Artigo de método

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 de maio de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.

Resumo

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O adenovírus serotipo 5 (Ad5) tem sido extensivamente modificado com métodos tradicionais de transgenes para o desenvolvimento de vacinas. As eficiências reduzidas destes vectores Ad5 tradicionalmente modificados em ensaios clínicos que se correlacionam principalmente com Ad5 imunidade pré-existente (PEI) entre a maioria da população. Para promover o desenvolvimento da vacina vetorizada-Ad5, resolvendo a preocupação de Ad5 PEI, tem sido utilizada a inovadora estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Por mérito desta estratégia, Ad5-vectored que primeiro construiu o shuttle hexon plasmídeo HVR1-Seus Kwas-HVR5-6 / pH5S por subclonagem da região hipervariável (HVR) 1 de hexon num plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S, que tinha Sua 6 tag incorporada no HVR5. Este fragmento de DNA contendo um epitopo HVR1 ELDKWAS HIV foi sintetizado. 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-se então linearizado e co-transformada com o plasmídeo linearizado pAd5 backbone / ΔH5 (GL),para recombinação homóloga. Este plasmídeo recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His foi transfectado em células para gerar o vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Este vector foi validado para ter aptidão qualitativa indicado pelo título viral física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) e correspondente rácio / IP VP. Tanto o epitopo HIV e Sua 6 tag foram sobre a cápside de Ad5 expostos à superfície, e manteve-epítopo específico antigenicidade da sua própria. Um ensaio de neutralização indicada a capacidade deste vector para contornar divalente de neutralização pelo soro de Ad5-positiva, in vitro. A imunização de camundongos demonstraram a geração de robusta imunidade humoral específica para o epitopo HIV e Sua 6. Este estudo de prova de princípio sugerido que o protocolo associado com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação poderia ser viável utilizado para a geração de vacinas de Ad5-vectored diferentes, modificando as proteínas da cápside. Este protocolo poderia até ser futros modificado para a geração de rara do serotipo vacinas em vector-adenovírus.

Introdução

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Adenovírus humano (Ad) é, um vírus de tamanho médio não encapsulado com uma nucleocápside icosaédrica que contém um genoma de ADN de cadeia dupla. Ad pertence à família Adenoviridae, com uma classificação em sete grupos (A a G). Cada grupo contém vírus de diferentes serótipos. Dos quais, adenovírus serotipo 5 (Ad5) do grupo C tem sido o mais extensamente estudado e o mais amplamente aplicado para abordagens vectored como terapia genética e vacinação.

A estratégia transgene tradicional tem sido desenvolvido e aplicado para modificações de Ad5, que se caracteriza por o deslocamento dos genes precoces do vírus com um gene de interesse, e a expressão do gene focado de interesse num hospedeiro. Exemplos são a construção de pENV9 / Ad5hrΔE3 por substituição do gene inicial 3 (E3) com o gene rev de Simian Vírus da Imunodeficiência 1, a construção de AdCMVGag através da substituição do gene precoce 1 (E1) com o gene gag de Imunodeficiência HumanaVirus (HIV) 2, e a construção de lac Z por Ad substituindo E1 com o gene lac Z 3. A ampla aplicação da estratégia tradicional transgene em Ad5 depende dos seguintes méritos: a ampla gama de hospedeiros para Ad5, a engenharia genética viável sobre o vírus e propagação de vírus, o grande alojamento de inserção de genes estranhos ea segurança de Ad5 4,5. No entanto, as eficiências reduzidas de terapias clínicas Ad5-vectored por utilização desta estratégia tem sido um importante ponto de estrangulamento, que tem sido mapeada para ser associado principalmente com Ad5 PEI, uma vez que o Ad5 é tão prevalente entre a maioria de crianças e adultos 4,6.

Para vencer o principal estrangulamento de Ad5, o objetivo principal é desenvolver uma estratégia alternativa contornar Ad5 PEI. A imunidade inata 7, a imunidade adaptativa, tais como anticorpos neutralizantes (NAbs) 8-10 e CD8 + T respostas de células 10 contra Ad5 têm sido mostrados para contribute ao Ad5 PEI, com Ad5 NAbs aparecendo para desempenhar o papel dominante nas contribuições para Ad5 PEI 10,11. Além disso, Ad5 NABS epítopos alvo situadas em proteínas do capsídeo, incluindo o principal hexon proteínas, fibras e base penton. Dos quais, hexon é o principal alvo de Ad5 NAbs 8,11-13. Com base nestes resultados, uma estratégia de incorporação de antigénio da cápside inovadora foi introduzida. Esta nova estratégia destaca a substituição ou incorporação de proteínas-de-juros sobre proteínas do capsídeo de Ad5, que desloca ou mascara os epítopos neutralizantes Ad5, levando à diminuição do reconhecimento pelo NAbs e eficientes administrações vetor Ad5. É de salientar que esta estratégia é competitivo, porque ele também pode ajudar anfitriões provocar imunidade humoral robusta e imunidade celular potente diretamente por apresentar antígenos de interesse para o sistema imunológico 4,14,15. Com base nesta estratégia, a clonagem molecular e salvamento recombinante Ad vetor viral pode ser estruturalmente divididaem quatro etapas principais: (a) a preparação de fragmento do gene de interesse por qualquer reação em cadeia da polimerase (PCR) ou síntese; (B) a ligação do fragmento do gene num plasmídeo de transporte que contém o fragmento do gene de interesse e os braços homólogas a uma espinha dorsal adenovírus; (C) a recombinação homóloga por co-transformação do plasmideo de transporte contendo o fragmento do gene de interesse com a espinha dorsal do plasmídeo linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) a transfecção de plasmídeo linearizado adenovírus recombinante para resgatar o vector Ad recombinante incorporado com antigénios-de-interesse.

O nosso grupo e alguns outros já estendeu essa estratégia alternativa incorporação anúncio para Ad desenvolvimento da vacina vetorizada contra diferentes agentes infecciosos. Nós relataram a geração de um vector Ad recombinantes Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 por incorporação de um marcada com His de HIV-1 de antigénio para a região V3 de Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Este vector gerado desencadeada strong resposta imunitária humoral específica para o epítopo V3 4. Também relatou o desenvolvimento de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 através da incorporação de HIV-1 de membrana região ectodom�io proximal (MPER) na localidade de HVR2 hexon5 2. Além disso, o grupo do Dr. Zhou utilizou os benefícios desta estratégia de incorporação de anúncios para desenvolver serotipo ad 3 (Ad3) vacinas vetoriais, isto é., A geração do vector viral R1SP70A3 por incorporação de um epitopo neutralizante de SP70 Enterovírus 71 na HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gerado NAbs fortes e produção de IFN-γ específicos para o epitopo SP70, que levam à alta taxa de protecção contra o desafio 15 71 Enterovírus.

Para efeitos de referência técnica, nosso estudo se aproveitou da estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação qualitativa para se concentrar na geração de um bivalente Ad5 vetor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, incorporando um antígeno HIV-1 em HVR1 umda sua tag em HVR5 de hexon5. O vector viral gerada foi também avaliada imunologicamente. A estratégia de antigénio da cápside-A incorporação pode ser utilizada para o desenvolvimento de abordagens de vacinação contra o Ad5-vectored doenças infecciosas diferentes.

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Protocolo

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A Universidade de Alabama em Birmingham Institucional Uso de Animais e Cuidados Comissão aprovou o uso de ratos como aqui descrito sob o número de protocolo aprovado 101.109.272.

1. Genético Construção de um plasmídeo modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 com a Estratégia Capsid-Incorporação Antigen

  1. Construção do plasmídeo de transporte 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-
    1. Peça um plasmídeo contendo a sequência de ADN sintetizada HVR1-Kwas entre a locais de enzimas de restrição Agel para Accl do gene hexon5.
    2. Digerir 6 ug do fragmento sintetizado (HVR1-Kwas) com as enzimas de AgeI (6 unidades) e Accl (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C. Resolver o fragmento digerido em um 2% de gel de agarose por electroforese, e purifica-se o fragmento com um kit de extracção de gel de ADN de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Com base na razão molar de inserto para vector a 3: 1, utilizar ligase de ADN T4 e ligase de bpode ser prejudicado para ligar 12 ng do fragmento (HVR1-Kwas) em 100 ng de um plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S 17 num volume de 10 ul à temperatura ambiente durante 2 horas, através dos locais de AgeI e Accl.
    4. Transformar 1 ul dos 10 ul do produto de ligação em 50 ul de células DH5a electrocompetentes num electroporador (a 1800 V). Adicionar 950 ul de meio SOC para as células DH5a transformadas e incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C, com 300 rpm. Espalhe 100-200 ul da mistura de 1 mL de ágar Luria-Bertani (LB) contendo canamicina e incubar O / N a 37 ° C.
      1. À tela ~ 10 colônias por PCR visando o fragmento HVR1-Kwas, misturar o iniciador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT), primário (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) e uma única colônia DH5ct reverter em uma solução de mistura principal PCR (de acordo com o protocolo do fabricante). Amostras em um termociclador executado por referindo-se ao manual fornecido com a solução de PCR mistura principal.
      2. Use o primer forward (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para sequenciar o fragmento HVR1-Kwas nos clones selecionados na seção 1.1.4.1.
  2. Construção do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His
    1. Digest 6 ug de HVR1-Kwas HVR5-His-6 / pH5S com as enzimas EcoRI (6 unidades) e PmeI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C, e purifica-se o fragmento contendo braços de recombinação homóloga e o gene modificado hexon5 dupla, tal como indicado no passo 1.1.2. Linearizar o plasmídeo backbone pAd5 / ΔH5 (GL) com 16 SwaI.
    2. A co-transformar a 100 ng do fragmento de alvo a partir do plasmídeo de transporte e 100 ng do esqueleto linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) em 50 ul de células BJ5183 electrocompetentes para a recombinação homóloga num electroporador (a 1800 V). Adicionar 950 ul de meio SOC para as células transformadas e incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C, 300 rpm. Espalhe 100-200 uL da mistura de 1 mLno agar LB contendo canamicina (Final 50 ug / ml) de O / N incubação a 37 ° C.
      1. Escolha ~ 10 pequenas colónias em 3 ml de LB líquido contendo canamicina (final de 50 ug / ml) de O / N a incubação num agitador (250 rpm, 37 ° C). Extrair plasmídeos a partir da cultura. Use análise de PCR para rastrear as 10 colónias por alvo o fragmento HVR1-Kwas, como ilustrado no passo 1.1.4.1.
      2. Para rastrear os mesmos colónias por análise de PCR para o fragmento pIX do genoma espinha dorsal, misturar o iniciador directo (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), iniciador inverso (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) e uma única colónia BJ5183 em uma solução de mistura principal de PCR (de acordo com o protocolo do fabricante). Amostras executado em um termociclador, referindo-se o manual fornecido com a solução de mistura principal PCR.
      3. Designar as colônias de PCR duplo-positivas como pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    3. Transformar 100 ng do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 nopara células DH5a tal como ilustrado no passo 1.1.4.
      1. Use a análise PCR para rastrear ~ 10 colônias visando o fragmento HVR1-Kwas, conforme ilustrado na etapa 1.1.4.1.
      2. Use análise de PCR para rastrear os mesmos colónias por alvo o fragmento pIX do genoma de espinha dorsal, como ilustrado no passo 1.2.2.2.
      3. Use o primer forward (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para sequenciar o fragmento HVR1-Kwas em pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.

2. Preparação de modificação Ad5 Viral Vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6

  1. Constituem o meio completo por adição de FBS (final de 10%), 100X não-aminoácidos essenciais (final de 0,1 mM), 200 mM de L-glutamina (final 2 mM) e penicilina / estreptomicina solução (final de 1%) em DMEM com glucose elevada . Manter rim embrionário (HEK293) células humanas em meio completo numa incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificadas a 85%).
  2. Resgate de viral vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Semente de 3,0 x 10 6 de células HEK293 em um frasco T-25 contendo 5 ml de meio completo e a cultura O / N para obter uma monocamada com 80% de confluência.
    2. Linearizar 15 ug de pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His num volume de 100 ul com a enzima de restrição PacI (15 unidades) a 37 ° C durante 3 horas.
      1. Extrair linearizado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por centrifugação a reacção duas vezes (10.000 x g durante 1 min) com um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (rácio a 25: 24: 1) numa hotte , e por centrifugação sequencial (10.000 xg durante 10 min) com uma solução mista (300 ul de etanol a 100% e 10 ul de acetato de sódio) e 700 ul de etanol a 70%. Elimine o sobrenadante em cada etapa de centrifugação.
    3. Ressuspender o plasmídeo purificado em ~ 40 mL de água destilada ou de Tris-EDTA (TE) de tampão. Quantificar o ADN de plasmídeo por medição da óptica density (OD) a 260 nm.
    4. Transfectar 3 ug do plasmídeo linearizado com reagente de transfecção lipossómica comercial no frasco T-25, de acordo com o manual do fabricante. Alterar o meio de transfecção com meio completo a 6 horas após a transfecção e incubação subsequente na incubadora cultura. Manter as células transfectadas, substituindo meio completo a cada dois a três dias, até à formação de placas virais individuais.
    5. Ao desenvolver placas para efeito citopático total (ECP), raspar as células restantes fora do balão num hote estéril, e lisado celular colheita por centrifugação meio a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suspende-se o sedimento celular em ~ 1 ml de meio contendo 2% de FBS, e romper as células por congelamento-descongelamento de quatro vezes. Recolhe-se o sobrenadante contendo vírus resgatados após centrifugação lisado a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  3. Propagação em larga escala do vetor viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Propagar the vírus num frasco T-75 contendo células HEK293 na capa estéril através da infecção com 1/3 de lisado total do frasco T-25. Permitir CPE completo para desenvolver dentro de dois a três dias na incubadora cultura. Colher o sobrenadante ligado como indicado na etapa 2.2.5.
    2. Propagar o vírus em 1-3 frascos T-175 do capuz estéril através da infecção com 1/2 de lisado total do frasco T-75, de acordo com as condições de propagação do vírus. Permitir CPE completo para desenvolver dentro de dois a três dias na incubadora cultura. Colher o sobrenadante ligado como indicado na etapa 2.2.5.
    3. Propagar o vírus em uma dúzia ou mais frascos T-175 na capa estéril através da infecção com 1/2 de lisado total do frasco T-175 (s) anterior. Determinar a quantidade de utilização balão com base nas condições de propagação de vírus e a quantidade de vírus em necessidade. Colheita do sobrenadante lisado como indicado no passo 2.2.5 CPE completo quando ocorre dentro de dois a três dias no incubador de cultura.
  4. Purificação de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por cloreto de césio
    1. Prepare duas densidades de soluções de CsCl em HEPES 5 mM: 1,33 g / ml e 1,45 g / ml, evitando ao mesmo tempo o contacto com CsCl.
    2. Carga de 4 ml de CsCl (1,33 g / ml) em um tubo de ultracentrífuga estéril, e carregar suavemente 4 ml de CsCl (1,45 g / ml) contra o fundo do tubo. Carga de 4 ml de sobrenadante lisado lentamente na parte superior dos gradientes na hote estéril.
    3. Centrifuga-se o tubo a 110.000 xg durante 3 horas a 4 ° C para separar a banda de vírus maduro / inferior da banda de vírus defeituoso / superior. Recolha a banda inferior usando uma seringa de 3 ml munido com uma agulha G 33 e dilui-se a banda com HEPES a 5 mM a um volume de 4 ml na hote estéril.
    4. Carregar um outro tubo com duas densidades de soluções de CsCl e a banda de vírus diluído tal como descrito no passo 2.4.2. Centrifuga-se o tubo a 110.000 xg O / N a 4 ° C. Recolha a banda virai, tal como descrito no passo 2.4.3.
    5. Injectar a solução de vírus coletadas em um dialysé cassete por uma seringa de 3 ml armado com uma agulha G 33 no capô estéril.
    6. Coloque a gaveta em 700 ml de tampão de diálise 1x (1 L receita: 100 ml de 10x PBS, 100 ml de glicerol a 100% e 800 ml de água destilada; filtrar o tampão através de um filtro de 0,22 um) e substituir o tampão de diálise a cada 3 hrs por 4 vezes. Aspirar a solução de vírus dialisado usando uma seringa com agulha.

3. Validação do vetor viral salvei

  1. Viral Vector titulações
    1. Para a titulação do vírus físico, diluir tanto vírus e tampão de diálise (controlo de fundo) a 1: 10 e 1: 20 em tampão de lise do vírus (10% SDS em Tris-EDTA) em pequenos tubos, e incubar todos os tubos a 56 ° C durante 10 min.
    2. Ligue um BioPhotometer e definir o modo de absorção a OD 260 nm. Utilize o tampão de diálise diluído (1: 10) para equilibrar o sinal de fundo, clicando no fundo "em branco". Tipo "10 + 90" na scr BioPhotometereen, e ler o sinal de vírus diluído (1: 10).
    3. Leia o sinal de vírus diluído (1: 20), seguindo o método na etapa 3.1.2, mas em vez digite "5 + 95" na tela de BioPhotometer. Multiplicar os dois números de leitura por vírus 1,1x10 12 e calcular o título médio com uma unidade como VP / ml, com base nas duas títulos individuais das duas diluições.
    4. Para a titulação infecciosa do vírus (IP / ml), utilizar o Karber TCID estatística 50 14 método para determinar a profundidade a infecção em células HEK293 que aos 10 dias pós infecção (dpi)
  2. Avaliação do ecrã de exposição antigénica em que o vector viral
    1. Revestir o vector viral, em uma placa de ELISA e prosseguir com o restante das etapas de um método ELISA convencional 14. Use anti-gp41 (2F5) anticorpo humano monoclonal (mAb) e de ratinho anti-His Tag mAb para a detecção de antigénios correspondentes incorporados 14.
    2. Resolver o vector viral num denatueletroforese em gel de proteína vermelha (SDS-PAGE) e prosseguir com o restante das etapas em um método western blot-padrão 14. Use anti-gp41 (2F5) anticorpo humano monoclonal (mAb) e de ratinho anti-His Tag mAb para a detecção de antigénios correspondentes incorporados 14.
  3. Avaliação in vitro do vetor sobre a capacidade de ignorar soros Ad5-positve
    1. Manter as células HeLa em meio completo na incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO 2 sob condições humidificadas a 85%). Constituem o meio completo por adição de FBS (final de 10%), 200 mM de L-glutamina (final de 2 mM) e solução de penicilina / estreptomicina (final de 1%) em Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEME).
    2. Semente células HeLa em placas de 6 poços a 1x10 6 células / poço, e incubam-se as placas na incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificadas 85%) durante 2 horas. Incubar soros Ad5-positivo (0,1 l ou 0 ul) com 5 IP / célula de vetor viral (Ad5 ou Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His) na incubadora de cultura durante 1 h antes de se adicionar as misturas em placas de 6 poços contendo células.
    3. Ao fim de 24 horas após a infecção (hpi), lavar as células uma vez com PBS e as células lisam em 0,5 ml de tampão de lise. Centrifugar a 15.000 xg durante 5 minutos e recolher o sobrenadante. Misturar 20 uL do sobrenadante com 100 ul de substrato de luciferase para a leitura do sinal da luciferase, uma vez que os vírus contém o gene da luciferase.

4. Avaliação imunológica do vector viral salvados

  1. Prepare dois grupos de imunização: Ad5 e Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    1. Injetar camundongos (n = 8 / grupo) por via intramuscular com vírus em 1x10 10 VP / rato, em um "prime-boost" regime de imunização homóloga, com um intervalo de 2 semanas.
    2. Em 2 semanas após cada injecção, os ratos sangrar sem anestesia pelo rosto sangrando com lancetas animais (5 mm de comprimento ponta) paracoleta de sangue em tubos de 1,5 ml.
  2. Misturar o sangue nos tubos por inversão cima e para baixo, e incuba-se o sangue à temperatura ambiente durante 30 min. Girar os tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C e os soros de transferência (camada superior) para novos tubos de 1,5 ml.
    1. Girar os novos tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C e transferência para recém-soros marcados tubos de 1,5 ml para armazenamento a -80 ° C.
  3. Avaliação de imunidade humoral especifica para o antigénio por ELISA à base de soro
    1. Diluir Sua peptídeo (estoque em 1 mM) e HIV-1 peptídeo (estoque em 1 mM) separadamente em 100.
    2. tampão carbonato mM (pH 9,5) para atingir a concentração de revestimento de péptido em 10 ^ M. Revestir as placas de ELISA com os péptidos diluídos em separado pela adição de 100 ul por cavidade e incubando as placas de O / N a 4 ° C.
    3. Lavar as placas com PBST, quatro vezes em 200 ul / poço e bloqueio durante 1 hora em 5% de BSA em PBST. Aplicar soros de murganhos das placas a diluição 1: 100 no bloqueio de buffer, 100 ul / poço. Incubar durante 2 horas de incubação à temperatura ambiente.
    4. Lavar as placas com PBST, quatro vezes. Bloquear as placas por incubação à temperatura ambiente durante 30 min em tampão de bloqueio a 100 ul / poço.
    5. Aplique de cabra anti-IgG de ratinho-HRP (1: 5000 no tampão de bloqueio), a 100 ul / poço de ambas as placas revestidas com o seu peptídeo de HIV-1 e de péptidos individualmente. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar as placas com PBST.
    6. Ler as placas a DO450 nm após incubação com substrato de HRP durante 30 min.

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Resultados

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A estratégia de antigénio da cápside-Incorporação (Figura 1A), foi utilizada para gerar o vector viral Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Em primeiro lugar, o ônibus plasmídeo HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S foi construído por subclonagem HVR1-Kwas fragmento no plasmídeo anterior shuttle construído HVR5-His 6 / pH5S 17. Em segundo lugar, o plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 14 foi construído através da recombinação homóloga en...

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Discussão

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A aplicação da estratégia do transgene tradicional em Ad5 modificação para o desenvolvimento de vacinas tem sido diminuído, principalmente devido ao estrangulamento associada com o Ad5 de PEI 4,6. Este gargalo pode ser parcialmente diminuída pela aplicação da estratégia alternativa antígeno do capsídeo-Incorporation (Figura 1A), uma vez que esta estratégia pode fugir neutralização por Ad5 NAbs substituindo neutralizantes epítopos de Ad5 com antígenos-de-interesse, e facilitar a geração de imu...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01para divisão de células 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02para preparação de tampão de diálise
glicerolSIGMAG5516-1Lpara preparação de tampão de diálise
SDSBIO-RAD161-0301para preparação de tampão de lise de vírus
Soro Fetal Bovino (FBS)Thermo ScientificSH30910.03componente do meio de cultura
100x Aminoácidos Não Essenciais& nbsp;Thermo ScientificSH30238.01componente do meio de cultura
200 mM L-glutaminaCellgro25-005-CIcomponente do meio de cultura
solução de penicilina/estreptomicina Cellgro30-002-CIcomponente do meio de cultura
DMEM com alta glicoseThermo ScientificSH30081.01para cultura de células HEK293
Meio Essencial Mínimo EagleSIGMAM5650para cultura de células HeLa
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico SIGMAP3803-100MLpara grande tamanho de purificação de DNA
cloreto de césioFornecedor:Research Products International Corp.C68050para purificação de vírus
HEPESCellgro25-060-CIpara preparação de solução de CsCl
HEK293ATCC51-0036para resgate de vírus e
HeLaATCCCCL-2de luxo para ensaio de neutralização
Frasco T-25Thermo Scientific156367para cultura de células 
Frasco T-75CORNING430641para cultura de células 
Frasco T-175Thermo Scientific159910para cultura de células 
UltracentrífugaBECKMANNApara purificação de vírus
Tubo de ultracentrífugaBECKMAN344059para
 Thermo Scientific66380para diálise de vírus
Placa ELISAThermo Scientific442404para ELISA
humano anti-gp41 (2F5) mAbNIH AIDS Reagent Program1475para ensaios imunológicos
mouse anti-His tag mAbGenScriptA00186para ensaios imunológicos
SOC meioCORNING46-003-CRpara transformação
Solução de mistura mestre de PCRQIAGEN201445para PCR
Lanceta animal (comprimento do ponto em 5 mm)MEDIpointpara sangramento de camundongos 
BiofotômetroEppendorfpara titulação física de vírus
de diálise de purificação de vírus

Referências

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