3 ml munido com uma agulha G 33 e dilui-se a banda com HEPES a 5 mM a um volume de 4 ml na hote estéril.
    4. Carregar um outro tubo com duas densidades de soluções de CsCl e a banda de vírus diluído tal como descrito no passo 2.4.2. Centrifuga-se o tubo a 110.000 xg O / N a 4 ° C. Recolha a banda virai, tal como descrito no passo 2.4.3.
    5. Injectar a solução de vírus coletadas em um dialysé cassete por uma seringa de 3 ml armado com uma agulha G 33 no capô estéril.
    6. Coloque a gaveta em 700 ml de tampão de diálise 1x (1 L receita: 100 ml de 10x PBS, 100 ml de glicerol a 100% e 800 ml de água destilada; filtrar o tampão através de um filtro de 0,22 um) e substituir o tampão de diálise a cada 3 hrs por 4 vezes. Aspirar a solução de vírus dialisado usando uma seringa com agulha.

3. Validação do vetor viral salvei

  1. Viral Vector titulações
    1. Para a titulação do vírus físico, diluir tanto vírus e tampão de diálise (controlo de fundo) a 1: 10 e 1: 20 em tampão de lise do vírus (10% SDS em Tris-EDTA) em pequenos tubos, e incubar todos os tubos a 56 ° C durante 10 min.
    2. Ligue um BioPhotometer e definir o modo de absorção a OD 260 nm. Utilize o tampão de diálise diluído (1: 10) para equilibrar o sinal de fundo, clicando no fundo "em branco". Tipo "10 + 90" na scr BioPhotometereen, e ler o sinal de vírus diluído (1: 10).
    3. Leia o sinal de vírus diluído (1: 20), seguindo o método na etapa 3.1.2, mas em vez digite "5 + 95" na tela de BioPhotometer. Multiplicar os dois números de leitura por vírus 1,1x10 12 e calcular o título médio com uma unidade como VP / ml, com base nas duas títulos individuais das duas diluições.
    4. Para a titulação infecciosa do vírus (IP / ml), utilizar o Karber TCID estatística 50 14 método para determinar a profundidade a infecção em células HEK293 que aos 10 dias pós infecção (dpi)
  2. Avaliação do ecrã de exposição antigénica em que o vector viral
    1. Revestir o vector viral, em uma placa de ELISA e prosseguir com o restante das etapas de um método ELISA convencional 14. Use anti-gp41 (2F5) anticorpo humano monoclonal (mAb) e de ratinho anti-His Tag mAb para a detecção de antigénios correspondentes incorporados 14.
    2. Resolver o vector viral num denatueletroforese em gel de proteína vermelha (SDS-PAGE) e prosseguir com o restante das etapas em um método western blot-padrão 14. Use anti-gp41 (2F5) anticorpo humano monoclonal (mAb) e de ratinho anti-His Tag mAb para a detecção de antigénios correspondentes incorporados 14.
  3. Avaliação in vitro do vetor sobre a capacidade de ignorar soros Ad5-positve
    1. Manter as células HeLa em meio completo na incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO 2 sob condições humidificadas a 85%). Constituem o meio completo por adição de FBS (final de 10%), 200 mM de L-glutamina (final de 2 mM) e solução de penicilina / estreptomicina (final de 1%) em Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEME).
    2. Semente células HeLa em placas de 6 poços a 1x10 6 células / poço, e incubam-se as placas na incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificadas 85%) durante 2 horas. Incubar soros Ad5-positivo (0,1 l ou 0 ul) com 5 IP / célula de vetor viral (Ad5 ou Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His) na incubadora de cultura durante 1 h antes de se adicionar as misturas em placas de 6 poços contendo células.
    3. Ao fim de 24 horas após a infecção (hpi), lavar as células uma vez com PBS e as células lisam em 0,5 ml de tampão de lise. Centrifugar a 15.000 xg durante 5 minutos e recolher o sobrenadante. Misturar 20 uL do sobrenadante com 100 ul de substrato de luciferase para a leitura do sinal da luciferase, uma vez que os vírus contém o gene da luciferase.

4. Avaliação imunológica do vector viral salvados

  1. Prepare dois grupos de imunização: Ad5 e Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    1. Injetar camundongos (n = 8 / grupo) por via intramuscular com vírus em 1x10 10 VP / rato, em um "prime-boost" regime de imunização homóloga, com um intervalo de 2 semanas.
    2. Em 2 semanas após cada injecção, os ratos sangrar sem anestesia pelo rosto sangrando com lancetas animais (5 mm de comprimento ponta) paracoleta de sangue em tubos de 1,5 ml.
  2. Misturar o sangue nos tubos por inversão cima e para baixo, e incuba-se o sangue à temperatura ambiente durante 30 min. Girar os tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C e os soros de transferência (camada superior) para novos tubos de 1,5 ml.
    1. Girar os novos tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C e transferência para recém-soros marcados tubos de 1,5 ml para armazenamento a -80 ° C.
  3. Avaliação de imunidade humoral especifica para o antigénio por ELISA à base de soro
    1. Diluir Sua peptídeo (estoque em 1 mM) e HIV-1 peptídeo (estoque em 1 mM) separadamente em 100.
    2. tampão carbonato mM (pH 9,5) para atingir a concentração de revestimento de péptido em 10 ^ M. Revestir as placas de ELISA com os péptidos diluídos em separado pela adição de 100 ul por cavidade e incubando as placas de O / N a 4 ° C.
    3. Lavar as placas com PBST, quatro vezes em 200 ul / poço e bloqueio durante 1 hora em 5% de BSA em PBST. Aplicar soros de murganhos das placas a diluição 1: 100 no bloqueio de buffer, 100 ul / poço. Incubar durante 2 horas de incubação à temperatura ambiente.
    4. Lavar as placas com PBST, quatro vezes. Bloquear as placas por incubação à temperatura ambiente durante 30 min em tampão de bloqueio a 100 ul / poço.
    5. Aplique de cabra anti-IgG de ratinho-HRP (1: 5000 no tampão de bloqueio), a 100 ul / poço de ambas as placas revestidas com o seu peptídeo de HIV-1 e de péptidos individualmente. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar as placas com PBST.
    6. Ler as placas a DO450 nm após incubação com substrato de HRP durante 30 min.

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Resultados

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A estratégia de antigénio da cápside-Incorporação (Figura 1A), foi utilizada para gerar o vector viral Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Em primeiro lugar, o ônibus plasmídeo HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S foi construído por subclonagem HVR1-Kwas fragmento no plasmídeo anterior shuttle construído HVR5-His 6 / pH5S 17. Em segundo lugar, o plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 14 foi construído através da recombinação homóloga en...

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Discussão

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A aplicação da estratégia do transgene tradicional em Ad5 modificação para o desenvolvimento de vacinas tem sido diminuído, principalmente devido ao estrangulamento associada com o Ad5 de PEI 4,6. Este gargalo pode ser parcialmente diminuída pela aplicação da estratégia alternativa antígeno do capsídeo-Incorporation (Figura 1A), uma vez que esta estratégia pode fugir neutralização por Ad5 NAbs substituindo neutralizantes epítopos de Ad5 com antígenos-de-interesse, e facilitar a geração de imu...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01para divisão de células 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02para preparação de tampão de diálise
glicerolSIGMAG5516-1Lpara preparação de tampão de diálise
SDSBIO-RAD161-0301para preparação de tampão de lise de vírus
Soro Fetal Bovino (FBS)Thermo ScientificSH30910.03componente do meio de cultura
100x Aminoácidos Não Essenciais& nbsp;Thermo ScientificSH30238.01componente do meio de cultura
200 mM L-glutaminaCellgro25-005-CIcomponente do meio de cultura
solução de penicilina/estreptomicina Cellgro30-002-CIcomponente do meio de cultura
DMEM com alta glicoseThermo ScientificSH30081.01para cultura de células HEK293
Meio Essencial Mínimo EagleSIGMAM5650para cultura de células HeLa
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico SIGMAP3803-100MLpara grande tamanho de purificação de DNA
cloreto de césioFornecedor:Research Products International Corp.C68050para purificação de vírus
HEPESCellgro25-060-CIpara preparação de solução de CsCl
HEK293ATCC51-0036para resgate de vírus e
HeLaATCCCCL-2de luxo para ensaio de neutralização
Frasco T-25Thermo Scientific156367para cultura de células 
Frasco T-75CORNING430641para cultura de células 
Frasco T-175Thermo Scientific159910para cultura de células 
UltracentrífugaBECKMANNApara purificação de vírus
Tubo de ultracentrífugaBECKMAN344059para
 Thermo Scientific66380para diálise de vírus
Placa ELISAThermo Scientific442404para ELISA
humano anti-gp41 (2F5) mAbNIH AIDS Reagent Program1475para ensaios imunológicos
mouse anti-His tag mAbGenScriptA00186para ensaios imunológicos
SOC meioCORNING46-003-CRpara transformação
Solução de mistura mestre de PCRQIAGEN201445para PCR
Lanceta animal (comprimento do ponto em 5 mm)MEDIpointpara sangramento de camundongos 
BiofotômetroEppendorfpara titulação física de vírus
de diálise de purificação de vírus

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

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